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Immunology and Infection

Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

Published: April 30, 2021 doi: 10.3791/61895
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 3,4, 1
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

Summary

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

Abstract

Les modèles de maladies complexes exigent des outils de pointe capables de fournir des informations physiologiquement et pathologiquement pertinentes et exploitables, et de dévoiler des processus autrement invisibles. Des tests cellulaires avancés imitant étroitement le paysage in vivo s’imposent comme de nouvelles façons de visualiser et de mesurer l’interaction bidirectionnelle tumeur-hôte influençant la progression du cancer. Nous décrivons ici deux protocoles polyvalents pour recréer des co-cultures 2D et 3D hautement contrôlables dans des microdispositifs, imitant la complexité du microenvironnement tumoral (TME), sous immunosurveillance naturelle et induite par la thérapie. Dans la section 1, un cadre expérimental est fourni pour surveiller la diaphonie entre les cellules tumorales adhérentes et les populations immunitaires flottantes, par microscopie accélérée à champ clair. En tant que scénario applicatif, nous analysons les effets des traitements anticancéreux, tels que les inducteurs immunogènes de la mort des cellules cancéreuses sur le recrutement et l’activation des cellules immunitaires. Dans la section 2, les microenvironnements 3D immunitaires contre les tumeurs sont assemblés dans une configuration compétitive. L’infiltration immunitaire différentielle est surveillée par des instantanés de fluorescence jusqu’à 72 h, afin d’évaluer les stratégies thérapeutiques combinées. Dans les deux contextes, les étapes de traitement de l’image sont illustrées pour extraire une pléthore de paramètres des cellules immunitaires (par exemple, la migration et l’interaction des cellules immunitaires, la réponse aux agents thérapeutiques). Ces méthodes simples et puissantes peuvent être adaptées pour simuler la complexité du TME englobant l’hétérogénéité et la plasticité des sous-types de cellules cancéreuses, stromales et immunitaires, ainsi que leurs interactions réciproques en tant que moteurs de l’évolution du cancer. La conformité de ces technologies en évolution rapide avec l’imagerie à haut contenu de cellules vivantes peut conduire à la génération de grands ensembles de données informatives, ce qui pose de nouveaux défis. En effet, le triangle ''co-cultures/microscopie/analyse avancée de données'' ouvre la voie à un paramétrage précis du problème qui peut aider à des protocoles thérapeutiques sur mesure. Nous nous attendons à ce que l’intégration future de l’immunité contre le cancer sur puce avec l’intelligence artificielle pour le traitement à haut débit mette en synergie un grand pas en avant dans l’exploitation des capacités en tant qu’outils prédictifs et précliniques pour l’oncologie de précision et personnalisée.

Introduction

L’évolution des différentes branches de la médecine en tant que disciplines expérimentales a dépendu de la capacité à manipuler la population cellulaire et les fonctions des organes dans des conditions contrôlées1. Une telle capacité a ses racines dans la disponibilité de modèles mesurables capables de récapituler les processus qui se produisent dans notre corps.

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire 2, la biologie du cancer doit tirer parti des modèles in vitro et informatiques émergents pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié 2,3.

Le microenvironnement tumoral4 (TME) est un tissu complexe où les cellules cancéreuses interagissent continuellement et co-évoluent dynamiquement avec les autres composants cellulaires (cellules immunitaires, stromales et endothéliales) et non cellulaires (matrice extracellulaire, ECM). La nature dynamique de ce paysage complexe dicte si les cellules immunitaires jouent le rôle d’amies ou d’ennemies des cellules malignes, affectant ainsi fortement la progression de la maladie et la réponse au traitement. De nos jours, de grands efforts de la part des onco-immunologistes, des bioinformaticiens et des experts en biologie des systèmes convergent pour aborder la signification clinique de l’hétérogénéité du cancer 5,6, soit dans l’espace (c’est-à-dire dans des régions tumorales distinctes) et dans le temps (c’est-à-dire à des stades de progression tumorale distincts)5,6, et pour caractériser le phénotype et la fonction du cancer et des cellules immunitaires au niveau d’une seule cellule. À titre d’exemple de cette synergie, des techniques avancées de vision par ordinateur sont maintenant couramment utilisées pour la cartographie spatiale de l’infiltrat immunitaire dans les échantillons histologiques 7,8.

Sur le front des modèles expérimentaux, des études animales et des méthodes in vitro traditionnelles, les progrès de la microfluidique et des techniques de co-culture donnent accès à différentes classes de modèles cellulaires micro-modifiés tels que les organoïdes, les systèmes microphysiologiques 9,10,11 (MPS) et les organes sur puce12,13,14 (OOC). Ils partagent le trait commun de zoomer sur la vue d’ensemble des écosystèmes cellulaires et d’élargir le potentiel in vitro de contrôle des facteurs microenvironnementaux tout en exploitant la microscopie à haut contenu15 et les approches de traitement d’images.

De nos jours, les systèmes MPS et OOC de pointe ont commencé à inclure des aspects immunologiques, incorporant différents sous-types de cellules immunitaires dans les tissus existants et les co-cultures, afin d’explorer et de mesurer une variété de processus tels que les maladies inflammatoires, la cicatrisation des plaies, l’immunité muqueuse et la réponse aux toxines ou aux produits alimentaires quotidiens16. Les modèles TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, également intégrés à des microvaisseaux perfusables 18,19,20,21, ont été développés pour étudier les interactions dépendantes du type cellulaire, les perturbations physiques et chimiques et l’activité cytotoxique des lymphocytes infiltrants22, ainsi que des agents immunomodulateurs cliniquement pertinents23.

Ici, nous fournissons des protocoles polyvalents, allant du chargement de cellules dans des puces à des outils de traitement d’image, pour exploiter des co-cultures microfluidiques avancées contre les tumeurs dans des paramètres 2D (section 1) et 3D (section 2)16, compatibles avec la surveillance et la visualisation dynamiques et multiparamétriques24 des fonctions cellulaires. Ceci est réalisé en maintenant la facilité d’utilisation et la flexibilité à la fois dans la gestion des échantillons et l’analyse des données, en tirant parti du logiciel gratuit Fidji et de ses boîtes à outils25,26.

Le dispositif microfluidique, décrit à la section 1, est conçu pour effectuer des co-cultures 2D de cancer adhérent et de cellules immunitaires flottantes. Cette plateforme a été validée pour la mesure in vitro du comportement des cellules immunitaires en présence de mutations génétiques27 et/ou d’immunodéficiences28. Ici, nous illustrons les étapes de suivi des cellules immunitaires dans des images en champ clair en accéléré, en exploitant une méthode semi-automatique basée sur Trackmate (un plugin implémenté dans le logiciel Fidji). Cette procédure permet d’extraire des descripteurs cinématiques de la migration immunitaire 29 et de la réponse (c’est-à-dire des temps d’interaction) pour cibler les cellules cancéreuses, traitées ou non avec des inducteurs immunogènes de mort cellulaire27.

Il est important de noter que ces paramètres, extraits d’images de séries chronologiques, peuvent être traités avec des machines mathématiques avancées. À titre d’exemple de la potentialité de cette approche, nos groupes ont récemment publié une analyse basée sur des méthodes mathématiques issues des processus stochastiques et de la mécanique statistique pour modéliser les propriétés du réseau cellulaire et fournir une description paramétrée du comportement des cellules immunitaires (c.-à-d. marche aléatoire biaisée ou non corrélée, mouvement hautement coordonnéou non 30,31).

Le réglage 3D, fourni dans la deuxième section, est basé sur un protocole de co-culture pour recréer des TME immunocompétents plus complexes intégrés dans deux régions de gel avec différentes combinaisons de types de cellules et de médicaments de manière compétitive. Ici, les étapes de traitement d’images sont décrites pour mesurer, à différents moments, l’infiltration de cellules immunitaires colorées dans des cellules de mélanome A375M humaines cultivées au sein de Matrigel, pour évaluer des combinaisons d’agents antitumoraux32. La lignée A375M, une lignée cellulaire dérivée de l’A375P caractérisée par un phénotype hautement métastatique a été choisie pour évaluer leur capacité métastatique en présence de cellules immunitaires32.

Les modèles décrits peuvent être entièrement conformes à différentes sources cellulaires (lignées cellulaires immortalisées ou primaires murines et humaines, organoïdes, xénogreffes, entre autres). Dans des études récentes de notre laboratoire, en combinant la microscopie vidéo à haut contenu avec l’analyse d’images, la disposition 3D compétitive a été appliquée pour étudier: i) une réponse immunitaire antitumorale (cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps, ADCC) et disséquer le rôle des fibroblastes dans la résistance au traitement par trastuzumab dans les modèles sur puce de cancer du sein HER2+ 33; ii) l’action des cellules myéloïdes (c’est-à-dire des macrophages associés au cancer) dans les mécanismes d’évasion tumorale et de recrutement des lymphocytes T34; iii) l’efficacité des régimes immunothérapeutiques, spécifiquement basés sur des cellules dendritiques conditionnées par l α’interféron (IFN-DC), cultivées avec des cellules cancéreuses du côlon traitées par des médicaments dans des matrices de collagène, et pour évaluer l’efficacité du mouvement et les événements de phagocytose qui en découlent35; iv) la migration chimiotactique des éosinophiles dérivés de la moelle osseuse vers les cellules de mélanome traitées ou non traitées par IL-3336.

Ces modèles avancés pourraient servir de fenêtres d’observation pour comprendre le rôle de la contexture immunitaire dans les métastases cancéreuses et les mécanismes de résistance, mais des efforts sont nécessaires pour traduire les résultats dans les cliniques, comblant ainsi l’écart avec la recherche fondamentale37.

En tant que scénario émergent, l’exploitation de la puissance de la microscopie automatisée à haut contenu couplée à l’utilisation de microsystèmes plus pertinents sur le plan physiologique ouvre de nouveaux défis potentiels pour la manipulation, le traitement et l’interprétation de centaines, voire de milliers, de gigaoctets de données multiparamétriques, qui peuvent être générées à partir d’une seule campagne expérimentale. Cela implique un lien direct entre les expériences OOC et les algorithmes basés sur l’intelligence artificielle 38,39,40,41,42 (IA) à la fois pour l’analyse automatisée avancée et la génération de fonctionnalités qui peuvent alimenter à leur tour des modèles in silico d’interaction cancer-immunité 43, avec de nouvelles applications passionnantes à l’horizon, telles que le développement de tests prédictifs de dépistage de médicaments 44.

Un flux d’efforts sans cesse croissant est axé sur la conception de modèles de maladies conjointement avec l’optimisation des stratégies pour mettre en œuvre les criblages de perturbation à grande échelle avec des lectures multi-omiques unicellulaires. Cela contribuera sans aucun doute au développement et, espérons-le, à la mise en œuvre clinique, accompagnée d’un degré approprié de normalisation des méthodes, d’une approche systématique onco-immunologie sur puce pour acquérir de nouvelles connaissances sur les troubles immunitaires et les mécanismes de dissémination du cancer.

