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Artigo de método

Estabelecendo requisitos de polinização em ameixa japonesa por monitoramento fenológico, polinizações manuais, Microscopia de Fluorescência e Genotipagem Molecular

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DOI:

10.3791/61897

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9 de novembro de 2020

 ,  , 
1Unidad de Hortofruticultura, Centro de Investigación y Tecnología Agroalimentaria de Aragón (CITA), 2(CITA-Universidad de Zaragoza), Instituto Agroalimentario de Aragón - IA2, 3Departamento de Hortofruticultura, Centro de Investigaciones Científicas y Tecnológicas de Extremadura (CICYTEX), Instituto de Investigaciones Agrarias Finca La Orden

Neste artigo

Resumo

Descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês, que combina polinizações de campo e laboratório e observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência com a identificação de S-genótipos pela PCR e o monitoramento da floração para a seleção de polinizadores.

Resumo

As cultivares japonesas de ameixa comumente cultivadas são híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a salicina prunus original com outras espécies de Prunus. A maioria dos híbridos exibe autoincompatibilidade gametofítica, que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locus que contém vários alelos. A maioria dos híbridos cultivados são auto-incompatíveis e precisam de pólen de um doador compatível para fertilizar suas flores. O estabelecimento de requisitos de polinização na ameixa japonesa está se tornando cada vez mais importante devido ao alto número de novas cultivares com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por polinizações manuais tanto no campo quanto no laboratório, seguida pelo monitoramento do alongamento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência, e também pelo monitoramento da maturação da fruta no campo. A seleção de cultivares polinizadores é avaliada pela combinação da identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo. Conhecer os requisitos de polinização das cultivares facilita a seleção de cultivares para a concepção de novos pomares e permite a detecção precoce de problemas de produtividade relacionados à deficiência de polinização em pomares estabelecidos.

Introdução

A ameixa japonesa(Prunus salicina Lindl.) é nativa da China1. No séculoXIX, esta cultura foi introduzida do Japão para os Estados Unidos, onde foi intercalada com outras ameixas diploides norte-americanas2. No séculoXX, alguns desses híbridos foram espalhados para regiões temperadas ao redor do mundo. Atualmente, o termo "ameixa japonesa" refere-se a uma ampla gama de híbridos interespecíficos derivados de cruzes entre a Salicina P. original com até 15 outros diploides Prunus spp.3,4,5.

A ameixa japonesa, como outras espécies da família Rosaceae, exibe a Autoincompatibilidade Gametofitica (GSI), que é controlada por um único e altamente polimórfico S-locuscontendo múltiplos alelos6. O S-locus contém dois genes que codificam uma ribonuclease (S-RNase) expressa no pistil, e uma proteína F-box (SFB) expressa no grão de pólen7. Na reação de autoincompatibilidade, quando o alelo Sexpresso no grão de pólen (haploide) é o mesmo que um dos dois expressos no pistil (diploide), o crescimento do tubo de pólen em todo o estilo é preso devido à degradação do tubo de pólen RNA pela ação do S-RNase8. Uma vez que esse processo impede a fertilização do gametofito feminino no ovulo, o GSI promove o cruzamento entre cultivares.

Embora algumas cultivares japonesas de ameixa sejam autocompatíveis, a maioria das cultivares cultivadas atualmente são auto-incompatíveis, e precisam de pólen de doadores intercompatíveis para fertilizar suas flores3. Em espécies de frutas de pedra do gênero Prunus como amêndoa9, damasco10,11,12 e cereja doce13, os requisitos de polinização de cultivares podem ser estabelecidos por diferentes abordagens. A auto-(in)compatibilidade pode ser determinada pela auto-polinização das flores no campo e monitoramento subsequente do conjunto de frutas, ou por auto-polinizações semi-in vivo em condições controladas em laboratório e pela observação de tubos de pólen sob o microscópio14,15,16,17,18 . As relações de incompatibilidade entre as cultivares podem ser determinadas por polinizações cruzadas no campo ou no laboratório utilizando pólen da cultivar polinizadora potencial, e pela identificação de S-alelosde cada cultivar pela análise PCR14,15,16,19,20,21,22 . Em espécies como cereja doce ou amêndoa, a auto-(in)compatibilidade também pode ser avaliada pela identificação de alelos S específicos associados à auto-compatibilidade, como S4' na cereja doce13 ou Sf na amêndoa23.

