Artigo de método

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

DOI:

10.3791/61890

⸱

22 de dezembro de 2020

 ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Goettingen, Germany, 3Cairn Research Ltd, Faversham, United Kingdom, 4Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Goettingen, Germany

Neste artigo

Resumo

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Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As técnicas convencionais de microeletrodos intraecelulares para quantificar a eletrofisiologia cardiomiocócica são extremamente complexas, intensivas em mão-de-obra e tipicamente realizadas em baixo rendimento. A rápida e contínua expansão da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) apresenta um novo padrão em pesquisa cardiovascular e métodos alternativos são agora necessários para aumentar o throughput de dados eletrofisiológicos em um único nível celular. VF2.1Cl é um corante sensível à tensão recentemente derivado que fornece uma resposta rápida de canal único e de alta magnitude às flutuações no potencial da membrana. Possui cinética superior às de outros indicadores de tensão existentes e disponibiliza dados funcionais equivalentes aos das técnicas tradicionais de microeletrodo. Aqui, demonstramos uma caracterização potencial de ação simplificada e não invasiva em cardiomiócitos derivados do iPSC humanos com ritmo externo usando um sistema de fotometria modular e altamente acessível.

Introdução

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A modelagem eletrofisiológica de cardiomiócitos e a construção de plataformas eficientes para rastreamento de medicamentos cardíacos é essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para uma variedade de distúrbios arrítmicos. A rápida expansão da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) produziu incursões promissoras na modelagem de doenças humanas e na investigação farmacológica usando cardiomiócitos isolados derivados do paciente (iPSC-CM). Técnicas "padrão-ouro" para caracterização eletrofisiológica dessas células através de patch-clamp (grampo atual) podem quantificar o potencial de ação (AP) morfologia e duração, no entanto, este método é incrivelmente complexo e lento, e não é adequado para aquisição de dados de alto rendimento1. IPSC-CMs são regularmente relatados como com um potencial de membrana diastólica aumentada e aumento da corrente de vazamento quando comparados aos cardiomiócitos nativos adultos2. Sugere-se que o tamanho celular menor e a redução da capacitância da membrana observada nos iPSC-CMs podem produzir algum erro sistemático ao usar a técnica de grampo atual, talvez explicando esses desvios3. A fim de maximizar a utilidade de uma plataforma iPSC-CM, um método adicional é valioso para aumentar o throughput e garantir a precisão dos dados ao caracterizar alterações de tensão transmembrana em um único nível celular em iPSC-CMs.

Os corantes sensíveis à tensão (VSD) têm sido há muito tempo um método proposto para fornecer análises mais rápidas, não invasivas e equivalentes da cinética AP cardíaca comparativa com as das técnicas tradicionais4. Um estudo recente demonstrou a adequação da fotometria da sonda sensível à tensão racionmétrica para quantificar com precisão o AP5cardíaco . Além disso, a capacidade de escalar prontamente abordagens de fotometria óptica empresta essa técnica a telas de cardiotoxicidade em larga escala críticas no desenvolvimento de medicamentos terapêuticos (por exemplo, CiPA). O desenvolvimento de protocolos padronizados de cardiotoxicidade em um estudo cego de vários sites usando matriz de microeletrodos e técnicas ópticas de sensoriamento de tensão demonstrou o valor-chave desta abordagem6.

Muitos corantes potencialiométricos estão comercialmente disponíveis, e o desenvolvimento sintético contínuo de novas sondas mostra um potencial empolgante para simplificar sua eficácia em uma variedade de construções cardíacas e neurais. O VSD ideal terá cinética aumentada e sensibilidade, enquanto exibe menor carga capacitiva, fotobleaching e citotoxicidade. O recém-sintetizado VF2.1Cl (FluoVolt) expressa muitas dessas propriedades benéficas em grande parte devido à sua nova estrutura molecular baseada em fios, compartilhada por outros membros da nova família VoltageFluor (VF)7. Em contraste com vsds eletrocrômicos comuns em que sondas simples molecular e eletricamente conjugam à membrana plasmática, este corante consiste em um fio sintético passivamente inserido, de abrangência de membrana, que emparelha um doador rico em elétrons com um fluoróforo de fluoresceína modificada (FITC). Detalhes mecanicistas são fornecidos na Figura 1. Este corante demonstra excelente sensibilidade às flutuações de tensão da membrana, exibindo uma mudança de 27% na intensidade de emissão por 100 mV em oposição a ~10% visto em outras sondas comuns a velocidadescomparáveis 7. Além disso, os sistemas PeT baseados em fios não interagem diretamente com o campo elétrico celular que produz interferência elétrica mínima e mudanças insignificantes na carga capacitiva celular.

