Perfil metabólico de alta produtividade para refinamentos de modelo de microalgas

Triagem de fenótipo microarray do modelo alga Chlamydomonas reinhardtii
Os ensaios da PM testam a capacidade das algas de utilizar várias fontes de carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo em um meio mínimo. Nesta descrição dos métodos, demonstramos como os ensaios pm foram usados para identificar o metabolismo de carbono e nitrogênio. Cinéticas de utilização de carbono e nitrogênio foram medidas com um leitor de microplacão. Os dados foram analisados por meio de software PMI. As cinéticas sumárias das placas de ensaio PM selecionadas (PM01 e PM03) são mostradas na Figura 1. As "parcelas de xy" exibem as medidas de respiração ao longo do tempo traçadas para os ensaios das placas de 96 poços, onde o eixo y e o eixo x representam os valores das medições brutas e do tempo, respectivamente. Os dados foram convertidos em um padrão de mapa de calor para analisar comparativamente a montagem dos dados cinéticos.

O pipeline de refinação da rede metabólica em escala genoma usando dados pm (Figura 2) ilustra a integração dos ensaios pm de alto rendimento com evidências experimentais fornecidas por pesquisas genômicas pode expandir um modelo de rede metabólica.

Para determinar a reprodutibilidade dos dados pm obtidos das placas PM01 - 04 e PM10, foi analisada uma regressão linear para traçar os dados de dois experimentos independentes de réplica um contra o outro (Figura 3). A Figura 3 mostra que a maioria dos dados foi quase semelhante à queda na linha 45°, com apenas alguns outliers presentes, e seu coeficiente de determinação R2 foi de 0,9. A consistência e a reprodutibilidade dos experimentos para as algas são verificadas por esta trama.

Identificação de novos metabólitos
O relatório da PM identificou 662 metabólitos em sete placas; PM01-PM04 e PM06-PM08, enquanto o Tempo de Voo (GC-TOF) identificou 77 metabólitos32 (Figura 4). Ao comparar esses dois conjuntos com os metabólitos 1068 contabilizados no iRC1080, apenas seis metabólitos se sobrepuseram entre os três conjuntos, e 149 se sobrepuseram entre o iRC1080 e o PM. Este resultado demonstra que a plataforma de perfil metabólico pode ser uma fonte significativa de novas informações metabólicas.

O ácido acético foi a única fonte de carbono detectada na placa PM01 como um carbono de suporte depois de subtrair o sinal de fundo. Esse achado é consistente com a literatura33 e mostra a especificidade dos ensaios da PM. Os ensaios da PM revelaram novas fontes de enxofre, fósforo e nitrogênio que C. reinhardtii pode utilizar para o crescimento. Os metabólitos de enxofre foram sulfato, tiossulfato, tetrathionato e DL-Lipoamida. As fontes de fósforo foram tiofosfato, dithiofosfato, ácido D-3-fosfo-glicerico, e cisteamina-S-fosfato. Os metabólitos de fonte de nitrogênio foram l-amino e D-aminoácidos, incluindo aminoácidos menos comuns; L-homoserina, L-piroglutámica, metilamina, etilamina, etanolamina e D,L-α-amino-butírico, e 108 Di-peptídeos e cinco Tri-peptídeos(Tabela 1). Todos os 128 metabólitos recém-identificados foram pesquisados em KEGG e MetaCyc por suas reações associadas, números ce e caminhos.

Os novos 128 metabólitos foram associados a 49 números únicos de CE. Destes, 15 CEs foram vinculados às suas evidências genômicas usando cinco fontes, incluindo; Fitozoma Versão 10.0.234 JGI Versão 435, AUGUSTUS 5.0, e 5.210 anotações de Manichaikul et al. 36 e KEGG13. Metabólitos sem evidência genômica foram inseridos no site do Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 onde suas sequências relacionadas foram encontradas em outros organismos. Sequências homólogos em C. reinhardtii foram identificadas executando A BLAST Iterada Específica da Posição (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) do site da NCBI considerando apenas sequências que produziram alinhamentos significativos (valor E <0,005).

