Isolamento de RNA fecal (micro)

O RNA extracelular está sendo reconhecido como um fator significativo que medeia muitos processos biológicos¹. O RNA extracelular em fezes foi relatado pela primeira vez em 2008 como um marcador para câncer de cólon e colite ulcerativa ativa², e foi recentemente revelado como um componente normal do lúmen intestinal e fezes e medeia as comunicações hospedeiro-micróbio ^3,4,5. O objetivo deste protocolo de isolamento de RNA é extrair RNA extracelular de alta qualidade de amostras fecais coletadas de animais e seres humanos. O protocolo foi adaptado de um kit comercial de isolamento de miRNA. O RNA adquirido é utilizado para análises a jusante, como sequenciamento de RNA, RT-PCR e microarray. O protocolo inclui várias dicas importantes e úteis para maximizar a quantidade e a qualidade do RNA encontrado nas fezes de animais e humanos. A razão para desenvolver e otimizar este método de isolamento de RNA (incluindo microRNA) é diminuir o RNA microbiano nas fezes, limitar as variáveis nos estudos de pesquisa e analisar a composição de RNA no intestino sem contabilizar vários fatores de confusão e fontes de contaminação. De notar, este isolamento de RNA minimiza a liberação de RNA de células vivas e micróbios vivos (RNA celular). Ele se concentra em RNAs extracelulares que foram liberados pelas células intestinais ou foram adquiridos através da ingestão de alimentos. Principalmente, este método não é adequado para estudos em que o transcriptoma microbiano é investigado.

Todos os métodos envolvendo animais de pesquisa descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Todos os métodos que envolvem sujeitos de pesquisa humana descritos aqui estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Pesquisa Humana dos Parceiros.

1. Coleta de amostras fecais

1. Autoclave ou prepare um tubo de microcentrífuga estéril e livre de nuclease de 2 mL com uma tampa de rosca para cada animal sujeito em um experimento.
   1. Para seres humanos, forneça um dispositivo de coleta de amostras de fezes apropriado, livre de nuclease e estéril para cada indivíduo.
2. Coletar 25-100 mg (aproximadamente 1-4 pellets fecais para amostras fecais de camundongos) de amostras fecais de cada animal em um ambiente estéril.
   NOTA: Dois ou mais pellets fecais (~ 50 mg ou mais pesados) são preferidos para a obtenção de RNA da mais alta pureza.
   1. Utilize todos os Equipamentos de Proteção Individual (EPI) e materiais necessários, por exemplo: um par de luvas de laboratório, um spray desinfetante e uma toalha de papel estéril, para esterilizar a área de trabalho, onde o sujeito da pesquisa animal é colocado, para evitar a contaminação da amostra fecal.
      1. Para seres humanos, instrua cada sujeito de pesquisa / coletor a coletar 100-200 mg de amostras de fezes em um ambiente o mais estéril possível. Use a operação estéril padrão e evite a contaminação da amostra de fezes.
3. Coletar amostras fecais de cada animal diretamente em um tubo de microcentrífuga de 2 mL com uma tampa de rosca sem tocar em quaisquer outras superfícies para evitar a contaminação.
   1. Para seres humanos, instrua cada sujeito a defecar diretamente em um dispositivo de coleta aplicável fornecido (por exemplo, um kit de coleta de amostras de fezes estéreis) para evitar a contaminação.
      NOTA: Instrua o sujeito a evitar a contaminação por superfícies de vaso sanitário, água, urina ou quaisquer outras superfícies/objetos não estéreis.
4. Congelar amostras fecais coletadas em tubos microcentrífugos de 2 mL imediatamente a -80 °C ou colocar em um balde de gelo seco para a melhor quantidade e qualidade de RNA antes da ressuspensão das fezes, conforme descrito nas etapas abaixo.
   1. Para os espécimes de fezes humanas, alíquota de cada espécime fresco de 200 mg em tubos de microcentrífuga de 2 ml com tampas de rosca e congelá-los a -80 °C antes da ressuspensão das fezes, conforme descrito abaixo.
      1. Para o armazenamento de amostras de fezes não em tubos de microcentrífuga de 2 mL com tampas de rosca, pesar e transferir 100-200 mg cada uma das amostras congeladas em tubos microcentrífugas separados de 2 mL com tampas de rosca antes da ressuspensão das fezes, conforme descrito abaixo.
         NOTA: Para amostras de fezes humanas, evite tomar mais de 200 mg de amostras de fezes para isolamento de ARN, uma vez que pode causar dificuldades nos passos seguintes. Com uma amostra sobrecarregada em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, a fase aquosa, a fase orgânica e a interfase podem não ser claramente formadas e separadas. O procedimento pode ser pausado aqui.