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Protocol

1. Conception de puces pour les co-cultures 2D de cellules adhérentes et flottantes

REMARQUE : La disposition de co-culture 2D (Figure 1A-C) est caractérisée par trois chambres (100 μm de haut) reliées entre elles par deux ensembles de réseaux de microcanaux (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). La chambre intermédiaire forme deux compartiments fermés en cul-de-sac qui bloquent les cellules immunitaires flottantes débordant dans le site tumoral lors de l’étape de chargement 2.5. Ce type d’appareil est utile pour les mesures bidimensionnelles en temps réel de la motilité unicellulaire (adhérente ou flottante) et des interactions cellule-cellule 16,27,28,30,31. Une étude typique de migration cellulaire (menée de plusieurs heures à plusieurs jours) combine la microscopie de cellules vivantes avec des algorithmes de traitement d’images45, afin de traduire les séquences d’images acquises en caractéristiques numériques25. Sur la base des schémas migratoires, plusieurs indicateurs biophysiques peuvent être estimés, tels que le déplacement et la vitesse des cellules, ainsi que la durée des interactions entre les cellules immunitaires et les cellules cibles24.

  1. Préparation des cellules cancéreuses et PBMC
    1. Culture de cellules cancéreuses
      REMARQUE : MDA-MB-231 triple négatif [récepteur des œstrogènes (ER)-, récepteur de la progestérone (PR)-, et récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2)-] les cellules d’adénocarcinome du sein humain sont couramment cultivées dans un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 UI mL−1 de sel de sodium de pénicilline G et 100 μg de sulfate de streptomycine (milieu de croissance), dans des conditions de culture standard (37 °C et 5 % de CO2).
      1. Pour optimiser la croissance de la culture cellulaire, plaquez les cellules MDA-MB-231 dans des flacons de 75 cm2 à une densité de 1 × 106 cellules mL-1 dans 12 à 15 mL de milieu de croissance.
      2. Lorsque les cellules atteignent les 75-80% de la confluence, jeter le milieu de croissance, laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée pour éliminer complètement le FBS, puis les détacher avec de la trypsine préchauffée (1 à 2 min à 37 ° C).
      3. Ajouter un milieu de croissance pour inactiver l’activité enzymatique de la trypsine et recueillir les cellules détachées. Laver les cellules deux fois pendant 5 min à 1 100 x g à température ambiante (RT).
      4. Compter les cellules d’une lame de comptage de cellules au moyen d’un test d’exclusion de colorant Trypan Blue, puis les réensemencer soit pour une culture d’entretien (pour pas plus de 6 passages de décongélation), soit pour des procédures expérimentales.
      5. Pour les expériences microfluidiques, ensemencer 1 × 10 6 cellules dans des plaques à6 puits dans 3 mL de milieu de croissance et traiter avec 25 μM de doxorubicine (DOXO) ou un volume égal de solvant DOXO (PBS) comme témoin.
      6. Quatre à 6 heures après, lavez les cellules traitées par DOXO deux fois avec du PBS préchauffé pendant 5 minutes à 1 100 x g à TA.
      7. Compter les cellules témoins traitées par DOXO et PBS comme ci-dessus (voir étape 1.1.1.5) et mettre la co-culture avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) dans des dispositifs microfluidiques.
    2. Isolement PBMC
      1. Prélever du sang total veineux (10 ml environ) de volontaires sains dans des flacons héparinisés et mélanger délicatement en retournant le tube 2 à 4 fois47.
      2. Diluer le sang 1:1 avec du PBS et déposer plus de 10 mL de Lymphoprep à gradient de densité dans un tube de 50 mL.
        REMARQUE: Assurez-vous de faire la stratification très doucement et lentement pour laisser le sang et Lymphoprep former deux couches distinctes.
      3. Tubes à centrifuger pendant 30 minutes à 400 x g à 4 °C dans un godet pivotant sans freins. Quatre couches distinctes se formeront : (i) du plasma au sommet, (ii) une couche blanche et trouble contenant des PBMC, (iii) du Lymphoprep, et (iv) une pastille d’érythrocytes et de granulocytes.
      4. Aspirer doucement les PBMC avec une pipette de 2 ml et les remettre immédiatement en suspension dans un milieu de croissance chaud (le même que celui utilisé à l’étape 1.1.1) et laver deux fois pendant 5 min à 1 100 x g à TA.
      5. Compter les PBMC granulés comme ci-dessus (voir étape 1.1.1.5) et les utiliser pour les procédures expérimentales ou les congeler pour les entreposer à long terme.
  2. Placage des cellules dans des puces 2D
    REMARQUE: Les PBMC ne sont pas tachés dans ce protocole. Pour caractériser des phénotypes spécifiques sur puce, les sous-populations de cellules immunitaires peuvent être isolées par sélection de billes immunomagnétiques, colorées avec des trackers cellulaires fluorescents, remélangées avec la fraction restante non marquée, et donc confrontées à des cellules cancéreuses cibles, comme indiqué dans les expériences sur puce, décrites dans Vacchelli et al.27, et dans Racioppi et al.34.
    1. Avant de commencer les expériences de co-culture et pour faciliter l’ajout de réactifs, activer les puces stockées par un traitement au plasma d’oxygène pendant quelques secondes. Remplissez immédiatement les réservoirs avec de l’eau désionisée ou du PBS pour maintenir les surfaces PDMS (polydiméthylsiloxane) hydrophiles jusqu’aux étapes de placage.
      REMARQUE: Le PDMS est intrinsèquement hydrophobe, ce qui peut entraîner des difficultés de fonctionnement et le piégeage des bulles d’air dans les microcanaux. Voir l’étape 7 du fichier supplémentaire fournissant des détails sur l’activation du plasma d’oxygène.
    2. Stériliser sous une armoire UV pendant 20 min, laver 2-3 fois avec du PBS frais, puis incuber avec un milieu de culture pendant 1 h. Conservez les copeaux dans l’incubateur jusqu’à ce que les étapes de placage soient effectuées.
    3. Retirer l’excès de milieu des six réservoirs. Veillez à ne pas aspirer les médias des principales chambres de culture.
    4. Appliquer lentement 1 × 105 cellules cancéreuses remises en suspension dans 10 à 20 μL de milieu de croissance dans le réservoir supérieur gauche, puis dans le puits inférieur (figure 1A, réservoirs 1 et 2). Attendez 5 minutes pour laisser les cellules adhérer dans la chambre tumorale. Certaines cellules vont se déposer et se fixer dans les réservoirs.
      REMARQUE: Insérez la suspension cellulaire à côté des ouvertures du canal. Cette procédure est appliquée aux cellules cancéreuses MDA-MB-231, d’autres lignées nécessiteront une optimisation de la densité cellulaire. Pour améliorer la fixation des cellules cancéreuses, une fonctionnalisation du revêtement des surfaces (par exemple, poly-L-lysine, fibronectine) peut être effectuée. Veuillez vous référer aux protocoles précédemment publiés pour les étapes de revêtement16, 48,49,50.
    5. Sur le côté droit, pipeter doucement 1 × 106 6 PBMC remis en suspension dans 50 μL de milieu de croissance dans les puits 3 et 4 (voir figure 1A, réservoirs 3 et 4).
      REMARQUE: Après l’écoulement, PBMC se répartira dans la chambre intermédiaire créant un « front », qui représente le point de départ de l’expérience.
    6. Remplissez les six réservoirs avec jusqu’à 100-150 μL de milieu de croissance. Au microscope, vérifier que les cellules se sont réparties correctement dans les compartiments de culture, comme illustré à la figure 1D-E. Les volumes finaux peuvent varier en fonction de la taille des réservoirs. Ajustez les volumes pour qu’ils soient égaux dans tous les puits.
    7. Replacez les puces dans l’incubateur pendant environ 1 h pour stabiliser le système avant l’enregistrement accéléré. Ajouter un milieu frais tous les 3 jours, car il peut être soumis à des pertes par évaporation.
      REMARQUE: Le système est compatible avec l’analyse des cellules vivantes / mortes et le profilage dynamique de la sécrétion de cytokines multiplex à partir de milieux conditionnés. Pour les analyses de chimiokines, jusqu’à 200-250 μL aliquotes de surnageants peuvent être accessibles en collectant des milieux dans les deux réservoirs de chaque compartiment. Les tests classiques de profilage des cytokines ELISA et Luminex nécessitent environ 50 μL de surnageants. Veuillez consulter 51,52 exemples d’études d’autres laboratoires effectuant le profilage des cytokines sur des modèles OOC.
  3. Acquisition accélérée de cellules cancéreuses et immunitaires non marquées
    REMARQUE: En règle générale, 3 puces sont disposées sur une seule lame de microscope (voir Figure 1A pour la puce 2D et Figure 4B pour la puce 3D). En utilisant des porte-étapes allouant 4 lames, les co-cultures peuvent être surveillées par microscopie automatisée à haute teneur pour analyser de grands lots de conditions expérimentales. Les puces peuvent être facilement montées sur des lames d’une épaisseur égale à 1 mm ou 170 microns (lamelles de couverture en plastique ou en verre, multi-puits optiques à 6 puits) pour l’imagerie confocale haute résolution.
    1. Enregistrez des séries d’images en fond clair de cellules non marquées au moyen d’une installation de microscopie vidéo équipée d’un système d’incubation.
      REMARQUE: Ici, des ensembles de données de séries chronologiques (fenêtre temporelle: 48 h, fréquence d’images: 2 min) ont été acquis avec un microscope à fluorescence, équipé d’un objectif 4x et CMOS 1,3 million de pixels, optimisés pour tenir dans un incubateur de culture cellulaire standard.
    2. Réchauffer le microscope pendant au moins 2 h pour l’équilibrer à 37 °C et 5% de CO2 avant de commencer l’acquisition.
    3. Sélectionnez la fenêtre d’observation en centrant le réseau de microcanaux entre la tumeur et le compartiment central. Cela permet de visualiser la dynamique de l’infiltration immunitaire et les interactions au sein de la région dans laquelle les cellules cancéreuses sont ensemencées.
    4. Ajustez l’intensité de l’éclairage et le foyer du cancer et des cellules immunitaires.
    5. Pour lancer l’acquisition time-lapse, optimisez la fréquence d’images et la durée en fonction de l’expérience et du type de cellule à l’étude.
      REMARQUE: Les conditions d’imagerie doivent être optimisées pour éviter une exposition excessive à la photo tout en maintenant un bon rapport signal sur bruit (SNR). Comme les cellules immunitaires sont très mobiles, la fréquence d’acquisition doit être suffisamment élevée pour suivre le processus dynamique d’intérêt et permettre un suivi facile53. Un compromis devrait être trouvé entre l’algorithme de suivi, la compatibilité avec la taille de l’ensemble de données résultant et la viabilité, la densité et la motilité des cellules observées.
    6. À la fin du time-lapse, utilisez la fonction Import Image Sequence et Save as du logiciel ImageJ pour convertir le jeu de données d’images dans un fichier vidéo non compressé de 25 ips.
      REMARQUE: Le fichier vidéo généré est maintenant prêt pour l’analyse de suivi cellulaire. Ici, des images RVB (1280x1024 pixels) ont été collectées avec une résolution spatiale de 1,33 μm/pixel. Un film d’une durée de 24 heures (pile de 3,5 Go) d’un seul champ de vision (FOV) se compose de 720 images pour chaque condition.
  4. Analyse des données : extraction semi-automatique des traces immunitaires non marquées par Trackmate
    REMARQUE: Ici, l’analyse de la motilité immunitaire dans les images time-lapse 2D non étiquetées est effectuée à l’aide de TrackMate54, une boîte à outils open source disponible dans le bundle logiciel Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Plusieurs algorithmes sont fournis pour effectuer un suivi automatisé à une seule particule55(SPT) de structures ponctuelles. Ils ont été appliqués efficacement aux images fluorescentes, où les objets sont lumineux sur un fond sombre avec un rapport signaleur d’impact élevé (c.-à-d. taches fluorescentes à sous-résolution, vésicules de circulation marquées, noyaux)1,25,56,57,58. Le SPT est principalement basé sur deux étapes séquentielles. Tout d’abord, les objets sont localisés avec des positions identifiées dans plusieurs trames (segmentation), comme schématisé dansGraphique 2. Dans la deuxième étape (liaison de particules), les taches détectées sont liées sur des images consécutives pour estimer le mouvement et reconstruire leurs trajectoires, sous la forme d’une piste (Graphique 3). Les entités numériques peuvent être calculées à partir de chaque tableau de coordonnées X, Y, Z extrait au fil du temps. La documentation détaillée est signalée dans54ainsi qu’en ligne (http://imagej.net/TrackMate), en suivant le tutoriel Prise en main de TrackMate. La précision du processus peut être inspectée immédiatement, en gérant une interface utilisateur graphique intuitive (interface graphique de type assistant) qui permet aux utilisateurs, à chaque étape, de réajuster les paramètres. La partie suivante explique brièvement comment utiliser Trackmate pour les étapes de traitement et de quantification d’images, appliquées aux images en lumière visible :
    1. Faites glisser et déposez la pile vidéo / image à temps plein sur la barre d’outils Fidji.
    2. Configuration de la pile d’étalonnage (Figure 2A).
      1. Vérifiez la dimensionnalité et attribuez les propriétés de l’image en sélectionnant Propriétés de l’image> Propriétés. Remplissez les zones Unité de longueur, Dimensions des pixels et Intervalle d’image.