figure-introduction-1
Figura 1: Parâmetros químicos, espectrais e mecanicistas de corante VF2.1Cl. (A) Estrutura química de VF2.1Cl. Características moleculares a notar incluem múltiplos grupos de alquila dentro do fio molecular de fenileno vinylene que facilitam a inserção na membrana plasmática. Um grupo de ácido sulfônico carregado negativamente conjugado à sonda FITC garante estabilização de fluoróforo na superfície extracelular e auxilia perto da inserção perpendicular em relação ao campo elétrico da bicamada lipídica. (B) Um esquema simplificado de VF2.1Cl perpendicular incorporando na membrana plasmática de uma célula alvo. (C) Espectro de absorção e emissão de corante VF2.1Cl. O espectro é idêntico ao dos testes FITC e GFP padrão. (D) Representação do modo mecanicista de ação de VF2.1Cl. Em condições de repouso (hiperpolarizadas), tensões intracelulares negativas conduzem elétrons livres em direção ao fluoróforo rostral. A abundância de elétrons garante que a transferência de elétrons induzidos por foto (PeT) seja favorecida como um caminho para fora do estado animado após a excitação óptica, efetivamente saciando a fluorescência. Em contraste, um potencial de membrana despolarizada influencia o movimento de elétrons descendentes favorecendo a fluorescência após a excitação óptica. A resposta fluorescente resultante está linearmente relacionada à tensão da membrana e pode ser precisamente utilizada para coletar informações temporais detalhadas sobre cinética eletrofisiológica celular. (E) Representativo brightfield (superior) e fluorescência a 470 nm (inferior) imagens de cardiomiócitos leporina carregados com VF2.1Cl. (F) Z pilha de um único cardiomiócito carregado. As setas indicam áreas de localização clara de VF2.1Cl para a membrana celular. As imagens foram adquiridas com um sistema confocal de disco giratório consistindo de uma cabeça confocal de disco giratório X-lightv3 com um padrão de pinhole de 50 μm; Iluminador LDI-7; Câmera Prime95B e um objetivo PlanApo Lambda 100x. Barra de escala: 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A sonda FITC conjugada ao VF2.1Cl garante que ele pode ser usado efetivamente sob configurações padrão e filtro GFP, e requer apenas um único sistema de aquisição de canais, ambos características comuns de plataformas de imagem fluorescentes. A análise de monocamadas humanas densas com este corante foi recentemente relatada8,9,10,11. Nosso protocolo difere desses estudos devido à nossa investigação de iPSC-CMs únicos e isolados, imperturbáveis pelas influências elétricas e paracrinas de monocamadas sincicial densas, e pelo uso de um sistema de fotometria acessível e personalizável em oposição a complexos arranjos de imagem confocal ou de campo amplo.

Aqui, descrevemos nosso protocolo para a rápida aquisição e análise de APs ópticos robustos de cardiomiócitos isolados derivados do iPSC e cardiomiócitos nativos (ver Arquivo Suplementar). Usamos VF2.1Cl juntamente com uma plataforma de última geração personalizável para medições de fotometria de célula única. Esses protocolos experimentais foram aprovados pelo comitê de ética do Centro Médico Universitário Göttingen (nº 10/9/15).

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Protocolo

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1. Preparações celulares

NOTA: Os iPSCs humanos utilizados neste protocolo foram derivados de doadores saudáveis e diferenciados em monocamadas utilizando modulação de moléculas pequenas totalmente definidas de técnicas de sinalização e purificação de lactatos, conforme descrito anteriormente12,13,14. os iPSC-CMs foram mantidos a cada 2-3 dias com um meio de cultura descrito abaixo.

