Artigo de método

Produção Livre de Células de Proteolipossomas para Análise Funcional e Desenvolvimento de Anticorpos Visando Proteínas de Membrana

DOI:

10.3791/61871

⸱

22 de setembro de 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um método eficiente livre de células para a produção de proteolipossomo de alta qualidade pelo método de diálise de duas camadas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. Este método fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As proteínas de membrana desempenham papéis essenciais em uma variedade de processos celulares e desempenham funções vitais. As proteínas de membrana são clinicamente importantes na descoberta de medicamentos porque são os alvos de mais da metade de todos os medicamentos. Um obstáculo para a realização de estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana, bem como o desenvolvimento de anticorpos, tem sido a dificuldade em produzir grandes quantidades de proteína de membrana de alta qualidade com conformação e atividade corretas. Aqui descrevemos um "método de diálise de bicamadas" usando um sistema livre de células germinativas de trigo, lipossomas e copos de diálise para sintetizar eficientemente proteínas de membrana e preparar proteolipossomos purificados em um curto espaço de tempo com uma alta taxa de sucesso. As proteínas de membrana podem ser produzidas tanto quanto em vários miligramas, como GPCRs, canais iônicos, transportadores e tetraspaninas. Este método livre de células contribui para reduzir o tempo, o custo e o esforço para a preparação de proteolipossomas de alta qualidade e fornece meios adequados para a análise funcional de proteínas de membrana, triagem de alvos de drogas e desenvolvimento de anticorpos.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As proteínas de membrana são um dos alvos mais importantes da droga no diagnóstico e terapêutica. De fato, metade dos pequenos alvos de drogas compostas são proteínas de membrana, como receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e canais iônicos1. Ao longo dos anos, pesquisadores vêm trabalhando em estudos bioquímicos, biofísicos e estruturais de proteínas de membrana para elucidar sua estrutura e função 2,3. O desenvolvimento de anticorpos monoclonais contra proteínas de membrana também é realizado ativamente, a fim de acelerar estudos funcionais e estruturais e desenvolver aplicações terapêuticas e diagnósticas 4,5,6,7,8,9. Todos esses estudos requerem uma grande quantidade de proteínas de membrana de alta qualidade10. Por exemplo, vários miligramas de proteínas de membrana purificadas com conformação natural são necessários para o desenvolvimento de anticorpos. Uma quantidade muito maior de proteínas de membrana altamente purificadas é necessária para a cristalografia de raios-X. No entanto, a produção em massa de proteínas de membrana continua sendo um gargalo na pesquisa de proteínas de membrana11. As proteínas de membrana têm estruturas complicadas com uma ou mais hélices transmembranares e desempenham papéis importantes na homeostase celular. A superexpressão heteróloga de proteínas de membrana leva a múltiplos obstáculos, como a agregação de proteínas de membrana que se acumulam em altas concentrações locais ou a perturbação das vias de sinal celular. Mesmo que a expressão seja bem-sucedida, as etapas subsequentes de preparação da amostra também enfrentam dificuldades. Por exemplo, o preparo do proteolipossomo requer habilidades de alto nível e experiências profissionais em solubilização, purificação e estabilização de proteínas de membrana, e também custa muito esforço e tempo12,13.

Por outro lado, algumas tecnologias avançadas têm surgido nas últimas décadas para produzir proteínas sem o uso de células vivas 14,15,16,17,18. A tecnologia de síntese proteica livre de células reconstitui a reação de tradução em um tubo de ensaio. Como não há limitações que o sistema de expressão celular tenha, os sistemas livres de células têm potencial para sintetizar uma variedade de proteínas que são difíceis de expressar ou mostrar toxicidade nas células. O extrato de células purificadas ou a maquinaria translacional reconstituída é misturado com mRNAs modelo, aminoácidos e fontes de energia, e as proteínas recombinantes são sintetizadas em um curto espaço de tempo. Em relação à síntese proteica da membrana, alguns tipos de andaimes compostos por lipídios ou anfífilos, como lipossomas, biceles, nanodiscos ou copolímeros são adicionados à reação livre de células 19,20,21,22,23,24. As proteínas de membrana sintetizadas interagem com os andaimes e podem ser estabilizadas em água. Proteínas de membrana sintetizadas livres de células são amplamente utilizadas em estudos funcionais e na produção de anticorpos 25,26,27,28,29,30,31.

