Isolamento de RNA fecal (micro)

Resumo

Este protocolo isola RNA total de alta qualidade de amostras fecais de animais e seres humanos. Um kit comercial de isolamento de miRNA é usado com adaptação significativa para isolar o RNA puro com quantidade e qualidade otimizadas. Os isolados de RNA são bons para a maioria dos ensaios de RNA a jusante, como sequenciamento, micro-array e RT-PCR.

Resumo

Está ficando claro que o RNA existe no lúmen intestinal e nas fezes em animais e humanos. O protocolo descrito abaixo isola o RNA total, incluindo microRNAs de amostras fecais de animais e seres humanos. O objetivo é isolar o RNA total com alta pureza e quantidade para análises a jusante, como sequenciamento de RNA, RT-PCR e microarray. As vantagens deste protocolo otimizado no isolamento de miRNA são as capacidades de isolar produtos de RNA altamente purificados com etapas de lavagem adicionais descritas, aumento da quantidade de RNA obtida com um método aprimorado na ressuspensão da amostra e importantes dicas de descontaminação. Uma limitação é a incapacidade de processar e purificar amostras maiores de mais de 200 mg, pois esses tamanhos de amostra causariam uma dificuldade na formação clara da interfase. Consequentemente, o grande tamanho da amostra pode contaminar a fase aquosa a ser extraída conforme descrito no protocolo com matérias orgânicas que afetam a qualidade do RNA isolado no final. No entanto, os isolados de ARN de uma amostra de até 200 mg são suficientes para a maioria das análises a jusante.

Introdução

O RNA extracelular está sendo reconhecido como um fator significativo que medeia muitos processos biológicos¹. O RNA extracelular em fezes foi relatado pela primeira vez em 2008 como um marcador para câncer de cólon e colite ulcerativa ativa², e foi recentemente revelado como um componente normal do lúmen intestinal e fezes e medeia as comunicações hospedeiro-micróbio ^3,4,5. O objetivo deste protocolo de isolamento de RNA é extrair RNA extracelular de alta qualidade de amostras fecais coletadas de animais e seres humanos. O prot....

Protocolo

Todos os métodos envolvendo animais de pesquisa descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidado e Uso de Animais (IACUC) do Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Todos os métodos que envolvem sujeitos de pesquisa humana descritos aqui estão de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Pesquisa Humana dos Parceiros.

1. Coleta de amostras fecais

1. Autoclave ou prepare um tubo de microcentrífuga estéril e livre de nuclease de 2 mL com uma tampa de rosca para cada animal sujeito em um experimento.
   1. Para seres humanos, forneça um dispositivo de coleta de am....

Resultados

RNAs representativos foram isolados de 50 mg de amostras fecais de camundongos (2 pellets fecais de camundongos) e 100 mg de amostras de fezes humanas, respectivamente, e eluídos em água livre de nuclease de 50 μL. A análise espectrofotômetro da concentração sugere que uma quantidade total de 49 μg e 16 μg de RNA foram isolados, respectivamente (Tabela 1). A pureza do RNA foi alta, conforme indicado por uma relação A260/A280 de ~2,0 e uma relação A260/A230 de ~1,8 (Tabela 1). Conforme re.......

Discussão

É importante o uso da técnica livre de RNase para evitar a contaminação por RNase durante o isolamento⁷. Após a centrifugação e a formação de uma interfase compacta, é fundamental evitar a interfase, a fase inferior e o contaminante de partículas flutuando no topo da fase aquosa ao recuperar a fase aquosa. Além disso, duas etapas de lavagem com solução de lavagem 2/3 de 500 μL e 250 μL são adicionadas para eliminar contaminantes na membrana do filtro para uma qualidade otimizada. Além disso, um ma.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido-fenol: Clorofórmio, pH 4,5 (com IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, sem cálcio, sem magnésio	Luvas Thermo Fischer Scientific	14190-144
de isolamento de miRNA de
Tubos de microcentrífuga sem nuclease (1,5 mL, 2 mL)
Água sem nuclease (não tratada com DEPC)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipetador e pontas de pipeta sem nuclease (com filtro)
Homogeneizador PowerLyzer 24	QIAGEN	13155
RNaseZap Solução de descontaminação de RNase	Thermo Fischer Scientific	AM9780
			de Vórtice

Kit microcentrífuga mirVana Thermo Fischer Scientific AM1561 Agitador