  1. Prepare um meio de cultura de meio basal (RPMI 1640) e 2% de suplemento (B27). Armazenar a 4 °C. Use à temperatura ambiente (RT).
  2. Prepare um meio de revestimento de meio basal (RPMI 1640), 2% de suplemento (B27) e 1:2000 INibidor ROCK. Armazenar a 4 °C. Use em RT.
  3. Cubra as tampas de vidro redondo #0 de 10 mm com 150 μL de matriz de membrana de porão livre de fator 1:60 e incubar a 4 °C por 4 h.
    NOTA: A otimização do volume do deslizamento de tampas é necessária para garantir que todo o vidro esteja coberto, mantendo a tensão adequada da superfície para evitar derramamentos. Recomenda-se 150 μL para tampas redondas de 10 mm. Tamanho do lote, tipo de deslizamento de cobertura, volume de deslizamento e tipo de placa de cultura podem ser adequados às necessidades dos experimentadores.
  4. Inicie a dissociação iPSC-CM com um reagente de dissociação celular baseado em EDTA. Certifique-se de que a monocamada esteja completamente separada, lavando suavemente com uma pipeta de 1.000 μL.
  5. Transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e adicione o meio de revestimento de duplo volume. Centrífuga por 10 min a 100 x g.
  6. Resuspense a pelota com um volume desejado (volume de ressuspensão) de meio de revestimento. Conte células manualmente ou eletronicamente.
  7. Selecione a densidade ideal por deslizamento de cobertura (15.000) que permitirá a análise celular isolada mais tarde.
  8. Calcule o volume de suspensão celular 'ativa' (A) necessária para emplacar todas as tampas nesta densidade desejada. Aplique a seguinte fórmula e retire-se em um tubo separado:
    figure-protocol-1
  9. Calcule o volume de meio de revestimento extra (B) necessário para acomodar cada deslizamento de cobertura em um volume desejado. Aplique a seguinte fórmula e adicione o volume resultante ao tubo de suspensão ativa:
    figure-protocol-2
  10. Remova a matriz das manchas e aplique o 'volume de deslizamento de cobertura' da suspensão celular (A+B) em cada deslizamento de cobertura. Resuspensar regularmente no tubo para garantir até mesmo a distribuição celular.
  11. Incubar a 37 °C por 1 h. Encha suavemente o poço com meio de revestimento.
  12. Após 24h, troque mídia com meio de cultura normal e mantenha a cada 2-3 dias.

2. Configuração experimental

  1. Equipar um microscópio de epifluorescência invertido com uma ampliação de 40x, lente de alta abertura numérica (N.A: > 0,75) para realizar experimentos.
  2. Junte um LED branco quente de comutação rápida para a porta de iluminação transmitida do microscópio. Insira um simples filtro vermelho de 660 nm no caminho da luz transmitida.
    NOTA: Esta luz pode ser ativada durante experimentos de fotometria para observar a amostra sem contaminar o sinal fluorescente verde.
  3. Monte uma cabeça LED de 470 nm de comutação rápida para gravação de fotometria. Insira um filtro de excitação 470/40 na porta epifluorescente do microscópio para limpar a luz gerada pelo LED.
    NOTA: Para a quantificação ideal de sinal é recomendado um sistema de iluminação com controle de feedback de alta velocidade da saída óptica.
  4. Insira um cubo de microscópio contendo um divisor de feixe de passagem de 495 nm no carrossel da unidade espelho dentro do microscópio.
  5. Encaixe um braço de detecção contendo um diafragma de campo ajustável na porta de montagem C do microscópio para permitir a seleção da região de interesse.
  6. Separadamente, acasalar um detector de fotomultiplier (PMT) e uma câmera USB no microscópio. Isso formará a base do sistema de detecção de emissões.
  7. Insira um cubo de filtro contendo um divisor de feixe de passagem de 565 nm de comprimento e um filtro de emissão 535/50 na porta PMT. Isso divide a luz de emissão entre os dois detectores.
    NOTA: Uma câmera conectada à porta transmitida do sistema de detecção de emissões pode detectar luz transmitida sob campo brilhante durante todos os experimentos.
  8. Acoplam o PMT a uma fonte de alimentação e um amplificador PMT. Conecte a saída do amplificador PMT a um pino de entrada analógico de um sistema de aquisição de dados.
  9. Filtrar dados analógicos do PMT a 1 kHz ou superior.
  10. Digitalize os dados em uma frequência que seja pelo menos o dobro da maior frequência presente no sinal analógico (2 kHz ou superior) para cumprir os critérios de Nyquist e evitar o aliasing.

3. Carregamento celular com VF2.1Cl

NOTA: Todas as etapas que envolvam este corante devem ser realizadas em condições de baixa luz.