Neste protocolo, descrevemos um método eficiente livre de células de produção de proteolipossomas usando sistema livre de células de trigo e lipossomas. O sistema de síntese proteica livre de células de trigo é um poderoso sistema de tradução in vitro que utiliza extrato de gérmen de trigo 15,32,33. O gérmen de trigo contém uma grande quantidade de máquinas de tradução e poucos inibidores de tradução. O maquinário translacional no trigo, um membro dos eucariotos, é adequado para traduzir proteínas eucarióticas, e sua eficiência de tradução dificilmente é afetada pelo uso do códon do mRNA modelo. Usando o sistema livre de células de trigo, sintetizamos uma variedade de proteínas, incluindo proteínas quinases 34,35, ubiquitina ligases36, fatores de transcrição37 e proteínas de membrana com altas taxas de sucesso. Para a produção de proteína de membrana, adicionamos lipossomo lipídico vesícula na mistura de tradução como andaime19,38. Os domínios hidrofóbicos da proteína de membrana interagem com a bicamada lipídica e são espontaneamente integrados com o lipossoma. A centrifugação por gradiente de densidade é usada para separar estritamente o proteolifossomo das proteínas endógenas do trigo, embora uma centrifugação comum da mistura de reação de translação seja suficiente para uma simples purificação do proteolipossomo20. Muitos tipos de proteínas de membrana integral têm sido sintetizados utilizando o sistema livre de células de trigo e aplicados para várias pesquisas e desenvolvimentos 25,38,39,40,41,42,43,44. Além disso, desenvolvemos o "método bicamada-diálise" para produção em larga escala45,46. Neste método, o dispositivo de diálise do tipo copo é imerso no tampão de alimentação do substrato, e duas camadas de mistura de reação de translação e tampão de alimentação do substrato são formadas no copo, como mostra a Figura 1. O fornecimento contínuo de substratos e a remoção do subproduto podem ser conduzidos de forma eficiente tanto na parte superior quanto na parte inferior da mistura reacional por um longo tempo, o que leva a uma excelente eficácia de tradução (Figura 2A e Figura 2B)45.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação do plasmídeo de expressão pEU

NOTA: o plasmídeo de expressão pEU deve incluir o códon inicial, o quadro de leitura aberto da proteína de membrana alvo e o códon de paragem no fragmento (ver Figura 1). Adicione sequência(s) de etiqueta(s) de detecção/purificação na posição apropriada, quando necessário. A digestão enzimática de restrição ou a clonagem sem costura são aplicáveis à subclonagem. Aqui descrevemos um protocolo usando um método de clonagem contínuo.