2. Preparações de soluções de lavagem

1. Adicione 21 mL de etanol 100% grau da American Chemical Society (ACS) à Solução de Lavagem 1 fornecida no Kit de Isolamento de miRNA (consulte Tabela de Materiais) para atingir o volume final de 30 mL, conforme mostrado na garrafa. Vórtice até que tudo se dissolva na garrafa.
2. Adicionar 40 mL de etanol 100% grau ACS à Solução de Lavagem 2/3 fornecida para atingir o volume final de 50 mL, conforme mostrado no frasco. Vórtice por 5 s ou até que a mistura final esteja bem misturada.

3. Preparações de equipamentos e materiais

1. Pulverize a área de trabalho e o equipamento, por exemplo: a bancada de laboratório, a área de trabalho no exaustor químico e os racks de tubos de microcentrífuga, com uma solução de descontaminação de ribonuclease (RNase) (por exemplo, solução de descontaminação de RNase comercialmente disponível). Para evitar a contaminação, aplicar com a solução de descontaminação da RNase nas superfícies, onde e sempre que considerado necessário.
2. Coloque um jaleco de laboratório limpo, coloque uma máscara facial e use luvas de laboratório apropriadas para proteger o RNA nas amostras fecais das nucleases presentes na pele humana. Pulverize luvas com uma solução de descontaminação de RNase e troque as luvas com frequência para evitar a contaminação.
3. Prepare um balde de gelo seco para amostras fecais armazenadas a -80 °C para evitar o descongelamento antes da ressuspensão das fezes e um balde de gelo para materiais, por exemplo: Ácido-Fenol: Clorofórmio, para prolongar a vida útil.
   NOTA: Certifique-se de que os materiais, incluindo os meios utilizados no protocolo, são estéreis sem contaminação das nucleases.

4. Resuspensão das fezes

1. Ressuspender 25-100 mg de amostras fecais em 600 μL de salina tamponada com fosfato (DPBS) estéril 1x Dulbecco.
   CUIDADO: As amostras fecais devem ser processadas imediatamente quando descongeladas a partir de -80 °C sem descongelamento parcial para minimizar a liberação de RNases e RNA celular à medida que os cristais de gelo se rompem nos compartimentos celulares internos e externos quando as células na amostra descongelam.
   1. Adicionar 600 μL de 1x DPBS ao tubo de microcentrífuga de 2 mL com uma tampa de rosca contendo amostras fecais à temperatura ambiente (RT).
   2. Incubar a mistura de amostras fecais submersas em 600 μL de 1x DPBS no tubo de microcentrífuga de 2 mL tampado por 30 min no RT.
   3. Ressuspenda a mistura por trituração com ponta de pipeta de 1 mL e vórtice bem com o tubo de microcentrífuga de 2 mL tampado. Para otimizar e aumentar a quantidade e a qualidade do RNA, ressuscite a mistura com um homogeneizador com a configuração para um ciclo a S4000 (ou 4000 rpm) e 45 s.

5. Extração orgânica

CUIDADO: Use o exaustor químico perigoso para as seguintes etapas até a Etapa 6 com o uso de ácido-fenol: clorofórmio e etanol 100% grau ACS devido à sua toxicidade e inflamabilidade. Troque os EPIs conforme necessário e siga as devidas precauções padrão ao lidar com materiais perigosos.