  1. Prepare uma solução de banho de Tyrode (em mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 Glicose, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7,35 e quente a 37 °C.
  2. Prepare uma alíquota de solução de carregamento em um tubo de microcentrifuuge misturando 5 μL de 1.000x VF2.1Cl e 50 μL de solução poloxamer solubilizadora de 20%.
  3. Aplique 5 μL da solução de carregamento a 5 mL de solução de Tyrode aquecida (concentração total de 0,1x de corante) em uma placa de Petri de 20 mm.
    NOTA: A concentração final de corante é de 0,1x. Este é o 1/10sugerido pelo fabricante. Isso conserva recursos, garante citotoxicidade insignificante e, importante, ainda retém sinais ópticos claros de células carregadas com altas relações de sinal a ruído.
  4. Adicione um único deslizamento de tampa iPSC-CM ao prato e incubar a 37 °C por 20 min.
  5. Monte uma câmara de imagem de células vivas aquecidas. Monte no palco do microscópio e preencha com 500 μL de solução fresca de Tyrode.
  6. Lave o deslizamento com a solução de Tyrode fresco a 37 °C.
  7. Aplique cuidadosamente a tampa iPSC-CM na câmara de banho pré-aquecida usando fórceps de ponto fino.
    NOTA: Certifique-se de que a câmara e seu conteúdo estão sempre aquecidos a temperaturas fisiológicas. Se desejar, comece com perfusão contínua da solução aquecida de Tyrode.

4. Estimulação elétrica do campo

NOTA: O acionamento externo do iPSC-CM é opcional, mas útil para a padronização da dinâmica celular e parâmetros experimentais. Aumenta a facilidade de análise e permite a investigação de efeitos dependentes da frequência.

  1. Conecte uma inserção de estimulação com dois eletrodos de platina espaçados 5 mm de distância na câmara de gravação.
  2. Conecte um estimulador externo à inserção de estimulação. Definido para 5 ms pulsos de campo bipolar a 0,5 Hz.
  3. Determine a tensão de estimulação ideal aumentando o estímulo de 1 V para cima. O estímulo limiar é definido como a menor tensão na qual as células começam a se contrair. Aplique tensões cerca de 25% acima deste limite. A faixa normal é entre 1 V e 30 V.
  4. Corrija a frequência de estimulação com o estimulador externo ou ativá-lo com software de aquisição.

5. Aquisição potencial de ação óptica

NOTA: Este protocolo utiliza um software comercial para aquisição e análise.

  1. Visualize os miócitos na vista brightfield usando o caminho de luz transmitido e a câmera USB.
  2. Selecione uma célula isolada e corte firmemente seu caminho óptico com o diafragma de campo garantindo que apenas a luz da célula de interesse seja monitorada.
  3. Ative o amplificador PMT e defina a fonte PMT para 750 V.
  4. Execute o protocolo de estimulação (ver passo 4) juntamente com o software de aquisição e ative simultaneamente a luz de excitação de 470 nm. Este último pode ser feito através de um painel remoto ou automatizado a uma intensidade fixa (sinal TTL).
  5. Ajuste o ganho e o deslocamento do amplificador PMT para garantir que o sinal não satura e seja otimizado para a faixa de detecção do sistema de gravação.
  6. Recorde de 10 varreduras garantindo que potenciais de ação estáveis sejam detectados.
  7. Continue gravando e mova imediatamente o estágio do microscópio para adquirir brevemente o sinal de fundo de uma região desprovida de células. Desligue a luz de excitação.
    NOTA: Este valor de fundo(F offset ) será usado para responder por qualquer fluorescência de fundo.
  8. Se desejar, perfuse localmente perfuse drogas como 1 μM nifedipine para identificar respostas celulares à manipulação farmacológica.
  9. De forma sequencial, repita os passos 5.2-5.7, cada vez selecionando uma nova célula. Troque as tampas se desejar para garantir um alto volume de negócios experimental em uma única sessão.
    NOTA: Os protocolos de carregamento e aquisição de imagens estão descritos na Figura 2.

6. Análise de dados

  1. Abra uma gravação salva com o software de análise e uma média de 10 varreduras contendo potenciais de ação estimulados de uma única célula.
  2. Pegue uma média do sinal da linha de base representando Fdeslocamento e subtraia isso a partir do traço médio.
  3. Calcule ∆F/F0 com a seguinte fórmula (onde F é medido fluorescência e F0 é fluorescência diastólica):
    figure-protocol-3
  4. Identifique a linha de base de rastreamento (diastólica) e a área de interesse (AP) e meça os parâmetros potenciais de ação cardíaca desejados. Isso inclui, mas não se limita ao tempo de decadência para 50% (APD50) e 90% (APD90) de repolarização.
  5. Exporte os dados desta única célula para um software de planilha.
  6. Repita as etapas 6.1 – 6.5 para todas as gravações. Avalie os resultados com testes não pagos adequados ou análises de variância.

