Isolamento de Adipócitos Viáveis e Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Visceral Humano Adequado para Análise de RNA e Fenotipagem de Macrófagos

Resumo

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Resumo

O tecido adiposo visceral (TAV) é um órgão metabólico ativo composto principalmente por adipócitos maduros e células da fração vascular estromal (FRS), que liberam diferentes moléculas bioativas que controlam processos metabólicos, hormonais e imunológicos; Atualmente, não está claro como esses processos são regulados dentro do tecido adiposo. Portanto, o desenvolvimento de métodos que avaliem a contribuição de cada população celular para a fisiopatologia do tecido adiposo é crucial. Este protocolo descreve as etapas de isolamento e fornece as diretrizes de solução de problemas necessárias para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e SVF de biópsias de TAV humano em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase. Além disso, o protocolo também é otimizado para identificar subgrupos de macrófagos e realizar isolamento de RNA de adipócitos maduros para estudos de expressão gênica, o que permite a realização de estudos dissecando a interação entre essas populações celulares. Resumidamente, as biópsias de IVA são lavadas, picadas mecanicamente e digeridas para gerar uma suspensão de célula única. Após a centrifugação, adipócitos maduros são isolados por flutuação do pellet de SVF. O protocolo de extração de RNA garante um alto rendimento de RNA total (incluindo miRNAs) de adipócitos para ensaios de expressão a jusante. Simultaneamente, as células SVF são usadas para caracterizar subtipos de macrófagos (fenótipo pró e anti-inflamatório) por meio da análise por citometria de fluxo.

Introdução

O tecido adiposo branco é composto não apenas por células adiposas ou adipócitos, mas também por uma fração de células não adiposas conhecida como fração vascular estromal (FVS), que contém uma população celular heterogênea constituída por macrófagos, outras células imunes como células T reguladoras (Tregs), eosinófilos, pré-adipócitos e fibroblastos, circundados por tecido vascular e conjuntivo ^1,2. O tecido adiposo (TA) é hoje considerado um órgão que regula processos fisiológicos relacionados ao metabolismo e à inflamação por meio de adipocinas, citocinas e microRNAs produzidos e liberados por diferentes cé....

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo CEP do Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). A participação foi voluntária e todas as mulheres inscritas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Coleção de tecido adiposo visceral

1. Obter biópsias de IVA através de omentectomia parcial durante cesariana de mulheres adultas saudáveis com gravidez única a termo sem trabalho de parto.
2. Após o fechamento uterino e hemostasia, proceder à identificação do omento maior e estendê-lo em compressa úmida. O AT exposto é IVA.
3. Localize o maior vaso sanguíneo e trace uma linha imaginária de 7 x 5 cm at....

Resultados

Este protocolo descreve um método enzimático utilizando digestão de colagenase seguida de centrifugação diferencial para isolar, em um único processo, adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias de TAV obtidas de gestantes saudáveis após omentectomia parcial. Neste caso, utilizamos os adipócitos para extração de RNA e a FVA para fenotipagem de macrófagos.

O protocolo de extração de RNA permitiu a obtenção de RNA com pureza adequada, alta integridade e microRNAs de adipócitos maduros (.......

