Caracterização e Previsão Funcional de Bactérias em Tecidos Ovarianos

Resumo

A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento do gene RNA ribossômico 16S (gene 16S rRNA) foram realizados a fim de descobrir e distinguir bactérias em tecidos ovarianos cancerígenos e não cancerígenos in situ. As diferenças composicionais e funcionais das bactérias foram previstas pelo uso do BugBase e da Investigação Filogenética das Comunidades por Reconstrução de Estados Não Observados (PICRUSt).

Resumo

A teoria de um trato reprodutivo superior feminino "estéril" vem encontrando crescente oposição devido aos avanços na detecção bacteriana. No entanto, ainda não foi confirmado se os ovários contêm bactérias. Aqui, um experimento para detectar bactérias em tecidos ovarianos foi introduzido. Escolhemos pacientes com câncer de ovário no grupo de câncer e pacientes não cancerígenos no grupo controle. O sequenciamento genético rRNA 16S foi usado para diferenciar bactérias em tecidos ovarianos dos grupos de câncer e controle. Além disso, previmos a composição funcional das bactérias identificadas usando BugBase e PICRUSt. Este método também pode ser usado em outras vísceras e tecidos, uma vez que muitos órgãos têm sido comprovados para abrigar bactérias nos últimos anos. A presença de bactérias em vísceras e tecidos pode ajudar os cientistas a avaliar tecidos cancerígenos e normais e pode ser ajuda no tratamento do câncer.

Introdução

Recentemente, foram publicados um número crescente de artigos que comprovam a existência de bactérias em vísceras sólidas abdominais, como rim, baço, fígado e ovário^1,2. Geller et al. encontraram bactérias em tumores pancreáticos, e essas bactérias eram resistentes à gemcitabina, uma droga quimioterápica². S. Manfredo Vieira et al. concluíram que Enterococcus gallinarum era portátil para os linfonodos, fígado e baço, e poderia conduzir autoimunidade³.

Como o colo do útero desempenha um papel como defensor, bactérias no trato reprodutivo feminino superior, que contém o útero, tubos de falópio e ovários, têm sido minimamente pesquisadas. No entanto, algumas novas teorias foram estabelecidas nos últimos anos. As bactérias podem ter acesso à cavidade uterina durante o ciclo menstrual devido a alterações nas mucinas^4,5. Além disso, Zervomanolakis et al. confirmaram que o útero, juntamente com os tubos de falópio, é uma bomba peristáltica controlada pelo sistema endócrino dos ovários, e esse arranjo permite que as bactérias entrem no endométrio, tubos de falópio e ovários⁶.

O trato reprodutivo superior não é mais um mistério graças ao desenvolvimento de métodos de detecção bacteriana. Verstraelen et al. usaram um método de sequenciamento de ponta emparelhado em código de barras para descobrir bactérias uterinas mirando na região hipervariável V1-2 do gene RNA^{16S 7}. Fang et al. utilizaram sequenciamento de código de barras em pacientes com pólipos endometrial e revelaram a presença de diversas bactérias intrauterinas⁸. Além disso, usando o gene RNA 16S, Miles et al. e Chen et al. encontraram bactérias no sistema genital de mulheres que haviam sido submetidas à salpingo-oofrectomia e histerectomia,^{respectivamente 5,9}.

Bactérias nos tecidos tumorais têm ganhado cada vez mais atenção nos últimos anos. Banerjee et al. descobriram que a assinatura do microbioma diferia entre pacientes com câncer de ovário e controles¹⁰. Umsibiricum noxynatronum foi associado ao estágio tumoral, e a valcuolata de metanoossarcina pode ser usada para diagnosticar câncer de ovário¹¹. Além do câncer de ovário, outros cânceres, como estômago, pulmão, próstata, mama, colo do útero e endométrio, têm sido comprovados associados às bactérias^{12,13,14,15,16,17,18}. Poore et al. propuseram uma nova classe de diagnósticos oncológicos baseados em microbianos, prevendo o rastreamento precoce do câncer¹⁹. Neste protocolo, investigamos as diferenças entre os tecidos cancerígenos e o ovário normal, comparando a composição e função das bactérias nesses dois tecidos.