Vários programas de criação de ameixas dos principais países produtores estão liberando uma série de novas cultivares2,14, muitas delas com requisitos desconhecidos de polinização. Neste trabalho, descreve-se uma metodologia para a determinação dos requisitos de polinização em híbridos do tipo ameixa japonês. A auto-(in)compatibilidade é determinada por auto-polinizações tanto no campo quanto no laboratório, seguida por observações de tubos de pólen sob a microscopia de fluorescência. A seleção de cultivares polinizadores combina a identificação de S-genótipos pela análise pcr com o monitoramento do tempo de floração no campo.

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Protocolo

1. Polinização manual no campo

  1. Extração de pólen
    1. Para obter pólen, colete botões de flores no estágio D24,de acordo com o estágio 57 na escalaBBCH 25,26.
      NOTA: Mais botões de flores são necessários na ameixa japonesa do que em outras espécies de Prunus porque seus anteros produzem menos pólen.
    2. Retire os anteás usando uma malha plástica (tamanho de poros de 2 mm x 2 mm) e coloque-os no papel em temperatura ambiente por 24 h até que o anther deiscência.
    3. Peneirar os grãos de pólen através de uma malha fina (0,26 mm x 0,26 mm tamanho de poros), e conservar-os em um tubo de vidro de 10 mL com uma tampa a 4 °C até o uso.
  2. Polinização de flores emasculadas
    1. Quando entre 10% e 20% das flores estiverem abertas, selecione e marque vários ramos. Remova flores abertas e brotos jovens, deixando apenas botões de flores no estágio D24, de acordo com o estágio 57 na escala BBCH25,26.
    2. Remova as pétalas, sepalas e estamens entre 800 e 1.000 botões de flores por tratamento com unhas ou pinças.
    3. Polinize as mãos com a ajuda de um pincel fino 24 h após a emasculação. Alguns ramos contendo metade dos pistils com pólen da mesma cultivar, e a outra metade com pólen compatível de outra cultivar como controle. Tenha cuidado para não contaminar a ponta dos dedos ou pincel com grãos de pólen de outras cultivares.
    4. Recorde semanal de flores e frutas em desenvolvimento para caracterizar o padrão de queda de frutas e quantificar o conjunto final de frutas em cada tratamento de polinização.
  3. Polinização suplementar no campo
    1. Poucos dias antes das primeiras flores abrirem, inclua árvores selecionadas em uma gaiola de malha de 0,8 mm para evitar a chegada de insetos polinizadores.
    2. Quando 10%-20% das flores estiverem abertas, selecione e rotule vários ramos por tratamento de polinização, deixando de 1.000 a 1.500 flores por tratamento.
    3. No dia seguinte, quando as flores estão abertas, poliniza cada flor com a ajuda de um pincel com o pólen correspondente (pólen da mesma cultivar para auto-polinização, e de outras cultivares compatíveis como controle de polinização cruzada).
    4. Polinizar dia não até que todas as flores se abram.
    5. Recorde semanal de flores e frutas em desenvolvimento desde a anestesia até a colheita para caracterizar o padrão de queda de frutas e quantificar o conjunto final de frutas em cada tratamento de polinização.