Refinamento de modelo
Reações associadas aos novos 128 metabólitos, juntamente com seus genes codificados, foram adicionadas ao modelo iRC1080, expandindo a rede. O modelo resultante iBD1106, responde por 2.444 reações, 1.959 metabólitos e 1.106 genes(Tabela 2). As novas 254 reações adicionadas foram 20 reações de oxidação de aminoácidos, 108 reações de hidrólise di-peptídeo, cinco reações de hidrólise de tripeptídeos e 120 reações de transporte, codificadas por quatro genes (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

Um total de 113 novas reações adicionadas explicam a hidrólise de di-peptídeos e tri-peptídeos. A hidrólise de di-peptídeos e tri-peptídeos estão associadas a dois genes, um para di-peptídeos (Cre02.g078650.t1.3) e um para tri-peptídeos (Cre16.g675350.t1.3).

Quanto às fontes de fósforo, foi adicionada uma reação para hidrólise da cisteamina-S-fosfato em cisteamina e fosfato associado ao gene JLM_162926.

A ferramenta WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) e os resultados relatados por Ghamsari et al. 35 foram aplicados para obter a especificação dos compartimentos celulares onde ocorrem as novas reações. Analisando sequências proteicas associadas às novas reações, o WoLF PSORT previu o citosol como compartimento celular para as reações.

Um modelo metabólico gerado pode conter lacunas quando as informações bioquímicas estão incompletas. Nesses casos, gapFind, um comando COBRA, é usado. Ele lista lacunas radicais e permite a identificação de novas lacunas introdução no novo modelo. Os metabólitos que não podem ser produzidos em um modelo metabólico são referidos como lacunas radiculares40,41. Analisando a lacuna raiz indicou que ambos os modelos iRC1080 e iBD1106 contêm as mesmas 91 lacunas. Isso mostra que a adição dos novos metabólitos e suas reações associadas não introduziu lacunas adicionais. Deve-se notar que o método de fenotipagem utilizado neste protocolo não fecha lacunas radiculares, pois os metabólitos originais da lacuna raiz carecem de mecanismos de transporte ou produção, que não foram abordados nos ensaios de fenotipagem. A análise do balanço de fluxo foi realizada para testar o comportamento metabólico do iBD1106 em condições claras e escuras; (sem acetato) e (com acetato), respectivamente. O algoritmo maximiza as reações precursoras da biomassa para uma função objetiva (crescimento da biomassa). Para avaliar o envolvimento de cada metabólito à função objetiva definida, foram calculados os "preços das sombras" para todos os metabólitos. A mudança na função objetiva relativa às alterações de fluxo do metabólito define o preço sombra de um metabólito30,42. A indicação de se um metabólito está em "excesso" ou está "limitando" a função objetiva pode ser determinada pela análise de preço de sombra, por exemplo, produção de biomassa. Os valores negativos ou positivos dos preços das sombras revelam metabólitos que, ao adição, diminuirão ou aumentarão a função objetiva. Valores zero de preços de sombra revelam metabólitos que não afetarão a função objetiva. A comparação dos preços das sombras entre iBD1106 e iRC1080 na Figura 5 mostra que, para a maioria dos metabólitos, não se observa uma mudança significativa; no entanto, as diferenças são encontradas em 105 e 70 casos em condições claras e de crescimento escuro, respectivamente. A Tabela 4 inclui exemplos desses metabólitos.