  1. Prepare inserir fragmento de DNA.
    1. Amplificar o gene de interesse por PCR usando o modelo de cDNA, primer 1 e primer 2. O primer 1 e o primer 2 contêm sobreposições de 15 pb para clonagem sem costura, respectivamente (consulte a Tabela de Materiais).
      NOTA: Não inclua sequências a serem processadas e removidas da proteína madura nas células (por exemplo, sequência de sinal). O processamento da proteína sintetizada não é realizado em sistema livre de células de trigo. Não adicione a sequência Kozak. O vetor pEU-E01-MCS tem o potenciador de tradução E01.
    2. Adicione 1/25 de volume da enzima de restrição DpnI ao produto de PCR para remover o DNA plasmídico modelo. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Use um kit de purificação de PCR para purificar o produto de PCR e ajustar a concentração em 20-50 ng/μL.
  2. Linearizar o vetor pEU-E01-MCS.
    1. Conduza PCR inversa usando pEU-E01-MCS, primer 3 e primer 4.
    2. Adicionar 1/25 volume da enzima de restrição DpnI ao produto de PCR inverso. Incubar durante 30 min a 37 °C.
    3. Use um kit de purificação de PCR para purificar o produto de PCR de acordo com a recomendação do fabricante. Ajustar a concentração a 20–50 ng/μL.
  3. Misture 2 μL de fragmento de DNA inserido, 2 μL de vetor linearizado e 4 μL de 2x mistura de enzimas de clonagem sem costura.
  4. Transforme a cepa JM109 de Escherichia coli com o produto de clonagem sem costura. Usando um espalhador, espalhe a suspensão bacteriana em uma placa de ágar LB-ampicilina.
    NOTA: o vetor pEU tem um marcador de resistência à ampicilina.
  5. Confirmar a sequência do plasmídeo de expressão construído utilizando o primer 5 e o primer 6 do lado 5' e 3' do MCS no plasmídeo pEU, respetivamente.
  6. Amplificar e purificar os plasmídeos de expressão.
    1. Cultivar a cepa de E. coli transformada em plasmídeo JM109 em 150 mL de meio LB-ampicilina a 37 °C e 125 braçadas por minuto agitando durante a noite.
    2. Extraia e purifique os plasmídeos usando o kit midi de preparação de plasmídeos comercialmente disponível. Dissolva plasmídeos em 500 μL de tampão TE.
      CUIDADO: Não use um mini kit de preparação para extração de plasmídeos. Não fornece qualidade e quantidade suficientes de plasmídeo.
    3. Adicionar 500 μL de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Misture vigorosamente por 5 min e centrifugar por 5 min a 17.800 x g e temperatura ambiente. Transfira a solução plasmídica superior para um novo tubo.
      CUIDADO: Use luvas descartáveis para proteger a pele do fenol e clorofórmio.
      NOTA: Para remover a contaminação da RNase do kit de extração de plasmídeos, purifice os plasmídeos usando a purificação fenol-clorofórmio.
    4. Adicione 500 μL de clorofórmio para remover completamente o fenol. Misture vigorosamente por 5 min e centrifugar por 5 min a 17.800 x g e temperatura ambiente. Transfira a solução plasmídica superior para um novo tubo.
    5. Adicionar 2,5 volume de etanol e 1/8 volume de acetato de amónio 7,5 M e conservar a -30 °C durante 1 h.
    6. Centrífuga a 17.800 x g a 4 °C durante 10 min. Lave o pellet com 500 μL de etanol a 70%. Retire o sobrenadante com cuidado e deixe o pellet por 5 minutos para secar.
    7. Dissolva completamente os plasmídeos de expressão em 100 μL de água ultrapura. Medir a concentração de plasmídeos com absorbância a 260 nm. Ajustar a concentração para 1 mg/ml.

2. Transcrição in vitro

CUIDADO: Use tubos e pontas de plástico sem DNase e nuclease nas etapas de transcrição e tradução. Evite autoclavar produtos de plástico para evitar a contaminação.

  1. Colha água ultrapura em um novo tubo de plástico.
    CUIDADO: Não use água tratada com DEPC porque o DEPC residual inibe fortemente a reação. Use água ultrapura recém-purificada para transcrição e tradução.
  2. Preparar a mistura de reação de transcrição misturando 115,2 μL de água ultrapura, 40 μL de tampão de transcrição LM, 20 μL de mistura NTP, 2,4 μL de 80 U/μL inibidor de RNase, 2,4 μL de 80 U/μL SP6 polimerase e 20 μL de plasmídeos de expressão pEU de 1 mg/mL. Misture os reagentes suavemente invertendo. Execute uma volta rápida.
  3. Incubar a reação de transcrição a 37 °C por 6 h.
  4. Misture a reação suavemente invertendo e gire rapidamente para baixo. Use-o imediatamente para tradução, caso contrário, congele e armazene a -80 °C.
  5. Confirme o produto de transcrição por eletroforese.
    1. Misture 100 mL de 1x tampão TAE e 1 g de agarose. Aqueça a suspensão em um forno de micro-ondas para preparar 1% de gel TAE de agarose.
    2. Tome 1 μL de reação de transcrição e misture com 3 μL de água e 4 μL de corante de carga 2x.
      NOTA: A desnaturação do RNA não é necessária.
    3. Carregar 4 μL da mistura e 2 μL do marcador de escada de ADN ao gel TAE de agarose.
    4. Eletroforese a 100 V por 20 min.
    5. Colorir o gel em brometo de etídio por 30 min. Verifique o padrão de banda de escada do mRNA usando transiluminador UV e imageador de gel.
      NOTA: Quando se observa uma banda manchada inferior a 500 pb, suspeita-se de degradação do ARNm.