        REMARQUE : Pour effectuer l’étalonnage, utilisez la longueur connue des microcanaux (500 μm, figure 1C) et divisez par la longueur mesurée correspondante en pixels. Pour les séries chronologiques 2D, assurez-vous d’échanger le champ Z/T entrant 1 comme z-slice et le nombre correct d’images vidéo. S’ils ne sont pas réalisés, les résultats quantitatifs et les paramètres de Trackmate seront rapportés en unités de pixels et en périodes.
    3. Pré-traitement des images.
      1. Pour améliorer la discrimination correcte des cellules immunitaires à partir d’un arrière-plan bruyant, pré-traitez les images en champ clair pour compenser les artefacts. Assurez-vous que les jeux de données sont constitués d’images TIFF 8 bits (plage de luminosité : 0-255).
        REMARQUE: Un éclairage inégal, un faible rapport signal/bruit et une contamination par de petites particules de débris dans les images en lumière visible pourraient compromettre le succès d’un processus de suivi cellulaire. Ici, les jeux de données de séries chronologiques sont prétraités par soustraction d’arrière-plan, fonction de réglage de la luminosité / contraste et par soustraction locale d’une image gaussienne des images originales. Il existe d’autres boîtes à outils d’analyse différentes disponibles dans ImageJ pour le traitement et la segmentation d’images à contraste de phase ou en fond clair, y compris le seuil de gradient empirique (EGT)59.
    4. Premier panneau d’étalonnage (figure 2A)
      1. Avec la pile d’images sélectionnée, démarrez Trackmate (Plugins>Tracking).  Réviser/confirmer la dimensionnalité et la fenêtre temporelle des données (c.-à-d. largeur en pixels et intervalle de trame).
        REMARQUE: TrackMate lit automatiquement dans la zone de propriétés de l’image pour donner les résultats finaux de suivi en unités physiques calibrées (c’est-à-dire μm et minutes).
      2. Définissez une région d’intérêt pour calculer l’extraction des pistes immunitaires, en insérant manuellement des valeurs ou en dessinant une zone fermée sur l’image active, puis en appuyant sur le bouton Actualiser la source. Pour extraire les voies globales de migration immunitaire, sélectionnez des régions rectangulaires respectivement sur le côté droit des microcanaux (chambre centrale, Figure 1E) et sur la gauche (chambre tumorale, Figure 1D). Pour analyser les interactions entre le cancer et les points chauds immunitaires, dessinez des sous-régions circulaires à l’aide des outils de retour sur investissement (allez à Modifier → Sélection → Spécifier).
        REMARQUE: Lorsque vous exécutez pour la première fois cette boîte à outils sur une nouvelle application biologique, passez le temps nécessaire à optimiser les paramètres pour reconstruire les pistes.
        NOTE: Effectuer un suivi manuel des trajectoires des cellules (environ 50-100 cellules) pour trouver empiriquement la bonne configuration et ensuite valider comme référence la fiabilité de l’extraction automatique des mouvements. De plus, travaillez d’abord sur une zone plus petite pour vérifier facilement la précision des paramètres choisis.
    5. Étape de détection des points immunitaires (Figure 2B)
      1. Sélectionnez le détecteur Laplacien de Gauss (LoG) par défaut. Le détecteur LoG permet de trouver des objets brillants, ressemblant à des blobs et arrondis et d’appliquer un filtre laplacien de gaussien sur l’image réglée pour des tailles de points intermédiaires (5 à 20 pixels de diamètre).
      2. Dans Diamètre estimé du blob (ici, 10-13 μm), entrez une valeur légèrement supérieure à la taille du spot attendue. Augmentez la valeur du seuil (ici de 1 à 3 μm) jusqu’à ce que les taches d’arrière-plan parasites supplémentaires soient réduites, éventuellement sans supprimer les caractéristiques de l’objet. Les détections inférieures à la valeur seuil (basées sur une mesure de qualité) seront éliminées de l’analyse ultérieure. Cochez la case du filtre médian et de la localisation des sous-pixels pour améliorer la qualité de la détection des taches.
      3. Utilisez le bouton Aperçu pour afficher et inspecter rapidement les cellules immunitaires identifiées superposées sur les images par des cercles de couleur magenta.
        REMARQUE: Les erreurs lors de la détection auront un impact considérable sur le processus de liaison. D’autres détections indésirables peuvent être corrigées dans les menus suivants par des filtres définis par l’utilisateur (c’est-à-dire par intensité, taille ou position du spot).
    6. Une fois satisfait des sélections, appuyez sur Suivant.
      REMARQUE : Ces paramètres peuvent varier en fonction de la configuration expérimentale et des modalités d’imagerie d’acquisition (p. ex., FOV, grossissement objectif, images en fond clair ou fluorescentes), du type de cellule (cellules adhérentes ou flottantes), de la motilité lente ou rapide, du type de comportement cellulaire (en interaction ou non) et de la densité faible/moyenne/élevée dans la zone d’observation.
    7. Continuez et ignorez le menu Initialing (Seuil initial). Sélectionnez la fenêtre Hyperstack Displayer.
    8. Définissez des filtres sur le panneau Spots (Figure 2C).
      1. Sélectionnez : Couleur uniforme. Des filtres, comme le montre la figure 2C, peuvent être ajoutés pour conserver les points étiquetés avec des valeurs de caractéristique, affichées dans un histogramme, au-dessus ou au-dessous d’un seuil réversible.
    9. Étape de sélection du tracker (Figure 3A). Choisissez le tracker LAP simple, comme algorithme de liaison de particules demandant trois champs à remplir (dans ce cas, « Distance maximale de liaison »: 30-50 μm, « Distance maximale de fermeture de l’écart »: 25-50 μm, « Écart maximal de fermeture de l’écart »: 4-6). Ce détecteur gère les événements de réduction des lacunes, avec un calcul de liaison des coûts uniquement basé sur leur distance respective.
      REMARQUE : La distance de liaison maximale autorisée limite la plage de recherche spatiale pour les points correspondants candidats, correspondant au déplacement maximal autorisé parcouru entre deux images suivantes (Figure 3D).
      1. Fournir des valeurs plus élevées de déplacement maximal lorsque la fragmentation des traces de particules très mobiles est remarquée.
        Remarque : Deux liaisons ne seront pas connectées si le mouvement image à image est plus grand que la valeur de distance maximale donnée. Si les segments relient mal deux cellules différentes, diminuez la valeur du déplacement maximal.
      2. Essayez de reconnecter les points manquants, en faisant varier les valeurs de « la distance maximale pour la fermeture de l’espace » et « l’écart maximal de l’image ».
        Remarque : Ces paramètres traitent des événements de fermeture d’écart dans les trames non adjacentes. La disparition des taches peut se produire pour certaines images (p. ex., particules floues, cellules sortant et dans le champ de vision, échecs de segmentation dans une image bruyante).
        REMARQUE: Pour gérer les événements de division ou de fusion, optez pour LAP linker comme détecteur qui introduit des pénalités de matrice de coûts de liaison.
    10. Cliquez sur Suivant pour exécuter le calcul de suivi. Appuyez sur Suivant.
    11. Panneau Filtrage des pistes (Figure 3B). Changez la couleur des chemins immunitaires en sélectionnant, dans le menu déroulant, « ID de piste » ou d’autres fonctionnalités de piste. À ce stade, choisissez éventuellement de définir des filtres interactifs fonctionnels, afin d’améliorer la qualité du résultat et de revoir la procédure.
      REMARQUE: Les taches parasites proviennent du bruit dans l’image et de la perte de qualité des caractéristiques. Cela générera des segments courts tandis que les cellules d’intérêt peuvent être suivies sur de nombreuses images.
      1. Pour supprimer les chemins courts, essayez de filtrer en fonction du nombre de taches qu’ils contiennent. En outre, triez les pistes à l’aide d’une combinaison d’options telles que le déplacement de piste, la durée de la piste ou la vitesse minimale/moyenne/maximale pour exclure les pistes fausses ou indésirables (avec moins d’images par rapport à la durée totale du laps de temps ou impliquant des particules sales ou non mobiles) du post-traitement ultérieur.
        REMARQUE: Le choix des filtres peut varier en fonction de l’application spécifique et du système biologique.
    12. Examinez toutes les pistes de l’interface Options d’affichage, faites défiler le temps et vérifiez la précision des pistes correspondant aux chemins de migration des cellules. Le menu déroulant fournit des codes de couleur pour les points et les chemins pour faciliter la visualisation et le filtrage selon plusieurs modalités (par exemple, paramètres cinétiques, intensité, position temporelle ou spatiale).
      REMARQUE: Pour le suivi de cultures à haute densité ou de cellules à forte mobilité, augmentez la fréquence d’acquisition en minimisant le déplacement des cellules dans des intervalles de temps consécutifs.
    13. Correction manuelle des erreurs de segmentation et de liaison (Figure 3E).
      1. Pour améliorer encore la qualité des résultats, modifiez manuellement les taches (particules de débris, cellules stationnaires) et supprimez les traces erronées dérivant des limites tumorales détectées lors de l’analyse des ROI de l’interaction tumorale-immunité.
      2. Tout d’abord, sélectionnez l’outil TrackMate dans la barre d’outils ImageJ. Pour éliminer un spot existant dans toute la pile, appuyez sur Maj et créez par le curseur de la souris un masque ROI sur le point cible (édité dans un cercle vert), puis appuyez sur la touche SUPPR.
      3. Pour ajouter un nouveau spot (en cas de pistes manquantes dues à la disparition de spots), appuyez sur la touche A, en plaçant la souris à l’emplacement pointé. Répétez le processus de calcul de liaison de pistes après cette étape.
    14. Lorsque vous êtes satisfait, sélectionnez Analyse dans le panneau Options d’affichage pour générer trois fichiers texte (Figure 3C et 3F). Le tableau dans « Spots in tracks statistics » fournit les coordonnées spatio-temporelles des taches immunitaires (positions X-Y-Z des cellules étiquetées avec le cadre associé et le numéro de piste). Les « Liens dans les statistiques des pistes » et les « Statistiques de piste » contiennent des informations relatives aux pistes: durées des pistes, nombre de lacunes ou de points détectés, initiale de la piste et stop-frame, etc. Enregistrez et exportez pour chaque jeu de données.
      REMARQUE: Lorsque vous cliquez sur une ligne dans les fenêtres de résultats, le spot, le lien ou la piste respectif est activé dans la vidéo time-lapse pour une inspection visuelle. Répétez les étapes de filtrage pour sélectionner/supprimer des pistes. Toutes les données exportées à l’avenir seront mises à jour. CONSEIL : Les valeurs de suivi initial et stop-frame et de durée de piste peuvent être exploitées pour calculer les temps de contact entre le cancer et les cellules immunitaires lors du traitement des ROI d’interaction.
    15. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour générer un fichier XML résultant contenant toutes les valeurs des paramètres, le chemin d’accès aux images et les positions ponctuelles dans le temps. La commande ''Load TrackMate'' (Plugins> Tracking) restaure l’ensemble de la session de processus pour chaque fichier vidéo individuellement.
    16. Accédez au dernier panneau de l’interface graphique appelé Sélectionner une action. Dans la liste, utilisez la fonction de superposition de capture> d’exécution pour produire une vidéo avec des pistes superposées. CONSEIL : L’option « Tracer les points N en fonction du temps » peut être utilisée pour calculer la densité spatiale des cellules immunitaires dans un retour sur investissement (Figure 6B, panneau de droite).
    17. Analyse post-traitement et statistiques de migration
      1. Analyser les données de position brutes directement dans Trackmate ou exporter les données pour calculer des paramètres cinétiques complets29 (c.-à-d. longueur totale de la trajectoire, distance euclidienne, rapport de confinement, déplacement quadratique moyen56, vitesse moyenne ou instantanée de la trajectoire, coefficient d’arrêt, distribution des angles de migration, indice de migration vers l’avant, vitesse moyenne en ligne droite) pour classer le comportement de migration des cellules immunitaires (p. ex., mouvement dirigé ou diffusif30, 31) et la réponse aux cellules cancéreuses cibles (p. ex. traitées vs témoins).
        REMARQUE : D’autres plug-ins utiles tels que L’outil de chimiotaxie et de migration (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) fournissent divers graphiques (par exemple, des diagrammes de rose ou de secteurs, tels que illustrés à la figure 6) et des tests statistiques pour une analyse et une visualisation avancées des données expérimentales de migration et de chimiotaxie. La combinaison d’algorithmes de suivi cellulaire et de segmentation cellulaire24,25,45 peut permettre de mesurer les paramètres morphologiques au niveau de la cellule unique (c.-à-d. la surface cellulaire, la longueur des axes principal et mineur et le rapport hauteur / largeur de la cellule).