figure-protocol-4
Figura 2: Protocolos de carregamento e aquisição de imagens. (A) Gráfico de fluxo do protocolo completo de carregamento VF2.1Cl para iPSC-CMs e cardiomiócitos nativos. (B) Um esquema simplificado de configurações de divisor de feixe (BS) e filtro utilizado neste protocolo para excitação e detecção de emissão de VF2.1Cl em resposta a alterações na tensão transmembrana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

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figure-results-1
Figura 3: Perfis de potencial de ação óptica (AP) de cardiomiócitos nativos isolados e cardiomiócitos pluripotentes induzidos por humanos derivados de células-tronco (iPSC-CM). (A) Ap óptico representativo de um único cardiomiócito murino (centro) com média ± SEM de APD50 e APD90 (n = 7, à direita). (B) Ap óptico representativo de um...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui descrevemos um protocolo básico para adquirir facilmente perfis de AP detalhados de iPSC-CMs isolados adequados para modelagem eletrofisiológica e rastreamento de medicamentos cardíacos. Detectamos APs regulares e robustos de nossos iPSC-CMs pouco semeados, o que sugere a funcionalidade do indicador e a fidelidade metodológica.

Devido ao amplo espectro de metodologias comerciais para reprogramação do iPSC e falta de padronização para protocolos de diferenciação cardíaca, os modelos basead...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cairn Research Ltd apoiou esta publicação cobrindo os custos de produção do arquivo de vídeo.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de reconhecer a Cairn Research Ltd. por sua gentil contribuição financeira que cobria os custos de produção desta publicação. Além disso, agradecemos à Sra. Ines Mueller e à Sra. Stefanie Kestel pelo excelente apoio técnico.

A pesquisa dos autores é apoiada pelo Centro Alemão de Pesquisa Cardiovascular (DZHK), o Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 e sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2067/1- 390729940) e o Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Reagentes
0.25 Tripsina EDTA Gibco 
Suplemento B27Gibco 
CaCl2Carl Roth HN04.2
D(+)-Glicose anidra  BioChemicaITW ReagentsA1422
Soro Fetal Bovino Gibco 10270-106
Kit de Potencial de Membrana FluoVolt Invitrogen F10488
HEPESCarl Roth HN77.4
KClSigma-Aldrich6781.1
LamaninSigma-Aldrich114956-81-9
Matrigel BD354230
NaCl Sigma-Aldrich9265.2
Nifedipina Sigma-Aldrich21829-25-4
Penicilina/EstreptomicinaInvitrogen 15140
ROCK Inibidor Y27632Stemolecule04-0012-10
RPMI 1640 Medium Gibco 
Versene EDTA Gibco 15040033
Equipment
495LP Dichroic Beamsplitter da Chroma Technology
Molecular Devices
Lamínulas circulares, espessura 0Thermo ScientificCB00100RA020MNT0
Digidata 1550BMolecular Devices
Fonte de Alimentação Dual OptoLED Pesquisa de Cairn 
Filtro de Excitação ET470/40x Chroma Technology
ET535/50mChroma Technology
Gravado Neubauer HemacytometerHausser Scientific
Filter Cubes Pesquisa de Cairn 
Microscópio Invertido IX73Olympus 
Pesquisa MonoLEDCairn 
Adaptadores Multiportas Pesquisa de Cairn 
Estimulador de Células MyopacerObturador IonOptix
Optomask Pesquisa de Cairn 
Controlador de Sistema OptoscanCairn Research 
Plataforma de Temperatura Controlada PH-1  Warner Instruments 
Detector Fotomultiplicador Pesquisa de Cairn 
Inserção de Amplificador PMTCairn Research 
Inserção de Fornecimento PMTCairn Research 
Câmara de Banho Aberta RC-26G Warner Instruments 
Adaptador de Palco SA-OLY/2AL Olympus 
T565lpxr Dichroic Beamsplitter Chroma Technology
T660lpxr Dichroic BeamsplitterDuplo Chroma Technology
TC-20 Objetiva Eletrônica
NPI UPLFLN 40X Olympus 
Câmera colorida USB 3.0Fonte
Software
Clampex 11.1Molecular Devices 
Clampfit 11.1Molecular Devices 
Captura de IC 2.4 Fonte de imagem 
Bloco de gráficosPrism 8
252000561750404461870010Amplificador Axopatch 200B Controlador de Temperatura de Canal de Imagem

Referências

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