Discussão

O IVA desempenha um papel crucial na regulação metabólica e inflamação. O crescente interesse no papel dos adipócitos e das células imunes na inflamação crônica associada à obesidade levou ao desenvolvimento de diferentes técnicas para separar a FVS das células adiposas presentes na TA. No entanto, a maioria das técnicas não permite obter esses dois diferentes conjuntos de células viáveis para aplicações a jusante a partir de uma mesma biópsia de TAV em um único procedimento, o que poderia ser crucial para estudos sobre .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de PCR de 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C	RNase, livre de DNase e não pirogênico
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C	RNase, livre de DNase e não pirogênica
Pipetas sorológicas de 10 mL	Corning	CLS4101-50EA	Embaladas individualmente em plástico
10 µ L ponta de pipeta universal	Axygen	T-300-L-R	RNase, livre de DNase e não pirogênica
10 µ L ponta de pipeta universal	Axygen	T-300-R-S	RNase, livre de DNase e não pirogênica
1000 µ L ponta de pipeta universal	Axygen	T-1000-B-R	RNase, tubo de microcentrífuga de 2,0 mL livre de DNase e não pirogênico
	Axygen	MCT-200-C	RNase, livre de DNase e não pirogênico
200 µ L ponta de pipeta universal	Axygen	T-200-Y-R	RNase, livre de DNase e não pirogênica
2100 Bioanalyzer Instrumento	Agilent
G2939BA-2101 Bioanalyzer PC	Agilent	G2953CA	2100 Software Expert pré-instalado no PC
Tubo de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo de 5 ml	Corning	352003	Tampa de pressão, estéril
Tubos de centrífuga de 50 mL	Corning	CLS430828-100EA	Polipropileno, fundo cônico e estéril
Reagente à base de ácido-guanidínio-fenol	Reagente Zymo Research	R2050-1-200	TRI ou similar
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511-Agilent
Small RNA Kit	Agilent	5067-1548-APC
/Cy7 anti-humano CD14 Anticorpo	BioLegend	325620	0,4 mg/106 células, presentes em monócitos/macrófagos, clone HCD14
Baker	-	-	250 ml, albumina
de soro bovino	Sigma-Aldrich	A3912-100G	Fração de choque térmico, pH 5,2, ≥ Estação
de escorva de 96	Chip Agilent	5065-9951-Colgenase
tipo II	Gibco	17101-015	Pó
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G8270-100G	Pó
Direto-zol RNA Miniprep	Zymo Research	R2051	Fornecido com 50 mL TRI reagen
Pinça de dissecação	-		Aço, mandíbulas serrilhadas e redondo extremidades
Bandeja de dissecação	-	-	Aço inoxidável
Álcool etílico	Sigma-Aldrich	E7023-500ML	200  à prova, para biologia molecular
FACS Flow Sheath Fluid	BD Biosciences
342003-FACS Lysing Solution	BD Biosciences
349202-FACSAria III Citômetro/Classificador de Células	BD Biosciences
648282-FASCDiva Software	BD Biosciences	642868	Software v6.0 Hemacitômetro pré-instalado
	Sigma	Z359629-1EA-Contador	de
células manual	-		--
	Scisors de dissecação de	maionese -
Microcentrífuga	-		Espectrofotômetro Nanodrop de temperatura ajustável
	Agitador		ND2000LAPTOP-orbital
	-		Temperatura e velocidade ajustáveis
P10  volume variável  micropipeta	Thermo Scientific-Finnpipette	4642040	1 a 10 μ L
P1000  volume variável  micropipeta	Thermo Scientific-Finnpipette	4642090	100 a 1000 μ L
P2  volume variável  micropipeta	Thermo Scientific-Finnpipette	4642010	0,2 a 2 μ L
P200  volume variável  micropipeta	Thermo Scientific-Finnpipette	4642080	20 a 200 μ L
Rack de armazenamento de tubos de PCR	Axygen		R96PCRFSP-PE
Cy5 anticorpo HLA-DR humano	BioLegend	307608	0,0625 mg/106 células, presente em macrófagos, clone L243
PE/Cy7 anticorpo CD45 humano	BioLegend	304016	0,1 mg/106 células, presente em leucócitos, clone H130
Solução salina	tamponada com fosfatoSigma-Aldrich	P3813-10PAK	Pó, pH 7,4, para preparação de soluções de 1 L
Controlador	de pipeta-	-	-
Tampão de lise de glóbulos vermelhos	Roche	11 814 389 001	Para lise preferencial de glóbulos vermelhos de sangue total humano
Centrífuga refrigerada	-		Adaptador Whit para tubos cônicos de 50 mL
Recipiente de amostra estéril	-	-	-
Pipeta de transferência	Thermo Scientific-Samco	204-1S	Trypan Estéril
Azul	Gibco	15250-061	0,4% Solução
Racks de tubos	-	-	Para diferentes tamanhos de tubos
Vortex Mini Shaker	Cientifica SENNA	BV101	-

não estéril % de aço inoxidável Thermo Scientific/