2. Modèle 3D immuno-compétent de cancer sur puce dans un test compétitif

REMARQUE: La conception de la puce 3D, représentée à  lafigure 4, se compose de 5 compartiments principaux: un compartiment central pour l’apport en cellules immunitaires flottantes, deux régions latérales pour l’incorporation des cellules tumorales dans des matrices d’hydrogel (150-250 μm de haut) et des chambres de perfusion de milieux. Les chambres immunitaires et tumorales sont reliées par deux ensembles de réseaux étroits de microcanaux (200×12×10 μm3, L×W×H, Figure 4E). Régulièrement des micropiliers isocèles trapézoïdaux espacés de 100 μm (environ 25-30 interfaces pour chaque région de gel latéral, Figure 4C) agissent comme des barrières pour confiner la solution de gel pendant l’injection en exploitant l’équilibre entre la tension superficielle et les forces capillaires60,61 et relient les régions tumorales aux deux chambres de média latérales supplémentaires afin de définir une interface gel-liquide (Figure 5). Les caractéristiques détaillées du test compétitif 3D sont présentées à la figure 4. La migration préférentielle des cellules immunitaires vers les deux compartiments hydrogel hébergeant des cellules tumorales ayant subi différents traitements peut être surveillée et quantifiée. La configuration concurrentielle particulière peut être appliquée pour étudier une pléthore de phénotypes de biologie du cancer différents (par exemple, résistant aux médicaments vs agressif, primaire ou métastatique, répondeur vs non-répondeur). De plus, les régions intégrées au gel peuvent être facilement intégrées à différentes populations cellulaires pour recréer des ETM plus hétérogènes, y compris des composants stromaux (fibroblastes, cellules endothéliales)23 ou pour simuler un milieu immunosuppresseur spécifique34 (par exemple, les macrophages) pour disséquer les mécanismes de résistance aux médicaments et d’évasion tumorale.
REMARQUE : La coloration nucléaire et active des caspases, à l’aide de trousses commerciales pour les essais vivants/morts (p. ex. Thermo Fisher Scientific, réactifs pour incucytes), peut être mise en œuvre pour évaluer les décès mitotiques ou apoptotiques, comme indiqué dans Nguyen et coll.33.