3. Preparação de materiais para tradução

  1. Prepare o buffer de tradução.
    1. Misture 27 mL de água ultrapura preparada na hora e 0,75 mL de cada solução-estoque de 40x para S1, S2, S3 e S4, respectivamente, em um tubo de 50 mL.
      NOTA: Modular as quantidades de materiais de acordo com a quantidade final necessária de 1x buffer de tradução.
      CUIDADO: Não armazene ou congele novamente o buffer de tradução excedente de 1x após o uso.
  2. Preparar a solução-mãe de creatina quinase. Dissolver creatina quinase liofilizada em água ultrapura até uma concentração final de 20 mg/mL. Dispensar a solução em pequenas quantidades (10 a 50 μL cada) em tubos de PCR de 8 tiras de 0,2 ml. Congelar os tubos em azoto líquido e conservar a -80 °C.
    CUIDADO: Não volte a congelar a solução de creatina quinase após o descongelamento.
  3. Lave os copos de diálise (tamanho de 0,1 mL) para remover o glicerol da membrana de diálise.
    NOTA: Existem vários copos de diálise de tamanhos diferentes. Copos de pequeno porte (0,1 mL) são usados para teste em pequena escala (seção 5.4) e copos de grande porte (2 mL) para produção em larga escala (seção 5.5), respectivamente. A etapa de lavagem da membrana de diálise de copos de grande porte é evitável.
    1. Coloque 1 mL de água ultrapura em um novo tubo de 1,5 mL. Insira o copo de diálise de pequeno porte (0,1 mL) no tubo. Adicione 0,5 mL de água ultrapura ao copo.
    2. Incubar por mais de 30 min à temperatura ambiente.

4. Preparação de lipossomas

NOTA: Aqui descrevemos dois protocolos para a preparação de lipossomas. Um utiliza lipossomas liofilizados prontos a utilizar (secção 4.1), enquanto o outro produz lipossomas hidratando uma película lipídica fina (secção 4.2).

  1. Prepare lipossomas usando lipossomas liofilizados.
    NOTA: Uma maneira mais fácil de produzir proteolipossomo é usar lipossomo de Asolectin comercialmente disponível. A asolectina é um tipo de lipídio natural extraído da soja.
    1. Abra o frasco para injetáveis contendo 10 mg de lipossomas de Asolectina liofilizada (ver Tabela de Materiais) e adicione 200 μL de tampão de tradução (secção 3.1) ao fundo do frasco para injetáveis. Selar o frasco para injetáveis e incubar durante 10 minutos.
    2. Misture vigorosamente colocando o frasco para injetáveis no misturador de vórtices durante 1 min.
    3. Insira o frasco para injetáveis num tubo de 50 ml. Gire o tubo por centrifugação a 500 x g por 1 min.
    4. Usando uma pipeta, transfira a suspensão de lipossomas de Asolectina (50 mg de lipídios/mL) para um novo tubo de 1,5 mL. Use lipossomo imediatamente para tradução, caso contrário, congele em nitrogênio líquido e armazene a -80 °C.
  2. Prepare lipossomas hidratando um filme lipídico fino.
    1. Se um lipídio for vendido em forma de pó, dissolver em clorofórmio ou solvente orgânico apropriado para a concentração de 10-100 mg / mL.
      NOTA: Um filme lipídico fino pode ser preparado usando lipídios anfifílicos purificados e/ou sintetizados. O método de purificação da asolectina é descrito anteriormente38. Lipídios funcionalmente modificados, como lipídios biotinilados, lipídios fluorescentes e lipídios adjuvantes, podem ser adicionados aos lipídios basais para produzir lipossomas funcionais.
    2. Transferir a solução lipídica contendo 50 mg de lípidos(s) para um balão de evaporação.
    3. Usando um evaporador rotativo, evapore o solvente e espalhe uniformemente o lipídio na parede do fundo do frasco para formar uma fina película de lipídios.
    4. Colocar o balão num exsicador a vácuo e deixar sob pressão negativa durante a noite para remover completamente o solvente.
    5. Adicionar 1 ml de tampão de translação ao balão de evaporação. Girar o balão para espalhar o tampão sobre a película lipídica fina. Incubar por 5 min para hidratar o filme.
    6. Sonicate o balão com um homogeneizador ultra-sônico ou limpador ultra-sônico. Altere ocasionalmente o ângulo do balão para permitir que a solução toque bem o filme. Certifique-se de que o filme lipídico fino seja descascado do fundo e emulsionado completa e homogeneamente.
      NOTA: A micrografia eletrônica de lipídios biotinilados contendo lipossomas é mostrada na Figura 1.
    7. Transfira a suspensão de lipossomas (50 mg de lípidos/ml) para um novo tubo de 1,5 ml. Se não for para ser usado imediatamente, congelar os lipossomas em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C.