1. Extrair ARN com 600 μL de ácido-fenol: clorofórmio (o volume de ácido-fenol: clorofórmio necessário é igual ao volume inicial de 1x DPBS adicionados no Passo 4.1).
   1. Adicionar 600 μL de ácido-fenol: clorofórmio à suspensão da etapa 4.1.
      NOTA: Retirar o ácido-fenol: clorofórmio da fase inferior do frasco, uma vez que a fase superior é misturada com um tampão aquoso. Se a interfase entre essas duas fases for perturbada, espere e retire o ácido-fenol: clorofórmio somente quando a interfase se restabelecer para evitar a contaminação.
2. Vórtice a mistura por 60 s para misturar completamente. Alternativamente, para otimizar e aumentar a quantidade de RNA no rendimento, misture usando um homogeneizador com a configuração para um ciclo em S4000 e 45 s.
3. Centrifugar por 15 min a 10.000 x g em RT para separar as fases aquosa e orgânica com uma microcentrífuga. Após a centrifugação, a interfase deve ser compacta. Caso contrário, repita a centrifugação.
   NOTA: Se a interfase não puder ser tão compacta quanto o desejado, possivelmente devido à proporção desigual do volume inicial com o volume de adição de ácido-fenol: clorofórmio após várias repetições de centrifugação, proceder à recuperação da fase aquosa com um maior cuidado para evitar a contaminação.
4. Recupere a fase aquosa e transfira-a para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL com uma tampa de dobradiça (não fornecida pelo kit de isolamento de miRNA).
   1. Remova a fase aquosa (ou superior) cuidadosamente sem perturbar a fase inferior e transfira-a para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL com uma tampa de dobradiça. Observe o volume transferido (por exemplo, ~500 μL).
      NOTA: Quando a interfase é compacta e a fase superior é claramente separada, há possivelmente algumas minúsculas partículas residuais flutuando no topo da fase aquosa. Pipetar cuidadosamente para evitar estes resíduos e apenas recuperar a fase aquosa visível e claramente separada para garantir um rendimento de ARN de qualidade, mesmo que só possa obter um pequeno volume da fase aquosa.

6. Isolamento final do RNA

1. Adicionar 1,25 volumes de etanol 100% grau RT ACS à fase aquosa no tubo de microcentrífuga de 2 mL (por exemplo, adicione 625 μL de etanol a 100% se 500 μL de fase aquosa for recuperado da Etapa 5.4.). Vórtice 3 s.
2. Carregue a mistura aquosa de fase/etanol através do cartucho de filtro fornecido no kit de isolamento de miRNA.
   1. Para cada amostra, coloque o cartucho de filtro em um dos tubos de coleta fornecidos pelo kit.
      1. Pipetar e carregar 600 μL da mistura aquosa de fase/etanol no cartucho filtrante.
         NOTA: Vórtice a mistura brevemente para misturar completamente o etanol com fase aquosa antes de pipetar. Não mais de 700 μL da mistura aquosa de fase/etanol podem ser carregados de cada vez.
   2. Centrífuga a 10.000 x g por 90 s para filtrar através da mistura. Girar a uma velocidade mais alta pode danificar o filtro.
   3. Rejeitar o filtrado e repetir as etapas 6.2.1 a 6.2.2 até que toda a mistura seja filtrada através da mesma membrana filtrante em aplicações sucessivas. Mantenha e reutilize o mesmo tubo de coleta para lavar as etapas abaixo.
   4. Lavar o filtro com 700 μL de solução de lavagem de miRNA 1.
      CUIDADO: miRNA Wash Solution 1 contém tiocianato de guanidina que pode causar irritação da pele e danos oculares graves. Use os EPIs necessários, por exemplo: luvas, protetor facial, jaleco de laboratório de proteção. Troque as luvas com frequência, conforme necessário.
      1. Aplicar 700 μL de miRNA Wash Solution 1, a solução de trabalho preparada com o etanol 100% grau ACS, no cartucho filtrante.
      2. Centrífuga por 60 s para filtrar a Solução de Lavagem de miRNA 1 através do cartucho de filtro.
      3. Eliminar o filtrado do tubo de recolha e colocar o mesmo cartucho de filtro no mesmo tubo de recolha.
   5. Lave o filtro com solução de lavagem 2/3 uma vez cada com volumes de 700 μL, 500 μL e 250 μL consecutivamente.
      1. Aplicar 700 μL de Solução de Lavagem 2/3, a solução de trabalho preparada com o etanol 100% grau ACS, no cartucho filtrante.
         1. Centrífuga a 10.000 x g por 1 min.
         2. Eliminar o filtrado do tubo de recolha e colocar o mesmo cartucho de filtro no mesmo tubo de recolha.
      2. Aplicar 500 μL de solução de lavagem 2/3 no cartucho filtrante.
         1. Centrífuga a 10.000 x g por 1 min.
         2. Eliminar o filtrado do tubo de recolha e colocar o mesmo cartucho de filtro no mesmo tubo de recolha.
      3. Aplicar 250 μL de solução de lavagem 2/3 no cartucho do filtro.
         1. Centrífuga a 10.000 x g por 1 min.
         2. Eliminar o filtrado do tubo de recolha.
      4. Transfira o cartucho de filtro para um novo tubo de coleta e gire o conjunto por 5 minutos para remover o fluido residual do filtro.