  1. Préparation de la solution matricielle avec les cellules et chargement dans l’appareil
    REMARQUE : Dans le contexte expérimental suivant, les deux régions de gel contiennent des mélanges de lignées cellulaires de mélanome A375M humaines, cultivées en solution matricielle (p. ex. Matrigel), exposées à des agents thérapeutiques utilisés en monothérapie ou en combinaison. Ce paramètre nous a permis d’évaluer l’efficacité d’une combinaison de deux médicaments par rapport à des médicaments uniques de manière compétitive et de quantifier leur capacité à attirer les PBMC.
    1. Décongeler un stock de solution matricielle (p. ex., Matrigel) en le plaçant sur de la glace dans un réfrigérateur à 4 °C un jour avant l’expérience.
      REMARQUE : N’exposez pas le produit à plusieurs cycles de congélation-décongélation, car il devient « grumeleux ». D’autres protocoles d’hydrogels synthétiques ou naturels peuvent convenir à cette utilisation. Veuillez vous référer à 33,34,35 pour la préparation des cellules cancéreuses dans les matrices de collagène.
    2. Resuspendre les cellules de mélanome humain A375, colorées avec un agent de liaison fluorescent vert PKH67 compatible vivant dans une solution matricielle (2 mg mL-1). Lorsque cela est indiqué, ajouter la 5-aza-2'-désoxycytidine (DAC; 2,5 μM), appelée DAC, et/ou l’IFN-α2b, appelée IFN, aux doses appropriées32.
      REMARQUE: Faites correspondre le # de lot sur la fiche technique de la bouteille matricielle. En fonction de la concentration, calculer le volume de milieu nécessaire pour obtenir jusqu’à 2 mg mL-1 Veuillez ajuster la concentration optimale de protéines et la concentration de suspension de cellules cancéreuses en fonction de votre application d’intérêt.
    3. Pipeter soigneusement de haut en bas pour éviter la génération de bulles. Gardez le tube de microcentrifugeuse sur de la glace pendant le mélange pour éviter toute polymérisation indésirable.
    4. Après la stérilisation, placez les dispositifs sur de la glace (à l’aide d’un seau à glace et d’un couvercle) pour éviter la solidification de la solution matricielle pendant toute la procédure de chargement des cellules.
    5. Injectez lentement les deux mélanges de cellules matricielles IFN et DAC/IFN (2 à 4 μL) dans l’orifice de gel gauche et droit, respectivement à l’aide d’une micropipette de 10 μL à l’aide d’embouts froids (Figure 5A). Appliquez une légère pression pour pousser la solution matricielle d’un côté jusqu’à ce qu’elle atteigne le côté opposé.
      NOTE: Le volume de la solution matricielle a été choisi pour éviter de déborder dans les canaux adjacents. N’exercez pas une pression de pipetage excessive pour empêcher la solution de s’infiltrer dans les médias et les canaux centraux. Si, pendant le chargement, le chemin du gel est bloqué le long du canal, essayez d’insérer la solution de l’autre entrée jusqu’à ce que les fronts de gel se rencontrent. Lorsque vous retirez la micropipette des entrées, maintenez le piston, sinon la pression négative aspirera la solution matricielle.
    6. Placer le dispositif dans un incubateur en position verticale à 37 °C et 5% de CO2 pendant 30 minutes pour permettre la gélification de la solution matricielle (Figure 5B). Manipulez avec soin les puces avec un gel non polymérisé incorporé pour éviter les fuites hors du canal de gel.
    7. En attendant, resuspendre les PBMC marqués PKH67 (1x106 cellules) dans 10 μL de DMEM complet (milieu d’aigle modifié de Dulbecco).
    8. Après la gélification matricielle, remplir les canaux du milieu avec (50-100 μL) la même partie aliquote du milieu de culture dans les six réservoirs pour empêcher le gel de séchage dans les copeaux. Conserver en incubateur jusqu’à l’ensemencement de la suspension des cellules immunitaires.
      REMARQUE: Vérifiez au microscope la distribution correcte et homogène des cellules tumorales dans le gel et l’intégrité des barrières de gel polymérisé. Des régions gelées partiellement ou non uniformes ou des bulles dans le mélange conduisent à l’écoulement prématuré des PBMC dans les canaux de milieu de gel au point de départ de l’expérience en raison des fluctuations initiales de la pression.
    9. Aspirer le média des six puits et positionner l’embout près de l’entrée d’un canal de média pour injecter doucement avec une suspension de cellules PBMC à pression modérée. La séquence temporelle de chargement est représentée à la figure 5C :
      1. PBMC dans un milieu de 10 μL dans le puits central supérieur.
      2. 50-100 μL de milieu dans chacun des quatre puits de canaux latéraux.
      3. Milieu de 40 à 90 μL dans le puits central supérieur.
      4. 50-100 μL de milieu dans le puits central inférieur.
    10. S’assurer au microscope que la distribution des PBMC reste confinée dans la chambre centrale après l’étape de chargement. (figure 7A).
      REMARQUE: Si ce n’est pas optimal, ajustez la concentration si nécessaire et répétez les étapes d’ensemencement en utilisant des copeaux immaculés. Lors du calcul des volumes pour les conditions expérimentales prévues, se référer à un nombre excessif de puces (15-20%) pour tenir compte des erreurs et ajustements potentiels. Les volumes et les concentrations doivent être optimisés en fonction de l’application spécifique.
    11. Placer les dispositifs assemblés sur une surface plane dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pour l’acquisition ultérieure de l’imagerie par fluorescence. Manipuler avec soin les puces après avoir chargé les cellules immunitaires qui flottent.
      NOTE: Compenser les pertes par évaporation des volumes dans les réservoirs en remplaçant le milieu tous les 2-3 jours. Pour le profilage des chimiokines, jusqu’à 100 μL de chacun des deux puits des compartiments de culture peuvent être aspirés, veuillez vous référer à l’étape 2.7, à l’étape 1.
  2. Comptage automatisé des PBMC recrutés dans des images fluorescentes monocanal dans ImageJ
    REMARQUE: Les méthodes classiques d’immunofluorescence pour l’imagerie confocale à haute résolution peuvent être appliquées aux opérations sur puce en tant que mesures de point final. La procédure de coloration de base implique la fixation sur puce des cellules, la perméabilisation, le blocage, la liaison aux anticorps, la coloration des noyaux avec des étapes de lavage entre les deux. Les cellules immunitaires non marquées infiltrées dans les régions de gels 3D avec des microenvironnements cancéreux intégrés peuvent être fixées aux points temporels souhaités et colorées pour les marqueurs d’expression de l’activation/épuisement/maturation (p. ex., pour les cellules CD8, surveillance des marqueurs CD69, CD95, PD1, TIM3). Dans Parlato et al.35, la phagocytose des cellules apoptotiques SW620 a été évaluée par microscopie confocale, à l’aide de dispositifs montés sur des lamelles de couverture de 170 μm d’épaisseur. Les IFN-DC ont été colorés en ajoutant des aliquotes Ab anti-humains HLA-DR-FITC sur puce.
    Pour calculer l’étendue des cellules immunitaires vivantes colorées par fluorescence infiltrées mises au défi par des signaux concurrents, un flux de travail d’analyse d’image commun est défini comme suit (Graphique 7D-G):
    1. Acquérir, à des critères d’évaluation temporels spécifiques, des microphotographies de contraste de phase et de fluorescence des canaux rouge/vert des régions de gel gauche et droite contenant des cellules tumorales respectivement exposées à un seul régime pharmacologique ou à des combinaisons de ceux-ci.
      NOTE: Ici, les images ont été capturées par un microscope à fluorescence EVOS-FL après chargement cellulaire (0 h), après 48 h et après 72 h d’incubation (Figure 7A-B). Un grossissement 4x-10x a été utilisé pour acquérir la chambre centrale, les réseaux de microcanaux et les deux canaux latéraux juxtaposés contenant A375 plus IFN et A375 plus DAC/IFN.
      1. Lors de la réalisation d’opérations d’acquisition, tenez compte des paramètres à mesurer et évitez la saturation des entités à comptabiliser. Les résultats optimaux de segmentation dépendent de la nature des images acquises, en raison de la variabilité des échantillons biologiques eux-mêmes, de la qualité de la coloration et des techniques de microscopie utilisées pour les applications orientées utilisateur.
    2. Charger les données de fluorescence monocanal (dans ce cas rouge = PBMCs), aux Fidji en les faisant glisser dans la fenêtre principale (Figure 7D). Dupliquez l’image pour éviter d’écraser les données brutes lors de la sélection des filtres de prétraitement jusqu’à la segmentation finale.
      1. Si l’image est une image couleur (RVB), appuyez sur Image > Type 8 ou 16 bits pour convertir en niveaux de gris. Vérifiez que Modifier les options > > Conversions est défini sur la mise à l’échelle lors de la conversion.
    3. Prétraitement des données brutes via le nettoyage du bruit et des artefacts.
      1. Accédez au menu Traiter > soustraire l’arrière-plan en appliquant l’algorithme de la bille roulante pour corriger le bruit de fond inégal avec de grandes variations spatiales d’intensités. Définissez le rayon au moins sur la taille de la plus grosse particule de premier plan. Choisissez la case Aperçu pour la procédure d’essai et d’erreur afin d’obtenir des résultats optimaux. Des valeurs trop petites peuvent supprimer à tort les structures d’intérêt.
      2. Dans la commande Luminosité et contraste, faites glisser les curseurs Minimum/Maximum pour modifier la plage d’intensités dans l’histogramme. Déplacez le curseur Maximum vers la gauche pour augmenter la luminosité, sans fonctions de délavage. Déplacez la diapositive Minimum vers la droite pour augmenter le contraste de l’image en évitant la disparition des caractéristiques moins visibles en arrière-plan. Cliquez sur Appliquer pour corriger les modifications.
    4. Amélioration de l’image.
      1. Accédez à Process > Filters (Traiter filtres) et expérimentez les filtres gaussiens médians sur les images (Figure 7E).
        REMARQUE: Le rayon de préfiltrage doit être adapté aux pixels de bruit de l’image. Le filtre Médiane non linéaire remplace la valeur en pixels par la valeur médiane des voisins, afin de réduire le bruit poivre et sel. Le « Flou gaussien » est utilisé pour lisser une image numérique, en remplaçant les pixels par une moyenne pondérée des pixels environnants. Les poids proviennent de la distribution de probabilité gaussienne, de sorte que les pixels les plus proches sont plus influents.
      2. Accédez éventuellement à Traiter > mathématiques > Gamma avec la case Aperçu cochée pour augmenter le contraste.
        REMARQUE: Les intensités définies dans le panneau B & C sont mises à l’échelle entre les deux limites min et max. Les valeurs < 1,0 accentuent les différences entre les intensités faibles, tandis que les valeurs > 1,0 accentuent les différences entre les intensités élevées. La correction gamma est fonctionnelle pour trouver une plage d’affichage, montrant les objets les plus sombres sans saturer les plus lumineux.
    5. Création d’un masque d’image binaire.
      1. Accédez à Image > ajustez > seuil. La méthode la plus simple utilisée pour déterminer les seuils repose sur l’analyse histogramme des niveaux d’intensité, comme le montre la figure 7F. Dans le menu déroulant, jouez avec différentes méthodes de seuillage global (dans notre cas, Otsu est appliqué).
      2. Faites défiler manuellement ou tapez une plage connue d’intensités de pixels dans les panneaux d’histogramme, observez le changement du motif rouge superposant l’image qui ressemble principalement à la zone réelle de la cellule. Le bouton Réinitialiser supprime la superposition. Une fois satisfait, cliquez sur Appliquer pour générer une version binaire de l’image. Cochez Options de > de processus > binaires pour contrôler l’affichage des images avec seuil et l’identification des objets par l’analyseur de particules.
    6. Utilisez la commande de menu Processus/Binaire/Particules du bassin versant pour diviser les particules qui se chevauchent partiellement ou fusionnent pendant le seuil. Le bassin versant peut souvent les séparer avec précision en ajoutant une ligne épaisse de 1 pixel. Effectuez des opérations morphologiques telles que les opérations de dilatation ou d’érosion pour agrandir ou supprimer les pixels des pixels sous-saturés ou sursaturés.
      REMARQUE: Pour plus d’informations, consultez la section Commandes de menu ou reportez-vous à MorphoLibJ, une bibliothèque intégrée basée sur la morphologie mathématique pour traiter les données binaires.
    7. Description quantitative de la fonction d’image.
      1. Une fois la reconnaissance d’objet satisfaisante obtenue, ouvrez l’analyseur de particules de Analyser > Analyser les particules. Les particules peuvent être exclues par leur taille et leur circularité, exprimées en pixels ou dans une unité de mesure calibrée (vérifiez l’échelle correcte par rapport aux paramètres du microscope sous Propriétés de l’image >). Pour tout inclure, conservez la valeur par défaut de 0-Infinity et la plage de circularité par défaut à 0,00 - 1,00 (0 = ligne droite, 1 = cercle parfait).
      2. Pour filtrer les petits pixels « bruit » ou les entités qui n’ont pas d’intérêt, définissez la plage minimale et maximale. Cochez les options Inclure les trous, Afficher, Contour et Afficher les résultats dans le champ de la fenêtre. Exclure sur les bords éliminera les particules détectées sur les bordures de l’image. Ajouter au gestionnaire ajoute la sélection obtenue au gestionnaire de retour sur investissement pour une analyse plus approfondie en conservant les informations de position de la particule.
        REMARQUE: Dans le « ROI Manager », il est possible de corriger la segmentation automatique de la sortie enregistrée (fusionner les cellules divisées, diviser les cellules fusionnées). Sélectionnez, à l’aide des outils de sélection de la barre d’outils Fidji, les ROI à l’intérieur des deux régions de gel où les cellules cancéreuses sont intégrées pour estimer l’infiltration immunitaire.
    8. Exportez les valeurs obtenues vers une feuille de calcul pour effectuer une analyse statistique, comme illustré à la figure 7G. « Résultats » énumère un tableau de données relatif aux propriétés des particules numérotées identifiées. « Résumer » ouvre une fenêtre avec le nom de l’image, le nombre total et d’autres informations pour l’image entière.
      1. Allez à Analyser > Définir les mesures pour inclure un large éventail de paramètres.
    9. Enregistrez éventuellement une macro (en sélectionnant Plugins > Macros > Record) pour automatiser le flux de travail de traitement et gagner du temps d’analyse sur de grands ensembles de données.
      1. Utiliser la même routine de traitement pour analyser le canal de fluorescence vert dans les mêmes régions afin d’analyser les changements morphologiques des cellules tumorales dans les régions 3D16