A coloração imunohistoquímica e o sequenciamento genético de rRNA 16S foram realizados para confirmar a presença de bactérias nos ovários. As diferenças e as funções previstas das bactérias ovarianas nos tecidos ovarianos cancerosos e noncancerosos foram estudadas. Os resultados mostraram a existência de bactérias nos tecidos ovarianos. Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata estavam relacionados ao estágio e ao diagnóstico de câncer de ovário, respectivamente. Foram comparadas 46 vias KEGG significativamente diferentes que estavam presentes em ambos os grupos.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional Médica do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Xi'an Jiaotong (Nº. XJTUIAF2018LSK-139). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes inscritos.

1. Critérios para entrar no grupo de câncer e no grupo controle

1. Para o grupo de câncer, matricule pacientes que são diagnosticados principalmente com câncer de ovário, e após a laparotomia, eles são comprovadamente com câncer de ovário sérico por achados patológicos.
2. Para o grupo controle, inscreva-se pacientes que são diagnosticados principalmente com mioma uterino ou adenomyose uterina, sem apresentar qualquer condição ovariana, e que tenham sido submetidos a histerectomia e salpingo-oophorectomia.
   NOTA: Este padrão não é definitivo. Pacientes com doenças que não afetam os ovários submetidos à histerectomia e salpingo-oofrectomia também podem ser inscritos.
3. Exclua pacientes com um ou mais dos seguintes critérios:
   Mulheres grávidas ou amamentando.
   Tomando antibióticos 2 meses antes da cirurgia.
   Ter febre ou marcadores inflamatórios elevados.
   Ter qualquer tipo de inflamação.
   Tendo sido submetido à quimioterapia neoadjuvante.

2. Coletar amostras

1. Durante a cirurgia, coloque os ovários ressecados em um tubo estéril e coloque o tubo em nitrogênio líquido para transporte. Evite tocar em qualquer outra coisa durante todo o procedimento.
2. Separe os ovários em amostras de tecido de aproximadamente 1 cm de espessura com um par de novas pinças estéreis sob um armário de fluxo laminar. Após a separação, preserve as amostras a -80 °C.
   NOTA: Todos os procedimentos para coleta de amostras são assépticos, incluindo a separação dos ovários.