5. Tradução in vitro

  1. Descongele o extrato de gérmen de trigo rapidamente, flutuando os tubos na água à temperatura ambiente por alguns minutos. Após o descongelamento, misture imediatamente suavemente invertendo os tubos, gire para baixo e esfrie no gelo até o uso.
    NOTA: Congelar o extracto de gérmen de trigo em azoto líquido após a utilização e conservar a -80 °C. Suporta vários ciclos de congelamento/descongelamento.
  2. Descongelar 20 mg/ml de solução de creatina quinase. Misture 5 μL de solução-mãe e 45 μL de tampão de tradução para preparar 2 mg/mL de solução de trabalho de creatina quinase.
    CUIDADO: O recongelamento da creatina quinase não é recomendado.
  3. Descongele lipossomas ou mRNAs quando necessário.
  4. Realize uma tradução de proteínas em pequena escala.
    1. Retirar a água do tubo e do copo de diálise (0,1 ml), tal como preparado no passo 3.3.2.
    2. Injete 1 mL e 300 μL de tampão de tradução no tubo e no copo de diálise, respectivamente.
      CUIDADO: Caso o fundo do copo de diálise não atinja a superfície do tampão de translação no tubo de 1,5 mL, injete 50 a 100 μL adicionais de tampão no tubo.
    3. Preparar a mistura de reação de tradução misturando 15,6 μL de tampão de tradução, 2,4 μL de 2 mg/mL de creatina quinase, 12 μL de 50 mg/mL de lipossomas, 15 μL de extrato de gérmen de trigo e 15 μL de mRNA. Misture suavemente invertendo os tubos e gire para baixo.
    4. Aspirar 60 μL da mistura de reacção de translação utilizando uma pipeta de 200 μL.
    5. Insira a ponta da pipeta na superfície inferior do tampão de tradução no copo de diálise. Pipetar a mistura de reação lenta e suavemente. Cubra o copo de diálise com uma tampa para evitar a evaporação.
      NOTA: A mistura de reação afunda naturalmente no fundo do copo e forma uma bicamada. Não perturbe a bicamada misturando ou agitando o copo.
  5. Realizar uma tradução em larga escala (Figura 1).
    1. Despeje 22 mL de tampão de tradução em um tubo de 25 mL. Insira um copo de diálise de grande porte (2 mL) no tubo e adicione 2 mL de tampão de tradução no copo.
    2. Prepare uma mistura de reação de tradução misturando 130 μL de tampão de tradução, 20 μL de 2 mg/mL de creatina quinase, 100 μL de 50 mg/mL de lipossoma, 125 μL de extrato de gérmen de trigo e 125 μL de mRNA. Misture suavemente por pipetagem.
    3. Aspirar toda a mistura de reação de translação (500 μL) usando uma pipeta de 1.000 μL. Injectar a mistura de reacção de tradução no copo de diálise da mesma forma descrita no passo 5.4.5. Cubra o copo de diálise com uma tampa para evitar a evaporação.
  6. Incubar as reacções a 15 °C durante 24 h.
  7. Misture bem a reação no copo de diálise por pipetagem. Transfira a suspensão bruta de proteolipossoma para um novo tubo.
    NOTA: Recomenda-se um tubo de fundo plano de 1,5 mL para coletar o proteoliposoma da tradução em pequena escala. Após a centrifugação, os lipossomas formam pellets compactos e facilmente visíveis no canto inferior do tubo.