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Representative Results

L’infiltration immunitaire tumorale est un paramètre de la réponse antitumorale de l’hôte. Les tumeurs sont hétérogènes dans la composition, la densité, l’emplacement et l’état fonctionnel des leucocytes infiltrants dont les interactions avec les cellules cancéreuses peuvent sous-tendre des informations cliniquement pertinentes pour prédire l’évolution de la maladie et la réponse au traitement. En ce sens, les technologies microfluidiques pourraient être utilisées comme des outils in vitro complémentaires et privilégiés pour explorer la contexture immunitaire des tumeurs, ainsi que pour surveiller la réponse aux thérapies anticancéreuses. Le couplage du test microfluidique, de l’imagerie des cellules vivantes et du logiciel de suivi peut établir des méthodes de quantification fiables pour quantifier la façon dont les cellules immunitaires ajustent leur schéma de migration dans différents contextes. Dans ce chapitre, nous avons décrit les étapes de mise en place de co-cultures 2D ou 3D polyvalentes de cellules cancéreuses immunitaires et cibles dans des dispositifs microfluidiques ad hoc réalisés par des procédures lithographiques douces standard. Dans la section 1, des dispositifs microfluidiques ont été utilisés pour permettre des contacts chimiques et physiques entre les populations adhérentes (cellules cancéreuses MDA-MB-231) et non adhérentes (PBMC). Certains agents chimiothérapeutiques (par exemple, les anthracyclines entre autres) peuvent induire une apoptose « immunogène » des cellules malignes, améliorant ainsi leur visibilité chez les hôtes immunocompétents. La mort cellulaire immunogène cancéreuse (DCI) est caractérisée par la libération de signaux solubles et liés à la membrane délivrés par des cellules mourantes fonctionnant comme des alarmines pour les cellules immunitaires. Pour fournir une validation quantitative de la réponse ICD, nous utilisons des données recueillies dans la plate-forme microfluidique où les leucocytes peuvent se déplacer à travers des ponts microcanaux correctement construits vers leurs cellules cibles. Des enregistrements en accéléré ont été réalisés après co-chargement de PBMC, provenant de donneuses saines (WT, type sauvage), avec des cellules cancéreuses du sein MDA-MB-231 humaines prétraitées ou non avec l’anthracycline DOXO. Des microphotographies ont été produites toutes les 2 min, pendant deux intervalles de temps successifs de 24 et 48 h. (Exemple Film S1 d’intervalle de 0 à 24 h). L’analyse de suivi des cellules cancéreuses individuelles des PBMC confrontées à la mort (traitées par DOXO) ou vivantes (traitées par PBS) a été effectuée à l’aide du plug-in Trackmate, comme on le voit dans Graphique 6A (panneau de gauche). Les valeurs de chimiotaxie et les diagrammes de migration pertinents ont été générés automatiquement à l’aide de la chimiotaxie et de l’outil de migration, comme indiqué dans62. Les trajectoires cellulaires ont toutes été extrapolées à (x, y) = 0 au temps 24 h. Les résultats ont indiqué un profil migratoire différent des cellules immunitaires lorsqu’elles sont cochargées avec des cellules cancéreuses du sein exposées à DOXO ou PBS. Lorsque les PBMC ont été confrontés à des cellules cancéreuses apoptotiques, elles ont traversé des microcanaux vers des cellules mourantes / mortes (mais pas pour des cellules vivantes non traitées). Tracés d’araignées et de roses de migration X/Y, présentés dans le panneau de gauche Figure 6B-C, ont été cartographiés et comparés pour mettre en évidence l’impact des agents inducteurs immunogènes sur les différences de dynamique immunitaire. Les diagrammes roses démontrent que les PBMC ont migré principalement dans presque toutes les directions dans l’expérience de contrôle, seule une fraction négligeable est guidée vers le haut du gradient généré par la prolifération des cellules cancéreuses. Inversement, les trajectoires des cellules individuelles mettent en évidence un fort mouvement de biais le long de la direction des cellules cancéreuses du sein apoptotiques (direction x négative). Pour évaluer la migration dirigée des cellules immunitaires vers les cellules cancéreuses traitées par DOXO ou PBS, plusieurs paramètres de chimiotaxie sont calculés, notamment: a) le centre de masse (point moyen spatial de tous les paramètres); b) la directionnalité; c) l’indice de migration vers l’avant (c’est-à-dire le déplacement cellulaire moyen dans une direction d’intérêt qui signifie vers le site tumoral cible, dans notre cas). Ces dernières valeurs représentent une mesure de l’efficacité d’une cellule à migrer dans la direction donnée des stimuli chimiotactiques. Après avoir atteint la chambre gauche, une fraction des leucocytes avec une densité croissante sur 24-48 h a présenté des contacts à long terme (>60 min) avec MDA-MB-231 traité par DOXO. Les PBMC ne parviennent pas à migrer massivement et à s’engager dans de telles interactions persistantes et à long terme avec les cellules cancéreuses vivantes (comme le montrent les microphotographies représentatives des PBMC approchant dans Graphique 6A, à droite). Pour quantifier les différences dans l’interaction tumorale-immunitaire, la région tumorale a été délimitée avec un cercle fixe de diamètre allant de 20 à 80 microns, appelé « hotspot ». La quantification et l’analyse à partir de VOV représentatives sont présentées dans Graphique 6 (Panneau de droite, B-C).

Dans la section 2, un nouveau modèle tumoral immuno-compétent 3D a été décrit pour quantifier le recrutement de cellules immunitaires en réponse à des combinaisons anticancéreuses de médicaments épigénétiques32 (DAC/IFN vs IFN seul), permettant la comparaison simultanée de deux conditions de traitement différentes des cellules de mélanome A375. Ainsi, les cellules de mélanome A375M, marquées avec un colorant fluorescent vert PKH67, ont été incorporées dans des matrices Matrigel en présence de DAC et/ou d’IFN dans chaque chambre de gel, tandis que les PBMC PKH26 marqués en rouge ont été distribués de manière homogène dans la chambre fluidique centrale au point de départ (Figure 7A). Nous avons comparé simultanément les deux masses tumorales dans les matrices 3D pour leur capacité à attirer les PBMC. À 48 et 72 h, les PBMC sont guidés massivement dans les microcanaux du côté droit, comme l’observe la figure 7B.

Un hommage préférentiel des PBMC vers la matrice de gel contenant le site de mélanome traité par DAC/IFN, plutôt que par IFN, a été clairement observé, tandis qu’un faible taux de migration était visible vers les cellules A375 exposées à un traitement unique (côté puce gauche). Le contexte concurrentiel est applicable à l’étude d’une pléthore de phénotypes de biologie du cancer différents (p. ex., résistant aux médicaments vs agressif, primaire ou métastatique (p. ex., cellules de mélanome A375P vs A375M), et répondeurs vs non-répondeurs). Les chambres de gel peuvent être composées de co-cultures complexes de cellules malignes et de multiples cellules associées à des tumeurs non cancéreuses, telles que les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et les fibroblastes33 pour caractériser les réponses médicamenteuses au niveau du TME. Les événements de mitose et de mort apoptotique des cellules cancéreuses peuvent être surveillés par coloration avec des colorants vivants33. Les procédures d’immunomarquage sur les dispositifs microfluidiques 3D pourraient être adaptées pour évaluer les états d’activation des cellules immunitaires infiltrées dans les sites tumoraux par microscopie confocale35. En ce sens, ces systèmes microfluidiques 3D peuvent imiter des structures tumorales complexes et des interactions multicellulaires et constituent donc des plates-formes précieuses pour des tests précliniques de médicaments plus fiables.