3. Sequencie o gene rRNA 16S

1. Extrair DNA.
   1. Adicione 1,2 mL de tampão EX inibidor em um tubo de centrífuga de 2 mL. Em seguida, adicione 180-220 mg de amostras no tubo. Deixe a amostra misturar totalmente (banho de água de 70 °C por 5 minutos e, em seguida, vórtice para 15 s).
   2. Centrifugar o tubo por 1 min a 600 x g.
   3. Coloque 550 μL do supernaente em um novo tubo de 1,5 mL, e centrífuga por 1 min a 600 x g.
   4. Transfira 400 μL do supernante com 30 μL de proteinase K para outro tubo de 1,5 mL.
   5. Adicione 400 μL de AL tampão e use um misturador de vórtice para 15 s.
   6. Incubar a 70 °C por 10 min.
   7. Adicione 400 μL de 96-100% de álcool. Use uma batedeira de vórtice para 15 s.
   8. Transfira 600 μL de mistura em uma coluna de absorção e centrífuga por 1 min a 13700 g. Troque o tubo inferior. Repita este passo 11 vezes.
   9. Adicione 500 μL de tampão AW1, centrífuga por 1 min a 13.700 x g e troque o tubo inferior.
   10. Adicione 500 μL de tampão AW2, centrífuga por 3 min a 13.700 x g e troque o tubo inferior.
   11. Centrifugar por 3 min a 13.700 x g.
   12. Transfira a mistura para um novo tubo de 1,5 mL, adicione 200 μL de tampão ATE, incubar em temperatura ambiente por 5 min e centrífuga por 1 min a 13.700 x g.
2. Teste de qualidade. Use 1% de eletroforese de gel sepharose para testar a qualidade. Adicione 400 ng de amostra, 120 V, 30 minutos. Resultado ideal: concentração de DNA: ≥ 10 ng/μL, pureza do DNA: A260/A280 = 1,8-2.0, DNA bruto: ≥ 300 ng.
3. Prepare as bibliotecas usando um kit de sequenciamento metagenômico 16S de acordo com o protocolo do fabricante.
   1. Executar PCR. Resumidamente, cada reação pcr de 25 μL contém 12,5 ng de DNA amostral como entrada, 12,5 μL de 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix e 5 μL de cada primer a 1 μM.
   2. Realizar pcr utilizando o seguinte protocolo: uma etapa inicial de desnaturação realizada a 95°C por 3 min seguido de 25 ciclos de denaturação (95°C, 30 s), ressaramento (55°C, 30 s) e extensão (72°C, 30 s), e um alongamento final de 5 min a 72°C.
   3. Limpe o produto PCR da mistura de reação com contas magnéticas usando as instruções do fabricante.
   4. Repetir as etapas 3.3.1 e 3.3.2.
   5. Teste de qualidade. Por favor, consulte a etapa 3.2.
   6. Repita o passo 3.3.3.
   7. Teste de qualidade. Use 1% de eletroforese de gel sepharose para testar a impureza, um espectógrafo para testar a pureza, um fluorômetro para testar a concentração e um kit de ensaio de RNA para testar a integridade. Siga o protocolo do fabricante. Normalizar e agrupar as bibliotecas; em seguida, sequência (configuração de leitura final emparelhada de 2 x 300 bp) usando células de fluxo padrão V3 de 600 ciclos, produzindo aproximadamente 100.000 leituras de base de fim pareado 2 x 300.
      NOTA: As sequências de primer de comprimento completo: 16S Amplicon polymerase chain reaction (PCR) Primer de frente: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGTGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGG GNGGCWGCAG] e 16S Amplicon PCR Primer Revers: 5' GTCTCGTGGGGAGATGTGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Analisar dados de sequenciamento genético de rRNA 16S

1. Filtre as leituras brutas de cada amostra com base na qualidade de sequenciamento com o pacote de software QIIME 2-201802²⁰.
   1. Copie três arquivos para o diretório: emp-paired-end-sequences_01
      um arquivo forward.fastq.gz que contém a sequência para a frente diz,
      um arquivo reverso.fastq.gz que contém a sequência reversa lê,
      um arquivo de código de barras.fastq.gz que contém o código de barras associado lê
   2. Executar
      importação de ferramentas de qiime \
      -tipo EMPPairedEndSequences \
      --entrada-caminho emp-emparelhado-end-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
2. Remova as sequências de primer e adaptador.
   qiime cutadapt trim-paired \
   --i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
   -p-front-f GCTACGGGG \
   -p-front-r GCTACGGGG \
   -p-taxa de erro 0 \
   --corte de qualidade 25 \
   --o-aparadas-seqüências aparados-seqs_03.qza \
   --verbose
3. Encurtar a sequência lê em que ambas as qualidades de extremidade emparelhada são inferiores a 25. Veja acima --qualidade de corte 25
4. Analise os dados de sequenciamento.
   1. Reúna sequências para formar unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com um corte de similaridade de 97%.
      qiime vsearch dereplicato-seqüências \
      --i-seqüências aparados-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-seqüências rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      -i-table table_04.qza \
      --i-seqüências rep-seqs_04.qza \
      --i-referencia-seqüências 97_otus.qza \
      -p-perc-identidade 0.97 \
      --o-clustered-table-cr-97.qza \
      --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-incomparável-seqüências incomparáveis-cr-97.qza
   2. Para as OTUs, calcule a abundância relativa em cada amostra. Informações sobre abundância estão em table-cr-97.qza
5. Empregue um classificador bayesiano nativo, que visa o conjunto de treinamento RDP (versão 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), para classificar todas as sequências. As informações sobre taxon mapeadas estão em table-cr-97.qza
6. Dentro da OTU dada, atribua uma classificação que reflete a coerência principal das sequências às OTUs. Em seguida, alinhe as OTUs. Consulte table-cr-97.qza e rep-seqs-cr-97.qza
7. Com base nas informações do grupo amostral, realize a diversidade alfa (incluindo os índices Chao 1, ACE, Shannon, Simpson e Evenness) e a análise principal de coordenadas baseadas na UniFrac (PCoA).
   qiime ferramentas exportação \
   --entrada-caminho tabela-cr-97.qza \
   --saída-caminho exportado-tabela de recursos
   tabela de recursos exportados
   