6. Purificação de proteolipossomas

  1. Centrifugar o tubo que contém suspensão bruta de proteolipossoma a 17.800 x g a 4 °C durante 10 minutos.
  2. Remova o sobrenadante. Suspender o pellet de proteolipossomo em PBS (pequena escala: 1 mL, grande escala: 10 mL) por pipetagem.
  3. Repita a centrifugação e lavagem de proteolipossomas para mais dois círculos.
  4. Após a lavagem, adicione uma pequena quantidade de PBS e ressuspenda bem o pellet de proteolipossomo por pipetagem. Meça o volume da suspensão usando uma micropipeta. Adicione PBS para ajustar o volume para 60 μL (pequena escala) ou 500 μL (grande escala). Transfira a suspensão para um novo tubo de 1,5 mL.
  5. Transfira 10 μL de suspensão de proteolipossomas para um novo tubo de PCR para SDS-PAGE. Divida o resto das amostras em porções menores para uso quando necessário. Congelar em azoto líquido e conservar a -80 °C.

7. Coloração SDS-PAGE e CBB

  1. Adicionar 70 μL de água e 40 μL de 3x tampão de amostra SDS-PAGE a 10 μL de suspensão de proteolipossoma.
    CUIDADO: Não ferva a amostra SDS-PAGE, pois as proteínas de membrana se agregam e dificilmente penetram no gel de acrilamida na eletroforese. Além disso, adicione agente redutor suficiente ao tampão de amostra SDS-PAGE (por exemplo, 2-mercaptoetanol na concentração final de 3%) para evitar a oxidação.
  2. Defina um gel SDS-PAGE gradiente de 5% a 20% em uma câmara de eletroforese. Carregar 3 μL, 6 μL, 12 μL de amostras de proteolipossoma, 2 μL de marcador de tamanho de proteína e séries padrão BSA também.
  3. Eletroforese a 52 mA, 400 V por 30 min.
  4. Manchar o gel com corante CBB por 1 h. Descolorir em água quente e digitalizar a imagem do gel.
  5. Usando o software NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), quantifique a intensidade da banda da proteína de membrana em cada pista. Estimar a quantidade de proteínas de membrana sintetizadas com séries padrão BSA.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando este protocolo, proteolipossomas parcialmente purificados podem ser obtidos em um curto espaço de tempo. Os resultados representativos são apresentados na Figura 2A. Vinte e cinco GPCRs de Classe A, B e C foram sintetizados com sucesso usando o método de diálise de bicamádas (pequena escala) e parcialmente purificados por centrifugação e lavagem tampão. Embora a quantidade de proteínas sintetizadas varie de acordo com o tipo de proteína, 50 a 400 μg de proteínas de membrana geralmente...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo apresentado fornece um método de produção de proteínas de membrana a uma alta taxa de sucesso. Este protocolo é simples, altamente reprodutível e fácil de ampliar. Também tem o potencial de reduzir o tempo e o custo de experimentos que consomem uma grande quantidade de proteínas de membrana. O método bicamada-diálise melhora a produtividade em 4–10 vezes em comparação com o método bicamada ou método de diálise (Figura 2B)45. Em um caso extremo, o rendiment...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pelo Projeto de Plataforma para Apoio à Descoberta de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (Base para Apoiar a Descoberta Inovadora de Medicamentos e Pesquisa em Ciências da Vida (BINDS)) da AMED sob o Número de Concessão JP20am0101077. Este trabalho também foi parcialmente apoiado pelo JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
&vezes; 3 TampãoContendo 10% de 2-mercaptoetanol
5-20% de gradiente de gel SDS-PAGEATTOE-D520L
70% de etanolEtanol diluído em água ultrapura.
AgaroseTakara Bio
Acetato de amônioNakalai tesque02406-95Como este reagente é deliquescente, dissolva-o todo em água depois de aberto e armazene-o a -30 graus Celsius.
Ampicilina SódicaNakalai tesque02739-74
Lipossoma de Asolectina, liofilizadoCellFree SciencesCFS-PLE-ASLUm frasco para injetáveis contém 10 mg de lipossomas liofilizados.
Padrão1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 µ L &vezes; 1 tampão de amostra SDS-PAGE
de gel CBB
clone de cDNA de interessePlasmídeo que abriga clone de cDNA ou fragmento de DNA sintético