Figure 1
Graphique 1. Planimétrie du dispositif microfluidique pour l’assemblage de co-cultures 2D tumor-immun. (A) Microphotographie réelle de 3 puces assemblées en une seule lame de microscope. Les réservoirs sont numérotés en fonction de la séquence de chargement et sont codés par couleur comme les chambres de culture correspondantes énumérées dans la légende. Barre d’échelle, 6 mm. (B) CAO 3D de puce composée de trois zones principales de culture cellulaire reliées par des microrainures. C) Détails du pont étroit des microrainures, montrant les dimensions adaptées aux cellules cancéreuses et à la taille des PBMC. D-E) La microphotographie en lumière visible a été acquise avant le début du time-lapse, montrant la distribution des cellules cancéreuses et des PBMC respectivement dans la chambre gauche et la chambre intermédiaire. Barre d’échelle, 500 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Graphique 2. Pipeline d’analyse trackmate pour la localisation des points immunitaires dans les images de séries chronologiques. A) Panneau supérieur : Capture d’écran du menu d’étalonnage de l’image Trackmate. Panneau inférieur: Fidji « Menu des propriétés de l’image » pour définir les unités de temps et spatiales. B) Panneau supérieur: Capture d’écran du menu « Détection des taches » de Trackmate. Panneau inférieur: Image de sortie avec différentes valeurs appliquées de « Seuil ». C) Panneau supérieur : Capture d’écran du menu « Spot filtering » de Trackmate illustrant certains filtres. Panneau inférieur : Image accélérée exemplaire, représentant des taches immunitaires filtrées par position le long de X dans la chambre intermédiaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Graphique 3. Pipeline d’analyse Trackmate pour la reconstruction de traces immunitaires dans des séquences d’images de séries chronologiques. A-C) Captures d’écran des menus Trackmate pour la construction de pistes, le filtrage des pistes et l’exportation des données finales. D) Exemples de pistes générées dans des images time-lapse prétraitées variant les paramètres du détecteur de liaison. E) Exemple de fausses traces et de mauvais liens dérivés de la détection des frontières des cellules tumorales. F) Les pistes sont surlignées en vert en sélectionnant des lignes dans le fichier .txt de résultats. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Graphique 4. Vue d’ensemble schématique des puces tumorales immunocompétentes 3D. A) Exemple de maître en silicium microstructuré. Les timbres pour PDMS ont été modelés en résine négative SU-8 dans une salle blanche équipée d’un faisceau électronique et d’une lithographie optique. B) Les répliques PDMS ont été fabriquées selon des méthodes standard de lithographie douce. L’unité centrale a les chambres colorées comme celles dessinées dans le rendu 3D de la puce, représenté dans le panneau D. C) Microscopie électronique à balayage (MEB) vue agrandie du réseau de micropiliers adaptés au piégeage de la solution d’hydrogel. D)CAO 3D montrant les chambres, reliées par des microrainures et les puits de chargement. Les cases pointillées sont renvoyées aux photographies SEM des détails (panneaux C et E). E) Photographie MEB de microrainures de connexion de 10 μm de haut. F) Disposition CAO 2D représentant les dimensions des microstructures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Graphique 5. Flux de travail schématique des principales étapes du protocole de chargement pour l’assemblage de co-cultures 3D. A) Panneau supérieur: Schémas de l’étape d’injection de la solution Matrigel dans chaque région latérale du gel. Panneau inférieur: Photographie réelle de la puce montrant l’avancement frontal du gel le long du canal pendant l’étape de chargement. B) Schémas de l’étape de polymérisation de Matrigel. Panneau inférieur: Vue microscopique à contraste de phase de l’interface gel-air formée après l’étape de gélification. Barre d’échelle, 100 μm. C)Panneau supérieur: Dessin, représentant le chargement de cellules et de milieux avec des volumes exemplaires utilisés dans le protocole. Panneau inférieur: Une image à contraste de phase 4X de la co-culture assemblée à 0h est affichée. Barre d’échelle, 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Graphique 6. Analyse des profils migratoires et du comportement d’interaction du PBMC vers la chambre tumorale mourante / vivante dans la fenêtre temporelle de 24-48 h. Panneau de gauche. A) Captures d’écran d’images prétraitées en accéléré superposées à des pistes colorées immunitaires, extraites par Trackmate. Les voies immunitaires sont obtenues par un seul champ de vision dans les conditions expérimentales indiquées dans l’intervalle de 24 à 48 h dans la chambre intermédiaire. B-C) Pistes de migration représentatives et parcelles roses de PBMC cultivées dans les deux conditions différentes (n = 1550 PBMC versus cellules cancéreuses traitées par DOXO, DOXO+ ou n = 1434 PBMC versus cellules cancéreuses témoins, DOXO-). Chaque ligne à l’intérieur des diagrammes x-y représente une seule trajectoire PBMC et chaque cercle représente la position finale d’une seule cellule par rapport à la position initiale. Les points de départ sont définis sur (0,0) à l’aide d’une transformation de coordonnées. Les coordonnées et le déplacement du centre de masse de migration cellulaire sont affichés dans les conditions expérimentales indiquées. Le centre des coordonnées de masse et du déplacement (calculé comme la distance euclidienne moyenne pour les composantes X et Y) fournit une indication de la direction moyenne dans laquelle le groupe de cellules a principalement voyagé et de l’ampleur du mouvement cellulaire global dans les groupes de conditions. Les lignes bleues et vertes marquent respectivement les traces individuelles par une valeur de distance euclidienne supérieure/inférieure à une valeur seuil (100 μm). D) Schéma de données numériques extraites par une piste cellulaire. E-F) Box & Whiskers plot représentant respectivement la directionnalité (p<0,0001 Test t non apparié avec la correction de Welch) et FMI (p<0,0001 Test t non apparié avec correction de Welch). La ligne horizontale dans les cases représente les valeurs médianes. Les valeurs FMI sont la moyenne pour toutes les pistes de cellules dans chaque groupe de conditions. Panneau de droite. A) Captures d’écran des ROI extraits de Trackmate montrant les interactions différentielles entre les PBMC et les cellules cancéreuses traitées par DOXO ou PBS. B) Densité temporelle des PBMC autour des cellules cancéreuses MDA-MB-231 traitées par DOXO ou témoins. Nombre de PBMC présents dans le ROI sélectionné autour des cellules cancéreuses pour chaque condition. Les valeurs rapportées sont la moyenne sur 9 ROI sélectionnés à partir d’un seul champ de vision time-lapse. Les points chauds du cancer sont définis dans un ROI (80 μm de diamètre). La carte thermique de densité correspondante s’affiche. Les points représentent le nombre moyen de cellules calculé sur 9 points chauds de cancer aux points temporels indiqués. C) Distribution des temps (min) de contacts pour chaque groupe expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Graphique 7. Recrutement préférentiel de PBMC en réponse à des combinaisons de médicaments DAC et IFN dans un modèle compétitif de mélanome immunocompétent 3D sur puce. A) Distribution des PBMC initialement chargés dans la chambre centrale des dispositifs microfluidiques. Les microphotographies sont acquises par microscope à fluorescence EVOS-FL pendant un intervalle de 0 à 72 h. La fluorescence rouge (cellules marquées PKH67) représente les PBMC provenant de donneurs sains. Les cellules de mélanome humain marquées PKH67 (vertes) intégrées dans des traitements Matrigel contenant des combinaisons simples ou doubles ont été plaquées dans des chambres latérales. B) Cellules A375 plus IFN à gauche versus A375 plus DAC/IFN à droite. Des images de fluorescence ont été montrées à 72 h de co-culture. La case jaune abandonnée représente un recrutement visiblement massif dans l’A375 plus côté DAC/IFN. C) PBMC compte dans quatre ROI différents des chambres IFN par rapport aux chambres DAC + IFN. Les histogrammes représentent le nombre de cellules +/- S.D.; heatmap a énuméré les valeurs de chaque retour sur investissement. Barres d’échelle, 200 μm. D-G) Schémas des étapes de segmentation et de quantification des PBMC infiltrés dans des matrices gel appliquées à des images de fluorescence monocanal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dossier supplémentaire. Protocole de microfabrication Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Film supplémentaire 1. Séquences time-lapses dans une co-culture 2D sur puce immunisée contre la tumeur. Des microphotographies ont été acquises toutes les 2 minutes, dans un intervalle de temps de 0 à 24 heures, au moyen d’un microscope compact placé dans un incubateur de culture cellulaire standard. Panneau de gauche. Film de PBMC provenant de donneurs sains (WT, type sauvage), plaqué avec MDA-MB-231 contrôle les cellules cancéreuses du sein. Panneau de droite. Film d’une migration massive de PBMC WT vers la chambre à puce où les cellules cancéreuses traitées par MDA-MB-231 DOXO sont chargées. La disposition des puces 2D est décrite en détail dans la section 1 du Protocole et illustrée à la figure 1. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

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Discussion

Les méthodes décrites tentent de concevoir une approche générale pour récapituler, avec un degré de complexité modulable, deux aspects significatifs dans le domaine de l’onco-immunologie, qui peuvent bénéficier de l’adoption de modèles in vitro plus pertinents. Le premier concerne le côté de la population de cellules tumorales, où s’attaquer aux caractéristiques des cellules uniques peut conduire à une meilleure description de l’hétérogénéité et de la signification biologique et clinique corrélée, y compris la résistance au traitement, la propension aux métastases, les cellules souches et le grade de différenciation. L’autre aspect de l’histoire est représenté par le TME, y compris les composants non cancéreux (cellules immunitaires et stromales, vaisseaux sanguins) et le paysage chimique / physique (constituants de la MEC, chimiokines et autres facteurs solubles libérés) qui peuvent profondément façonner à la fois les caractéristiques de la maladie et la réponse de l’individu au traitement63, en particulier à l’immunothérapie. Il convient de noter que l’exportation de l’approche décrite dans d’autres domaines de recherche nécessite une compréhension approfondie des limites et des défis posés par le développement et l’adoption de nouveaux modèles.

Citant une maxime appliquée dans la modélisation technique (« modéliser le problème pas le système »), il faut optimiser le nombre minimum de composants (cellulaires, physiques et chimiques) et les conditions nécessaires pour rendre son propre modèle sur puce biologiquement pertinent et stable tout au long de l’expérience. Chaque combinaison de types de cellules/microenvironnement/environnement expérimental doit donc être choisie, évaluée et surveillée en permanence avec précision au cours d’expériences uniques et d’une session à l’autre. Ces contrôles comprennent, comme mentionné dans les sections du protocole, un contrôle strict des paramètres tels que les volumes dans les dispositifs microfluidiques qui peuvent être modifiés par les conditions d’humidité ou de chauffage provenant de sources d’éclairage, les mouvements possibles et la non-planéité des étapes provoquant des dérives de liquide incontrôlées, mais aussi une certaine vérification des paramètres de l’état cellulaire, de la viabilité et de la caractérisation phénotypique. Une étape critique concerne la décision d’utiliser des systèmes de perfusion pour créer des structures vascularisées (similaires), ou pour l’administration de médicaments sur puce33, car cela peut affecter les expériences en termes de complexité croissante, de durée de culture cellulaire et de modulation des facteurs chimiques en présence de cellules flottantes comme les cellules immunitaires.

Dans ce qui suit, nous résumons les principaux problèmes critiques et pertinents trouvés dans les contextes expérimentaux et dans la littérature la plus récente.

ECM et définition du paysage chimique
TME est profondément affecté également par les propriétés mécaniques 64,65 de l’environnement63, 66. Pour cette raison, le choix de la matrice de culture est fondamental, en particulier lorsqu’il s’agit de cellules immunitaires qui, dans certaines conditions, pourraient répondre aux signaux émis par la matrice elle-même. Des avancées significatives sont attendues dans un avenir proche, notamment grâce à la conception et au développement de nouveaux matériaux et hydrogels (caractérisés par différentes rigidités, porosités, présence de facteurs solubles, entre autres paramètres) qui permettent une ECM de plus en plus raffinée et contrôlable, imitant les spécificités de différents tissus aujourd’hui, différents patients demain. D’autre part, il est également essentiel de surveiller les changements induits par les différentes populations cellulaires dans l’ECM et de définir des stratégies pour inclure ces informations dans les analyses dynamiques et phénotypiques.

Gestion des données
La voie vers le déploiement de techniques de tumeur sur puce dans un flux de travail clinique va bénéficier d’un énorme travail expérimental qui se déroule dans plusieurs directions. Les modèles d’organes sur puce, comme de nombreuses techniques in vitro, sont fonctionnels, du moins potentiellement, pour effectuer des mesures à haut débit / haute teneur. La parallélisation des conditions expérimentales, y compris les contrôles positifs et négatifs, et les réplications techniques/biologiques est rendue possible par l’intégration de plusieurs puces sur la même plaque. L’augmentation du débit quantitatif joue un rôle crucial dans la traduction et la validation de ces systèmes dans le pipeline de criblage rapide de médicaments ou de gènes pour les immunothérapies. En effet, plusieurs entreprises ont déjà développé des plateformes dans un format multi-puits, et différentes approches d’imagerie sont testées pour permettre de surveiller un grand nombre d’appareils simultanément14. Dans les protocoles décrits ci-dessus, nous avons utilisé des lames de microscope allouant jusqu’à 3 puces, avec la possibilité de visualiser jusqu’à 12 conditions expérimentales en parallèle, à l’aide d’un plateau multi-lames de microscope standard. Cette configuration est compatible avec le pipetage manuel et convient aux ajustements orientés personnalisés effectués dans notre usine de microfabrication. Au contraire, lorsqu’une forte parallélisation est nécessaire (tests et contrôles de criblage multiples), des optimisations de configuration pour définir un niveau d’automatisation plus élevé (utilisation de robots de pipetage, de multipuits en plastique) sont nécessaires.