2. Polinizações manuais em laboratório

  1. Colete 50-100 flores no estágio D24,de acordo com o estágio 57 na escalaBBCH 25,26.
  2. No laboratório, emascular 30 flores por tratamento (auto e polinização cruzada).
    NOTA: A emasculação deve ser procedida cuidadosamente para evitar qualquer dano nos pistils.
  3. Faça um corte fresco na base de cada pedicel de flores debaixo d'água antes de colocá-lo em um pedaço de espuma florista molhada (um pedaço de espuma para cada tratamento de polinização).
  4. Polinizar manualmente 24 h depois usando um pincel fino com pólen coletado anteriormente (ver seção 1.1). Polinizar um conjunto de pistils com pólen da mesma cultivar, e o outro conjunto com pólen de uma cultivar compatível como controle.
  5. Deixe os pistils polinizados 72 h após a polinização em temperatura ambiente. A espuma floral deve ser continuamente molhada com água.
  6. Fixar os pistils em uma solução fixativa de etanol/ácido acético (3:1) por pelo menos 24 h a 4 °C. Substitua o fixador por 75% de etanol. As amostras podem ser conservadas nesta solução a 4 °C até o usode 27.
    NOTA: Certifique-se de que as amostras estão completamente submersas na solução.

3. Observações microscópicas

  1. Avaliação da germinação in vitro de pólen
    1. Para elaborar o meio de germinação de pólen, dissolva 25 g de sacarose em 250 mL de água destilada e adicione 0,075 g de nitrato de cálcio [Ca(NO3)2] e 0,075 g de ácido bórico (H3BO3).
    2. Adicione 2 g de ágar à solução e misture até dissolver completamente28.
    3. Para esterilizar o meio, autoclave-o a 120 °C por 20 min. Esfrie o meio e, antes de solidificar, distribua 3 mL por placa de Petri estéril (55 mm x 12 mm) em uma capa de fluxo laminar estéril. Após a solidificação média, conservar as placas de Petri embrulhadas em papel alumínio a 4 °C até usar.
    4. Espalhe o pólen de cada cultivar anteriormente usado como doador de pólen nas polinizações controladas em duas placas de Petri e incuba-as a 25 °C por 24 h.
      NOTA: A mídia de cultura inoculada pode ser observada com microscopia imediatamente após ou armazenada a -20 °C até o uso. Para isso, as placas de Petri devem ser trocadas do congelador para a geladeira 24 h antes das observações de microscopia.
    5. Para observar os grãos de pólen, prepare 1% (v/v) solução azul anilina que mancha callose. Primeiro, prepare uma solução 0.1 N de fosfato de potássio tribasic (K3PO4) dissolvendo 7,97 g de K3PO4 em 1.000 mL de água destilada. Para elaborar a solução azul anilina de 1% (v/v), dissolva 1 mL de azul anilina em 100 mL de 0,1 N K3PO4.
    6. Adicione 2-3 gotas de solução azul anilina a cada placa de placa de Petri e observe após 5 min sob um microscópio de epifluorescência UV usando filtro de excitação BP340-390 e filtro de barreira LP425. Conte grãos viáveis e inviáveis de pólen em três campos por placa, cada campo contendo 100-200 grãos de pólen, em duas placas de Petri para cada cultivar.
  2. Crescimento do tubo de pólen
    1. Enxágüe os pistils fixos com água destilada três vezes (1h cada, 3h no total) e transfisse para 5% (w/v) sulfito de sódio (Na2SO3) a 4 °C por 24 h. Para preparar esta solução, dissolva 5 g de sulfito de sódio em 100 mL de água destilada.
    2. Autoclave os pistils a 120 °C por 8 min em 5% (w/v) sulfito de sódio para suavizar os tecidos.
    3. A abóbora amoleceu pistils em uma queda de 1% (v/v) solução azul anilina sob um vidro de cobertura em um slide para manchar callose.
    4. Observe o crescimento do tubo de pólen ao longo do estilo sob um microscópio com epifluorescência UV usando filtro de excitação BP340-390 e filtro de barreira LP425.

