Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As técnicas convencionais de microeletrodos intraecelulares para quantificar a eletrofisiologia cardiomiocócica são extremamente complexas, intensivas em mão-de-obra e tipicamente realizadas em baixo rendimento. A rápida e contínua expansão da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) apresenta um novo padrão em pesquisa cardiovascular e métodos alternativos são agora necessários para aumentar o throughput de dados eletrofisiológicos em um único nível celular. VF2.1Cl é um corante sensível à tensão recentemente derivado que fornece uma resposta rápida de canal único e de alta magnitude às flutuações no potencial da membrana. Possui cinética superior às de outros indicadores de tensão existentes e disponibiliza dados funcionais equivalentes aos das técnicas tradicionais de microeletrodo. Aqui, demonstramos uma caracterização potencial de ação simplificada e não invasiva em cardiomiócitos derivados do iPSC humanos com ritmo externo usando um sistema de fotometria modular e altamente acessível.
Introdução
A modelagem eletrofisiológica de cardiomiócitos e a construção de plataformas eficientes para rastreamento de medicamentos cardíacos é essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para uma variedade de distúrbios arrítmicos. A rápida expansão da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) produziu incursões promissoras na modelagem de doenças humanas e na investigação farmacológica usando cardiomiócitos isolados derivados do paciente (iPSC-CM). Técnicas "padrão-ouro" para caracterização eletrofisiológica dessas células através de patch-clamp (grampo atual) podem quantificar o potencial de ação (AP) morfologia e duração, no entanto, este....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
1. Preparações celulares
NOTA: Os iPSCs humanos utilizados neste protocolo foram derivados de doadores saudáveis e diferenciados em monocamadas utilizando modulação de moléculas pequenas totalmente definidas de técnicas de sinalização e purificação de lactatos, conforme descrito anteriormente12,13,14. os iPSC-CMs foram mantidos a cada 2-3 dias com um meio de cultura descrito abaixo.
- Prepare um meio de cultura de meio basal (RPMI 1640) e 2% de suplemento (B27). Armazenar a 4 °C. Use à temperatura ambiente (RT).
- Prepare um meio d....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Figura 3: Perfis de potencial de ação óptica (AP) de cardiomiócitos nativos isolados e cardiomiócitos pluripotentes induzidos por humanos derivados de células-tronco (iPSC-CM). (A) Ap óptico representativo de um único cardiomiócito murino (centro) com média ± SEM de APD50 e APD90 (n = 7, à direita). (B) Ap óptico representativo de um.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui descrevemos um protocolo básico para adquirir facilmente perfis de AP detalhados de iPSC-CMs isolados adequados para modelagem eletrofisiológica e rastreamento de medicamentos cardíacos. Detectamos APs regulares e robustos de nossos iPSC-CMs pouco semeados, o que sugere a funcionalidade do indicador e a fidelidade metodológica.
Devido ao amplo espectro de metodologias comerciais para reprogramação do iPSC e falta de padronização para protocolos de diferenciação cardíaca, os modelos basead.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Cairn Research Ltd apoiou esta publicação cobrindo os custos de produção do arquivo de vídeo.
Agradecimentos
Os autores gostariam de reconhecer a Cairn Research Ltd. por sua gentil contribuição financeira que cobria os custos de produção desta publicação. Além disso, agradecemos à Sra. Ines Mueller e à Sra. Stefanie Kestel pelo excelente apoio técnico.
A pesquisa dos autores é apoiada pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK), o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 e sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2067/1- 390729940) e o Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes | |||
| 0.25 Tripsina EDTA | Gibco | ||
| Suplemento B27 | Gibco | ||
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glicose anidra BioChemica | ITW Reagents | A1422 | |
| Soro Fetal Bovino | Gibco | 10270-106 | |
| Kit de Potencial de Membrana FluoVolt | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipina | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Invitrogen | 15140 | |
| ROCK Inibidor Y27632 | Stemolecule | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | ||
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Equipment | |||
| 495LP Dichroic Beamsplitter | da Chroma Technology | ||
| Molecular Devices | |||
| Lamínulas circulares, espessura 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices | ||
| Fonte de Alimentação Dual OptoLED | Pesquisa de Cairn | ||
| Filtro de Excitação ET470/40x | Chroma Technology | ||
| ET535/50m | Chroma Technology | ||
| Gravado Neubauer Hemacytometer | Hausser Scientific | ||
| Filter Cubes | Pesquisa de Cairn | ||
| Microscópio Invertido IX73 | Olympus | ||
| Pesquisa MonoLED | Cairn | ||
| Adaptadores Multiportas | Pesquisa de Cairn | ||
| Estimulador de Células Myopacer | Obturador IonOptix | ||
| Optomask | Pesquisa de Cairn | ||
| Controlador de Sistema Optoscan | Cairn Research | ||
| Plataforma de Temperatura Controlada PH-1 | Warner Instruments | ||
| Detector Fotomultiplicador | Pesquisa de Cairn | ||
| Inserção de Amplificador PMT | Cairn Research | ||
| Inserção de Fornecimento PMT | Cairn Research | ||
| Câmara de Banho Aberta RC-26G | Warner Instruments | ||
| Adaptador de Palco SA-OLY/2AL | Olympus | ||
| T565lpxr Dichroic Beamsplitter | Chroma Technology | ||
| T660lpxr Dichroic Beamsplitter | Duplo Chroma Technology | ||
| TC-20 | Objetiva Eletrônica | ||
| NPI UPLFLN 40X Olympus | |||
| Câmera colorida USB 3.0 | Fonte | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Molecular Devices | ||
| Captura de IC 2.4 | Fonte de imagem | ||
| Bloco de gráficos | Prism 8 |
Referências
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