7. Elute RNA com 50 μL de água livre de nuclease

1. Transfira o cartucho de filtro para um novo tubo de coleta. Pipetar 50 μL de água isenta de nuclease para o centro do filtro e tampar o tubo de recolha.
   1. Incubar no RT por 10 min.
   2. Gire por 5 min a 8.000 x g para recuperar o RNA no novo tubo de coleta.
   3. Determinar a concentração e a pureza do RNA fecal recuperado usando um fluorômetro. O RNA fecal recuperado pode ser armazenado a -80 °C.

RNAs representativos foram isolados de 50 mg de amostras fecais de camundongos (2 pellets fecais de camundongos) e 100 mg de amostras de fezes humanas, respectivamente, e eluídos em água livre de nuclease de 50 μL. A análise espectrofotômetro da concentração sugere que uma quantidade total de 49 μg e 16 μg de RNA foram isolados, respectivamente (Tabela 1). A pureza do RNA foi alta, conforme indicado por uma relação A260/A280 de ~2,0 e uma relação A260/A230 de ~1,8 (Tabela 1). Conforme relatado3, a maioria dos RNAs nas fezes são microRNA e esses microRNAs podem existir no exossomo. Consistente com isso, um ensaio de eletroforese baseado em chip de RNA sugere que isolados de RNA representativos de fezes de camundongos e humanos são baixos ou não de composições de RNAr 18S e 28S, e o tamanho dos isolados de RNA cai na pequena região de RNA (Figura 1A). Uma outra pequena eletroforese de RNA com a eletroforese baseada em chip revela que uma grande parte dos RNAs é do tamanho de microRNA (Figura 1B). Isso é consistente com a observação de que a quantificação concluída usando um pequeno bioanalisador de RNA é comparável à obtida com ensaios anteriores6.

Tabela 1: Análise representativa de nanogotas de RNA isolado com este protocolo. RNAs representativos foram isolados de 2 pellets fecais de camundongos ou amostras de fezes humanas de 100 mg, eluídas em água livre de nuclease de 50 μL. A concentração de RNA, a razão de A260/A280 e a relação de A260/A230 foram medidas com nanogota.

Figura 1: Análises representativas de eletroforese baseadas em chips da distribuição de tamanho de isolados de RNA fecal. (A) RNAs representativos isolados de 2 pellets fecais de camundongos (painel esquerdo) e 100 mg de amostras de fezes humanas (painel direito) usando o protocolo descrito aqui foram caracterizados usando o ensaio de eletroforese à base de chip. Este ensaio sugere que a maioria dos isolados de RNA eram RNA pequenos. (B) Os isolados foram então submetidos à eletroforese de RNA pequeno com o sistema de eletroforese baseado em chip para analisar a distribuição de tamanho dos isolados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram não haver interesses financeiros relevantes ou materiais relacionados ao método de pesquisa descrito neste artigo de protocolo.