4. Determinando relações de incompatibilidade

  1. Extração de DNA de folhas
    1. Para extrair DNA, colete 3 a 4 folhas jovens de cada cultivar no campo, de preferência na primavera.
      NOTA: O DNA também pode ser extraído de folhas maduras, mas o DNA de folhas jovens tem compostos menos fenólicos.
    2. Isole o DNA usando um kit comercial e siga o kit de protocolo fornecido (ver Tabela de Materiais).
    3. Quantifique a concentração de DNA e avalie a qualidade do DNA de cada amostra a 260 nm em um espectrômetro de microvolume UV-Vis. Ajuste a concentração de DNA para 10 ng/μL.
  2. Condições de PCR para amplificação de fragmentos
    1. Rotule tubos e tampas PCR de 0,2 mL.
    2. Prepare os reagentes PCR de acordo com a Tabela 1 e deixe-os descongelar no gelo.
    3. Configure um volume de mistura mestre de cada par de primers em um microtubo de 1,5 mL de acordo com o número de reações mais 10% de excesso, considerando um volume de 16 μL por reação. Adicione os reagentes seguindo a ordem na Tabela 1 e misture bem.
    4. Aliquot 16 μL de mistura mestre em cada tubo PCR de 0,2 mL contendo 4 μL de modelo de DNA ou 4 μL de água esterilizada como controle negativo (C-). Use DNA de cultivares com genótipo conhecido como controles positivos. Misture suavemente, feche os tubos de reação com as tampas e centrifule a 2.000 x g por 30 s para coletar todo o volume na parte inferior do tubo de reação.
    5. Coloque os tubos de reação no termociclador e configure o programa PCR utilizando o seguinte perfil de temperatura: um passo inicial de 3 min a 94 °C, 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 1 min a 56 °C e 3 min a 72 °C, e um passo final de 7 min a 72 °C20.
  3. Eletroforese e estimativa do tamanho do fragmento
    1. Para preparar um mini gel agarose de 1,7% (w/v), dissolva 0,68 g de agarose e 40 mL de tampão 1x TBE em um frasco de 100 mL Erlenmeyer. Derreta a solução aquecendo em um micro-ondas a 600 W em intervalos de 30 s para evitar a ebulição.
    2. Deixe a solução ficar no banco para esfriar e, em seguida, adicione 3,5 μL de solução de coloração de ácido nucleico.
    3. Coloque a bandeja de gel no suporte de fundição e coloque o pente selecionado no molde de gel. Certifique-se de ter poços suficientes para cada produto PCR e escada de DNA.
    4. Despeje a solução de agarose no molde de gel e deixe esfriar até a polimerização. Remova o pente do gel polimerizado. Coloque o gel no sistema de eletroforese horizontal contendo tampão TBE suficiente para cobrir a superfície do gel.
    5. Carregue o primeiro e o último poço com 2 μL da escada de peso molecular do DNA (1 kb escada de DNA). Carregar 3 μL de cada produto do PCR nos outros poços. Feche a câmara, ligue a potência e execute o gel a 100 V por 30 min.
    6. Observe o gel sob luz UV usando um sistema de documentação de gel. Use a escada de peso molecular do DNA para determinar o tamanho do fragmento amplificado e compará-lo com os controles positivos, a fim de identificar os alelos correspondentes.

5. Monitorando datas de flores

  1. Monitore a fenologia de diferentes árvores de cada cultivar em floração ao longo de anos diferentes. Estabeleça a duração do período de floração do primeiro (cerca de 5%) até as últimas flores abertas (cerca de 95%). A floração completa é considerada quando pelo menos 50% das flores estão no estágio F24,de acordo com o estágio 65 na escalaBBCH 25,26.
  2. Para comparar as datas de floração de cultivares intercompatíveis e determinar aquelas que coincidem em época de floração todos os anos, elaborou um calendário de tempos de floração com dados de vários anos.