Figura 1: Perfil de microarray fenotípico de C. reinhardtii. Respiração XY-plots e parcelas de nível do PM01 (fontes de carbono; A, C) e PM03 (fontes de nitrogênio; Placas de ensaio B, D) são mostradas. A figura é uma matriz 8x12 onde cada célula representa uma placa de bem e, portanto, um determinado metabólito ou ambiente de crescimento. Dentro de cada célula ou representação de poço, as curvas representam a conversão de corante por redução (eixo y) em função do tempo (eixo x). As curvas de respiração PM do CC-503 e os poços em branco são mostrados em cada célula e são indicadas por cor (a cor teal representa poços em branco e a cor roxa representa CC-503). O gráfico de nível representa cada curva de respiração como uma fina linha horizontal mudando de cor (ou permanecendo inalterada) ao longo do tempo. As mudanças de cor do mapa de calor são de amarelo claro (pouca ou nenhuma respiração ocorreu) para laranja escuro ou marrom (respiração significativa ocorreu). Metabólitos utilizados por C. reinhardtii (CC-503) e as placas em branco são mostrados. Este valor é de um trabalho publicado anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 2: Tubulação de refinamento de rede metabólica em escala de genoma usando dados pm. Após um novo composto testar positivo em um ensaio pm, seu número da Comissão de Enzimas (CE), reação e via são identificados a partir de bancos de dados disponíveis, por exemplo, KEGG e MetaCyc. A evidência genômica é então extraída de recursos genômicos e de anotação quando disponíveis e constitui uma ligação entre genótipo e fenótipo. Quando evidências genômicas diretas não estão disponíveis, a sequência de proteínas é identificada a partir dos números da CE, e evidências genéticas são identificadas via PSI-Blast. A rede metabólica reconstruída é então refinada com base em compostos recém-identificados, mas somente após uma etapa de controle de qualidade que implica consultar os domínios de proteínas usando bancos de dados relevantes. Este valor foi modificado a partir de trabalhos publicados anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 3: Reprodutibilidade dos testes pm. Os valores do PMI foram coletados em um período de 168 horas, e os valores máximos do PMI foram traçados para dois estudos de replicação. Cada eixo representa os valores máximos do PMI para cada estudo (sendo o eixo x um estudo de réplica e o eixo y outro). Os valores reproduzidos são equidistantes de cada eixo. Cada ponto representa um único valor máximo. A regressão linear foi realizada por um software de planilha, e o coeficiente resultante de determinação (R2) é mostrado. Este valor foi modificado a partir de trabalhos publicados anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 4: Diagrama de venn de metabólitos. O diagrama de Venn enumera metabólitos identificados por placas pm, o modelo metabólico iRC1080 e experimentos de Tempo de Voo de Cromatografia Gas (GC-TOF). Cada círculo indica o número total de metabólitos que existem em cada método de estudo. Ao mesmo tempo, as regiões sobrepostas representam o número de metabólitos compartilhados entre esses métodos. O modelo metabólico iRC1080 contém um total de 1.068 metabólitos únicos. O GC-TOF identificou um total de 77 metabólitos32,enquanto há um total de 662 metabólitos identificados utilizando as placas da PM. Este valor é de trabalho publicado anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Preços de sombra de metabólitos em iRC1080 e iBD1106 em diferentes condições para maximização da biomassa. Cada círculo nas "parcelas de radar" corresponde a um valor de preço de sombra, enquanto cada linha que se estende do centro de uma parcela indica um metabólito. (A) Preços das sombras e comportamentos metabólicos de iRC1080 e iBD1106 sob uma condição de crescimento leve; (B), diferentes comportamentos metabólicos de iRC1080 e iBD1106 sob uma condição de crescimento escuro. Este valor é de trabalho publicado anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Lista de metabólitos de utilização de substrato positivo identificados (C, P, S, N) não presentes no modelo metabólico iRC1080.   *A reação não foi incluída se nenhum gene foi identificado.  1 Fitozoma versão 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   algarismo JGI versão 4 35.  3 Augustus versão 510.  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 Versão JGI 3.136.  Esta tabela é de trabalhos publicados anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12

Tabela 2: Conteúdo de iRC1080 e iBD1106.  Esta tabela é de trabalhos publicados anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12

Tabela 3: Resumo das novas reações no iBD1106. Esta tabela é de trabalhos publicados anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12

Tabela 4: Exemplo de preços de sombra significativos para iRC1080 e iBD1106. Esta tabela é de trabalhos publicados anteriormente por Chaiboonchoe et al. 12

Os autores não têm nada a revelar.