Estudo da Dinâmica da Proteína via Espectroscopia de Eco de Neutron Spin

Resumo

O presente protocolo descreve métodos para investigar a estrutura e a dinâmica de duas proteínas modelo que têm um papel importante na saúde humana. A técnica combina caracterização biofísica de bancada com espectroscopia de eco de giro de nêutrons para acessar a dinâmica em escalas de tempo e comprimento relevantes para movimentos interdomínios proteicos.

Resumo

A atividade e funcionalidade da maioria das proteínas do corpo humano estão relacionadas a mudanças configurais de subdomínios inteiros dentro da estrutura cristalina proteica. As estruturas cristalinas constroem a base para qualquer cálculo que descreva a estrutura ou dinâmica de uma proteína, na maioria das vezes com fortes restrições geométricas. No entanto, essas restrições da estrutura cristalina não estão presentes na solução. A estrutura das proteínas na solução pode diferir do cristal devido a rearranjos de laços ou subdomínios no pico para escala de tempo nanossegundo (ou seja, o regime de tempo da dinâmica proteica interna). O presente trabalho descreve como as câmeras lentas em escalas de tempo de várias dezenas de nanossegundos podem ser acessadas usando dispersão de nêutrons. Em particular, a caracterização dinâmica de duas grandes proteínas humanas, uma proteína intrinsecamente desordenada que carece de uma estrutura secundária bem definida e uma proteína de anticorpos clássicos, é abordada pela espectroscopia de eco de spin de nêutrons (NSE) combinada com uma ampla gama de métodos de caracterização laboratorial. Mais insights sobre a dinâmica do domínio proteico foram obtidos usando modelagem matemática para descrever os dados experimentais de nêutrons e determinar o cruzamento entre movimentos difusivos combinados e proteicos internos. A extração da contribuição dinâmica interna para a função de dispersão intermediária obtida da NSE, incluindo a escala de tempo dos diversos movimentos, permite maior visão nas propriedades mecânicas de proteínas únicas e na maciez das proteínas em seu ambiente quase natural na solução de proteínas lotadas.

Introdução

Dinâmica de sondagem de matéria macia com nêutrons
Investigar as propriedades dinâmicas de proteínas e peptídeos é uma parte importante da pesquisa biofísica, e muitos métodos bem desenvolvidos existem hoje para acessar uma ampla gama de paisagens energéticas¹. Relacionar a dinâmica experimentalmente revelada das proteínas à sua função biológica é uma tarefa muito mais difícil, exigindo modelos matemáticos complexos e simulações dinâmicas auxiliadas por computador. A importância da espectroscopia de nêutrons para a análise de movimentos proteicos tem sido enfatizada em diversos estudos bem recebidos e amplamente reconhecidos....

Protocolo

O presente trabalho caracteriza duas proteínas: uma proteína de anticorpos humanos regular IgG, e a MBP intrinsecamente desordenada. A forma liofilizada das proteínas foi obtida a partir de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação da amostra de proteína

1. Prepare um fosfato de sódio de 50 mM + tampão de NaCl de 0,1 M, pesando e dissolvendo os respectivos reagentes sólidos em água pesada (D₂O) (ver Tabela de Materiais). Este é o solvente tampão deuterado para IgG.
   1. Ajuste o pH da solução tampão para 6.6.
2. Prepare um fosfato de....

Resultados

A proteína IgG do soro humano e das proteínas MBP bovinas foram reconstituídas em altas concentrações (~50 mg/mL) em buffers d₂base O. Como as proteínas foram dissolvidas em altas concentrações, as soluções obtidas foram soluções de proteínas lotadas. A dinâmica investigada utilizando NSE sofre do ambiente lotado em que as proteínas residem (interações de fatores estruturais e efeitos hidrodinâmicos)^5,28,39. O DLS foi.......

Discussão

A espectroscopia NSE oferece uma visão única e detalhada da dinâmica das proteínas, que outras técnicas espectroscópicas não podem produzir. Medições em uma escala de tempo estendida fornecem observações da difusão translacional e rotacional das proteínas, conforme apresentado aqui. A dinâmica segmentar e outras oscilações internas revelam-se como uma forte decadência da função de dispersão coerente S(Q, t) em uma escala de tempo curto e estão bem separados dos processos gerais de relaxamento difusivo. As princi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de proteína bovina MBP	Sigma-Aldrich	M1891	pó liofilizado reconstituído em  D2O
D2O - água pesada	Sigma-Aldrich	Produto nº 151882	líquido
Água dionizada	em casa	-	para lavagem / limpeza de células
Instrumento DLS	Zetasizer Nano ZS, FZ-Jü	instrumento de espalhamento de luz	lich-dynamic
Padrões de espalhamento elástico	SNS-NSE, ORNL-Al		2O3  e pós de grafite
Etanol	Sigma-Aldrich	65350-M	etanol 70% para limpeza de células
Solução de proteína IgG	Sigma-Aldrich	I4506	reconstituído em  D2O
KWS-2 instrumento	JCNS outstation na MLZ,  Garching,	Alemanha-instrumento de	nêutrons de pequeno ângulo
Liquinox detergente para louça	Alconox-Limpador		de vidraria de laboratório líquido sem fosfato
Na2HPO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	Produto No.S9390	fosfato dissódico heptahidratado sal
NaCl	Produto Sigma-Aldrich	No.S9888	sal de cloreto de sódio
NaH2PO4· H2O	Sigma-Aldrich	Produto No. S9638	fosfato monossódico sal monohidratado
Espectrofotômetro	Nanodrop Thermo Scientific	Número do catálogo:  ND-2000	NanoDrop 2000/2000c Espectrofotômetro
Câmera de alinhamento de nêutrons	NeutronOptics, Grenoble	NOG210222	Câmera de 100 x 100 mm com sensor CMOS Sony IMX249
Parafilm M - parafilme de cera	Bemis	Parafilm M - 5259-04LC PM996	filme de laboratório multiuso em dispensador de papelão
Espectrômetro Phoenix-J-NSE	Estação remota JCNS no MLZ,  Garching,	Alemanha-espectrómetro de neutrões
SasView	https://www.sasview.org/
SAXSpace, Anton Paar instrument	FZ-Jü Membranas	de raio-x de	ângulo
	Thermo Scientific	88400-88405	Slide-A-Lyzer mini dispositivos de diálise tubos de 3,5 K MWCO
SNS Análise Remota Cluster	Remota de Ciência de Nêutrons (sns.gov https://analysis.sns.gov
Espectrômetro SNS-NSE	ORNL, Oak Ridge, TN, EUA-espectrômetro
de nêutronsFiltros de seringa estéreis	VWR	N.A. PN:28145-501	0.2 µ m filtros de tamanho de poro
Sistema de Forçar a Temperatura (TFS)	SP Scientific	Número da peça 100004055	equipamento de ambiente de amostra
Ureia -d4	Sigma-Aldrich	Produto No. 176087	sal de ureia deuterado
Viscosímetro	FZ-Jü	viscosímetro de bola caindo	de

Pó liofilizado de diálise Slide-A-Lyzer de instrumento pequeno Análise lich