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Resultados

Cada broto de flor de ameixa japonês contém uma inflorescência com 1-3 flores. Como em outras espécies de frutas de pedra, cada flor é composta de quatro prostitutas: carpel, estamens, pétalas e sepalas, que são fundidas formando um copo na base da flor. As estruturas florais são menores do que outras frutas de pedra, com um mitil curto e frágil cercado pelos estamens que contêm uma pequena quantidade de grãos de pólen. Em plena floração, as flores de cada inflorescência aparecem separadas em talos curtos, mostrando as p...

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Discussão

A metodologia aqui descrita para os requisitos de polinização das cultivares japonesas de ameixa requer determinar a auto-(in)compatibilidade de cada cultivar por polinizações controladas no campo ou no laboratório, e a observação subsequente do crescimento do tubo de pólen com microscopia de fluorescência. As relações de incompatibilidade são estabelecidas pela caracterização dos S-alelos por genotipagem molecular. Por fim, a seleção de polinizadores é realizada pela fenoologia de monitoramento para detectar as...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional de Investigação y Tecnología Agraria y Alimentaria (RFP2015-00015-00 e RTA2017-00003-00); Gobierno de Aragón — Fundo Social Europeu, União Europeia (Grupo Consolidado A12-17R) e Junta de Extremadura — Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), Plano Regional de Investigação (IB16181), Grupo de Investigação (AGA001, GR18196). O B.I. Guerrero foi apoiado por uma bolsa do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología do México (CONACYT, 471839).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ácido acéticoGlacial Panreac131008.1611
ÁgariNtRON Biotecnologia25999
Azul de anilinaDifco8504-88
Ácido bórico (H3BO4)Panreac131015.1210
Nitrato de cálcio 4-hidrato (Ca(NO3)2 · 4H2O)Panreac131231.1211
CoverglassDeltalabD10246024 mm x 60 mm
Camera Imaging Developmet SystemsUI-1490SE
Camera Software SuiteImaging Developmet Systems4.93.0.
DNA OligosThermoFisher Scientific
dNTP Mix, 10 mM cadaThermoSischer ScientificR0193
DreamTaq Green DNA polimeraseThermoFisher ScientificEP0713
Etanol 96°VWR-Chemicals83804.360
1Kb DNA Ladder (Patente dos EUA No. 4.403.036) (500pb-12Kb)Invitrogen15615-016Tamanho: 250µ g; Conc: 1.0 µ g/µ l
Sistema de Documentação de GelBio-Rad1708195
Contador de MãosTamacoTM-4
Software de Laboratório de ImagensSistema de Análise de Imagem Bio-Radpara Sistema de Documentação de Gel
MetaPhor AgaroseLonza50180
Microcentrífuga 5415 RZ605212Eppendorf
com UV epifluescênciaLeicaDM2500Filtro excitador BP340-390, Filtro de barreira LP425
MicroslidesDeltalabD10000426 mm x 76 mm
Mini Sistema de EletroforeseFisherbrand14955170
MinicentrífugaThermoFisher Scientific15334204
NanoDrop 1000 EspectrofotômetroThermoFisher ScientificND1000
Placas de PetriDeltalab20020155 mm x 14 mm
Fosfato de Potássio Tribásico (K3PO4· 1.5H2O)Panreac141513
Primer para a frente 'Pru C2'ThermoFisherScientific
Primer para a frente Pru T2'ThermoFisherScientific
Primer reverso 'PCER'ThermoFisherScientific
RedSafe Solução de coloração de ácido nucleicoiNtRON Biotechnology21141
SacarosePanreac131621.1211
Sulfito de sódio anidro (Na2SO3)Panreac131717.1211
Kit de extração de DNA de plantas SpeedtoolsBiotools21272
TBE Buffer (10X)PanreacA0972,5000PE
Termociclador T100Bio-Rad
Thermomixer comfortEppendorfT1317
Autoclave Vertical Presoclave IIJP Selecta4001725
VortexFisherbrand11746744
Digital Digital Microscópio 1861096

Referências

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