   qiime diversidade alfa \
   -i-tabela tabela-cr-97.qza \
   -p-métrica observed_otus \
   --o-alfa-diversidade observed_otus_vector.qza
   
   qiime diversidade beta \
   -i-tabela tabela-cr-97.qza \
   -p-métrica braycurtis \
   --o-distância-matriz unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Prever a função bacteriana

1. Para prever a representação relacionada das características das bactérias, use o BugBase²¹. A tabela OTU de entrada para BugBase é preparada usando os seguintes comandos.
   biom converter -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
   biom converter -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="tabela OTU" --to-json
   NOTA: A previsão é baseada em seis categorias de fenótipo (Ward et al. inédito) (https://bugbase.cs.umn.edu/): Coloração de grama, tolerância ao oxigênio, capacidade de formar biofilmes, conteúdo de elementos móveis, patogenicidade e tolerância ao estresse oxidativo.
2. Prever a composição funcional de um metagenome pelo PICRUSt com o uso de dados genéticos marcadores e um banco de dados contendo genomas de referência²².
   make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
   normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
   predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
   categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
   categorize_by_function.py -f-i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt
3. Analisar as diferenças de funções entre cada grupo com a ajuda do STAMP^23,24. Consulte as citações para operar o software.

6. Dados

1. Use software estatístico para calcular a importância dos achados. A indicação de significância estatística deve ser definida como P < 0,05.
2. Avaliar diferenças de idade e paridade pelo teste t do Aluno. Avaliar diferenças no estado da menopausa, histórico de hipertensão e diabetes pelo teste qui-quadrado. Avalie as diferenças no número de taxas bacterianas ovarianas pelo teste Mann-Whitney U.

Resultados

Pacientes
No estudo, foram incluídos 16 pacientes qualificados. O grupo controle incluiu 10 mulheres com diagnóstico de tumor uterino benigno (entre elas, 3 pacientes foram diagnosticados com moma uterino, e 7 pacientes foram diagnosticados com adenomiatona uterina). Enquanto isso, o grupo de câncer continha 6 mulheres com diagnóstico de câncer de ovário sérico (entre elas, 2 pacientes foram diagnosticados com estágio II, sendo que 2 delas foram diagnosticadas com estágio III). As seguintes caracterís...

Discussão

O câncer de ovário tem uma influência notável na fertilidade das mulheres²⁵. A maioria dos pacientes com câncer de ovário é diagnosticada em estágios tardios, e a taxa de sobrevivência de 5 anos é inferior a 30%¹⁸. Foi publicada a confirmação de bactérias nas vísceras sólidas abdominais, incluindo fígado, pâncreas e baço. A existência de bactérias no trato reprodutivo feminino superior ocorre porque o colo uterino não está fechado^2,

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2200 Software TapeStation	Agilgent Estados Unidos
AmpliSeq para Preparação de Bibliotecas, Índices e Acessórios	Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetics
Leica ASP 300S	Leica Biosystems Divisão da Leica Microsystems
Leica EG 1150	Leica Biosystems Divisão de Leica Microsystems
Leica RM2235	Leica Biosystems Divisão da Leica Microsystems
LPS Core anticorpo monoclonal, clone WN1 222-5	Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus contas magnéticas	Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Banco de dados Silva	Instituto Max Planck de Microbiologia Marinha e Universidade
o Sistema QuantiFluor dsDNA	Promega	E2670
Trimmomatic	Bjö rn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Kit Anti-Coelho (DAB)	Sistemas Zytomed	HRP008DAB-RB