Lors de la conception des expériences, un compromis entre la résolution spatiale et temporelle doit être pris en compte.

L’énorme quantité de données, produite par la microscopie à haut contenu, constitue un facteur limitant en termes de stockage, de transfert et d’analyse. Ces questions sont abordées avec des approches informatiques mettant en œuvre des outils d’apprentissage automatique et des ressources matérielles / logicielles, ce qui peut favoriser la possibilité future de relier les expériences sur puce / in silico67,68 dans le choix des stratégies thérapeutiques, ce qui représente une opportunité ambitieuse mais non différable.

Au-delà de l’imagerie par fluorescence
Le marquage par fluorescence, par colorants ou gènes rapporteurs, en raison de sa spécificité élevée, représente sans aucun doute la méthode de référence pour identifier différentes populations cellulaires dans des conditions de co-culture et pour résoudre les propriétés moléculaires avec un SNR élevé. Dans les modèles OOC, cette approche est couramment utilisée comme référence et en particulier dans les microenvironnements hétérogènes de tumeurs sur puce, il peut être utile de caractériser le phénotype des cellules immunitaires infiltrées et en interaction.

Néanmoins, il existe de plus en plus de preuves que les effets induits par les fluorophores, les procédures de coloration laborieuses et les routines d’éclairage doivent être surveillés et minimisés69 car ils peuvent affecter profondément le comportement et l’état des cellules70,71. Ce risque semble particulièrement vrai pour les systèmes fragiles, tels que les cellules immunitaires72,73. Les réactions phototoxiques peuvent introduire des limites dans la définition de l’acquisition de la fenêtre temporelle des cellules vivantes lorsqu’elles sont surveillées à une résolution spatiale et temporelle élevée. De plus, la richesse de la variété des sous-populations immunitaires rend impossible la discrimination entre elles uniquement par coloration fluorescente, compte tenu du nombre limité de filtres couramment disponibles sur les microscopes.

Pour répondre à cette problématique, d’un point de vue instrumental, de nouvelles techniques de microscopie sans étiquette74 telles que la microscopie holographique56 ou la microscopie hyperspectrale57 font maintenant leur apparition sur scène. Ils promettent des stratégies avancées de classification des processus cellulaires au-delà de la fluorescence et peuvent être particulièrement utiles pour étudier des échantillons sensibles. Du point de vue de l’analyse des données, les approches informatiques avancées, basées sur des algorithmes d’apprentissage profond75 (entraînés par des ensembles de données d’images de fluorescence), ouvrent la porte pour effectuer ce que l’on appelle le « marquage in silico»76,77. Ils ont été appliqués avec succès pour prédire les marqueurs fluorescents à partir d’images en fond clair78, générant des images marquées, sans coloration des cellules, augmentant ainsi le pouvoir informatif de la microscopie à champ clair. Cette stratégie peut également être utile pour gagner du temps et des canaux de fluorescence pour d’autres marqueurs. Nous pensons que la communauté OOC bénéficiera de ces nouvelles techniques permettant une étude moins invasive de l’interaction des populations cellulaires.

Analyse des données
Les mécanismes d’interactions entre les cellules cancéreuses immunitaires et cibles peuvent être étudiés par le suivi des mouvements cellulaires28,79. Les expériences de suivi accéléré dans des co-cultures complexes et hétérogènes sont extrêmement précieuses pour extraire les schémas de migration cellulaire, les changements morphologiques et d’état, et des informations complètes sur la lignée. L’analyse manuelle n’est pratiquement possible que pour de courtes séquences avec peu de cellules, mais pas pour des expériences systématiques à haut débit. Par conséquent, le développement d’outils informatiques pour le suivi cellulaire, entièrement ou partiellement automatisé, est un domaine de recherche essentiel en analyse d’images24. En règle générale, le suivi cellulaire conventionnel nécessite une fréquence d’échantillonnage et une résolution spatiale relativement élevées pour effectuer correctement les tâches de segmentation, ce qui peut être difficile dans de nombreuses conditions expérimentales. Pour localiser les cellules, il existe des outils de segmentation et de suivi en libre accès (par exemple, le logiciel ImageJ22) tels que présentés dans ce protocole ou un logiciel propriétaire dédié. Dans des études à grande échelle, nous avons appliqué un logiciel propriétaire appelé Cell Hunter16,31, développé par l’Université de Tor Vergata à Rome, pour distinguer de manière entièrement automatique le cancer et les cellules immunitaires dans un contexte multi-population. Des solutions sur mesure basées sur l’apprentissage automatique et les approches de réseaux neuronaux 80,81,82 commencent aujourd’hui à être mises en œuvre dans les progiciels de microscopie 83, de l’amélioration du SNR à la gestion des paramètres d’acquisition critiques ou des étapes de segmentation. L’apprentissage automatique peut être exploité pour reconnaître des modèles cellulaires communs (par exemple, des styles de mouvement) afin de caractériser la réponse biologique par rapport aux facteurs microenvironnementaux.

Dans Comes et coll.41, une architecture de réseau neuronal convolutif d’apprentissage profond pré-entraînée a été appliquée pour classer si les cellules cancéreuses sont ou non exposées à un traitement médicamenteux en utilisant comme « marqueur » la motilité des cellules immunitaires, suivie à partir de données accélérées de co-cultures de cellules cancéreuses du sein et de PBMC dans des matrices de collagène dans des microdispositifs, tel que décrit àla section 33.

Développement de méthodes et d’ontologies omiques unicellulaires
Nous soulignons la nécessité d’une alliance stratégique entre les technologies omiques unicellulaires84 (protéomique, métabolomique, génomique) et les méthodes sur puce : la caractérisation moléculaire détaillée, conjuguée à l’information dynamique fonctionnelle, pourrait améliorer la compréhension des mécanismes de base et la description clinique. Dans ce cas, de nouveaux instruments pour relier les deux mondes en sont à leurs débuts85. Le premier défi consiste à mettre en œuvre des approches omiques unicellulaires directement sur les puces onco-immunologiques22. De plus, les organes sur puce pourraient être exploités comme plateformes pour tester des cibles potentielles identifiées par des analyses génomiques et protéomiques86,87. Un deuxième outil de liaison, qui fait encore largement défaut, est un moyen structuré et standardisé d’annoter et de stocker les résultats mesurésdu système 88,89. Mais c’est exactement ce dont nous avons besoin à l’avenir pour construire des bases de données systématiques de résultats quantitatifs cellulaires et de caractéristiques mesurées, pour les exploiter, les déduire et les corréler avec les informations biologiques inhérentes. En un mot, la nécessité d’une standardisation et d’une analyse systématique de jeux de données expérimentales hétérogènes appelle un cadre d’ontologie.

Personnalisation des modèles
La technologie des organes sur puce convient à la personnalisation12, car les cellules et les tissus d’un seul patient (ou de classes de patients) peuvent être utilisés dans les dispositifs dans des conditions contrôlées, conduisant à des lectures cliniquement pertinentes, utiles pour éclairer les stratégies thérapeutiques ou de prévention. Quelques exemples commencent à apparaître dans la littérature90. Bien entendu, pour les modèles de tumeur sur puce, ce défi pose plusieurs questions techniques et scientifiques à résoudre36 (comme le contrôle des caractéristiques du TME telles que la concentration en oxygène, les gradients de cytokines, etc.). Surtout, la perspective de rendre les thérapies onco-immunologiques et onco-immunologiques plus efficaces tout en réduisant les effets néfastes pour chaque patient est attrayante, du point de vue de la qualité de vie comme de l’optimisation des ressources de santé.

En conclusion, il est évident que ce domaine est authentiquement interdisciplinaire et, en tant que tel, nécessite un grand effort pour établir un langage commun et des objectifs partagés entre les chercheurs, les cliniciens, l’industrie, mais aussi de différentes disciplines (ingénierie, biologie, science des données, médecine, chimie) trouver un bon équilibre et de nouvelles solutions91.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer. AS est soutenu par la Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) et Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS et FM sont soutenus par l’Association italienne pour la recherche sur le cancer (AIRC) no. 21366 à G.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials 
50 mL tubes Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS430828 centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC Millipore-Sigma; St. Louis, MO A3656 DNA-hypomethylating agent
6-well plates Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS3506 culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask Corning, New York, NY 430641U culture flasks
A365M American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		 human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride Millipore-Sigma; St. Louis, MO D1515 anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0728L Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium EuroClone Spa, Milan, Italy ECB4004L saline buffer solution
Fetal Bovine Serum EuroClone Spa, Milan, Italy ECS0180L ancillary for cell culture
Ficoll GE-Heathcare 17-1440-02 separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometer Neubauer Cell counter
Heparinized vials Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b Millipore-Sigma; St. Louis, MO SRP4595 recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3000D ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media Cedarlane Labs, Burlington, Canada Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel Corning, New York, NY 354230 growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26 human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3001D ancillary for cell culture
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201 Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH26GL red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH67GL green fluorescent cell dye
RPMI-1640 EuroClone Spa, Milan, Italy ECM2001L Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 15250061 cell stain to assess cell viability
Trypsin EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0920D dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator  Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C) FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Steril VBH 72 MP Laminar flow hood
Optical microscope Zeiss
Refrigerable centrifuge Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) Sigma Aldrich A3648 silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ  MB W&A,  Germany optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm) Ibidi, Germany 10812
Hydrogen Peroxide solution 30% Carlo Erba Reagents 412081 reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone Carlo Erba Reagents 461945 PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm  Sail Brand 7101 substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm Tedpella dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa Allresist,Germany AR-P. 679.04 Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips Ibidi, Germany 10813 substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped Gambetti Xenologia Srl, Italy 30255
Propan-2-ol Carlo Erba Reagents 415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Sigma Aldrich 484431-4L SU-8 resists developer
SU-8 3005 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0001 Negative Photoresists
SU-8 3050 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0005 Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm Tedpella 15111-40, 15111-60, 15111-80 dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96% Carlo Erba Reagents 410381 reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dowsil, Dow Corning 11-3184-01 Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS) Sigma Aldrich 92360-100ML silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

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References

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 170 Organes-on-chip immunologie tumorale diaphonie cancéreuse microenvironnement tumoral contexture immunitaire dynamique cellulaire et interactions tumeur sur puce immuno-compétente microfluidique immuno-oncologie suivi cellulaire
Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro
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De Ninno, A., Bertani, F. R.,… More

De Ninno, A., Bertani, F. R., Gerardino, A., Schiavoni, G., Musella, M., Galassi, C., Mattei, F., Sistigu, A., Businaro, L. Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments. J. Vis. Exp. (170), e61895, doi:10.3791/61895 (2021).

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