ClorofórmioNakalai tesque08402-84
Incubadoraresfriada Temperatura variando de 0 a 40 ° C ou mais largo.
Creatina quinaseRoche Diagnostics04524977190
Copo de diálise (0,1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de diálise, 10K MWCO, 0,1 mL
Copo de diálise (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de diálise, 10K MWCO,
marcador de escada de DNAThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
E. coli estirpe JM109
Câmara de eletroforeseATTO
Etanol (99,5%)Nakalai tesque14713-95
Brometo de
Balão de evaporação, 100 mL
Scanner
gelUsamos scanner de documentos e imunizador de LED como substituto.
Caldo
Lipídios de interesseAvanti Polar Lipids
MicrocentrífugaTOMYMX-307
Mistura NTPCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMistura de ATP, GTP, CTP, UTP, a 25 mM cada
Tubo de 25 mL sem nucleaseIWAKI362-025-MYP
Tubos de plástico sem nucreaseWatson bio labsNão autoclave. Use-os separadamente de outros experimentos.
Dicas sem pêncreasWatson bio labsNão autoclave. Use-os separadamente de outros experimentos.
Kit de purificação de PCR
pEU-E01-MCS vectorCellFree SciencesCFS-11
Fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Kit Midi de preparação de plasmídeosMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher Scientific Customoligo síntese5'-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnn-3'
Primer específico do gene, para a frente. A caixa maiúscula mostra a sequência de sobreposição a ser adicionada para clonagem contínua. Minúsculas nnnn…. (20-30 pb) mostra sequência específica do gene.
Primer 2Thermo Fisher Scientific Customoligo síntese5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnn-3'
Primer específico do gene, reverso. A caixa maiúscula mostra a sequência de sobreposição a ser adicionada para clonagem contínua. Minúsculas nnnn…. (20-30 pb) mostra sequência específica do gene.
Primer 3Thermo Fisher Scientific Síntesede oligo personalizada5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Primer direto para linearização vetorial. Sublinhar funciona como sobreposição na clonagem contínua.
Primer 4Thermo Fisher Scientific Síntesede oligo personalizada5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Primer reverso para linearização vetorial. Sublinhar funciona como sobreposição na clonagem contínua.
Primer 5Thermo Fisher ScientificCustom oligo síntese5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3'
Primer de sequenciamento, direto
Primer 6Thermo Fisher Scientific Customoligo synthesis5'- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3'
Primer de sequenciamento, marcador de tamanho de proteína reverso
Bio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Evaporador
enzimática de clonagem sem costuraNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Outros reagentes de clonagem sem costura também estão disponíveis.
SP6 RNA Polimerase & Inibidor de RNaseCellFree SciencesCFS-TSC-ENZ
de eletroforese submarina
Tampão TAE Tampão
de transcrição LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Tampão de traduçãoCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (&vezes; 40) solução estoque (S1, S2, S3, S4).
Preparar &tempos; 1 tampão de translação antes do uso, misturando estoque S1, S2, S3, S4 e água ultrapura.
ultrapuraRecomendamos preparar água ultrapura usando o sistema de produção de água ultrapura toda vez que você fizer experimentos. Não autoclave.
Preparamos água ultrapura usando o sistema Milli-Q Reference e Elix10.
Água livre de nuclease disponível comercialmente (não água tratada com DEPC) pode ser usada como substituta. Cuide da contaminação depois de abrir a garrafa.
Homogeneizador ultrassônicoBransonSONIFIER modelo 450D-AdvancedO limpador ultrassônico pode ser usado como substituto.
Transiluminador
Dessecador
gérmen de trigoCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240
de amostra SDS-PAGE BSA Mancha de 2 mL etídio de LB DE TAMPÃO PBS MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel e PCR Clean-up rotativo mistura Sistema Água UVa vácuo Extrato de

Referências

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