Fornecemos um protocolo detalhado para criação, microinjeção de ovos e para a acasalamento eficiente da célula de fogo Thermobia domestica para gerar e manter cepas mutantes após a edição do genoma.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat
Neste artigo
Resumo
Resumo
O firebrat Thermobia domestica é uma espécie ametabolous, sem asas, que é adequada para estudar os mecanismos de desenvolvimento de insetos que levaram à sua radiação evolutiva bem sucedida na Terra. A aplicação de ferramentas genéticas como a edição de genomas é a chave para entender as mudanças genéticas responsáveis pelas transições evolutivas em uma abordagem Evo-Devo. Neste artigo, descrevemos nosso protocolo atual para gerar e manter cepas mutantes de T. domestica. Relatamos um método de injeção seca, como alternativa ao método de injeção molhada relatado, que nos permite obter altas taxas de sobrevivência em embriões injetados. Também relatamos uma configuração de ambiente otimizado para acasalar adultos e obter gerações subsequentes com alta eficiência. Nosso método ressalta a importância de levar em conta a biologia única de cada espécie para a aplicação bem sucedida de métodos de edição de genomas a organismos modelos não tradicionais. Prevemos que esses protocolos de edição de genomas ajudarão na implementação do T. domestica como modelo de laboratório e para acelerar ainda mais o desenvolvimento e a aplicação de ferramentas genéticas úteis nesta espécie.
Introdução
A termobia domestica pertence a uma das ordens mais basais de insetos, zygentoma, que mantém um ciclo de vida ancestral ametabolous e sem asas. Tal posição filogenética basal e características ancestrais definem esta espécie como um modelo atraente para estudar os mecanismos subjacentes ao sucesso dos insetos na Terra, que cobrem mais de 70% das espécies animais descritas1. A T. domestica tem sido usada há muito tempo para estudar características ancestrais da fisiologia de insetos devido às suas características adequadas como modelo de laboratório, como um ciclo de vida relativamente curto (2,5-3,0 meses de embrião a adulto r....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Manutenção de colônias de laboratório
- Para a manutenção de populações selvagens e mutantes, utilize um grande recipiente plástico (460 mm x 360 mm x 170 mm) com alimentos regulares de peixe artificial, água em copos plásticos com um orifício de ventilação na parte superior, um papel dobrado para esconder os insetos e algodão em camadas para colocação de ovos(Figura 2A). Mantenha todas as culturas T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C e coloque a umidade relativa do ar (RH) dentro de cada recipiente para 60%-80%.
NOTA: Como t. domestica absorve vapor de água da atmosfera11,um ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Em nossas mãos, cerca de 100 ovos podem ser bem injetados com uma única injeção capilar quando tem a ponta adequada(Figura 3C). Injeção de complexo de ribonucleoproteína gRNA/Cas9 em embriões nas primeiras 8h após a colocação de ovos resulta em indels no local alvo do gRNA. Isso causa mutações bialólicas em algumas células da geração injetada (G0) e, portanto, fenótipos de mosaico mutantes são geralmente obtidos em G0. Por exemplo, quando este protocolo foi usado para injetar um gRNA que é p.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Para a geração bem sucedida do mutante T. domestica desejado com CRISPR/Cas9, é primeiro importante coletar um número suficiente de embriões encenados para injeção. Para uma coleta constante de um número suficiente de ovos T. domestica, a chave é selecionar um tamanho apropriado do recipiente para ter uma densidade populacional menor, pois ajudaria a conclusão bem sucedida de uma série de comportamentos complexos de acasalamento, que se repete após cada moltadulto 13. Um adulto <.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
TO e TD foram apoiados pelos números de subvenção JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999, respectivamente.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de 24 poços | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µ g | Integrated DNA Technologies | 1081060 | |
| Limpador antiestático | Hozan | Z-292 | para remover eletricidade estática de uma placa de 24 poços |
| Caixa de barreira 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Recipiente grande |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Microinjetor eletrônico |
| Femtotip II, capilar de injeção | Eppendorf | 5242957000 | Injeção de vidro capilar |
| alto pacote 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Incubadora de contêiner de tamanho médio |
| Panasonic | MIR-554-PJ | para 37 ° C incubação. Não há necessidade de umidificar dentro da incubadora. | |
| Toyobo | KFX-101 | de KOD Fx Neo | para a genotipagem. Otimizado para uma amplificação a partir de modelos brutos. |
| Suporte magnético | Narishige | GJ-8 | para segurar o micromanipulador |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulador | Narishige | MM-3 | |
| Microscópio | Olympus | SZX12 | para microinjeção. A ampliação de mais de 35X é suficiente para a microinjeção |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 Sistema de | eletroforese de microchip |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Fita dupla face para colocar ovos em uma lâmina de vidro |
| Pincel (crina de cavalo) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Prato de cultura de plantas | SPL Life Sciences | 310100 | Prato de acasalamento e abastecimento de água para recipientes grandes e médios |
| Proteinase K, recombinante, Liofilizado de grau PCR de Pichia pastoris | Microscópio | Roche 3115836001 | |
| SZX 12 | Olympus | SZX 12 | Mais de 35X de ampliação é suficiente para a microinjeção |
| Pó de talco | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold | Growth Spectrum Brands | Comida de peixe regular artificial |
Referências
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashi....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
