Summary
本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。
Abstract
生理的電界(EF)は、細胞の移動、分化、分裂、死に重要な役割を果たしています。本論文では、顕微鏡を用いた長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムについて述べている。マイクロ流体システムは、光学的に透明な電気戦術チップ、透明なインジウムスズ酸化物(ITO)ヒーター、培養メディア充填ポンプ、電力供給、高周波パワーアンプ、EFマルチプレクサ、プログラマブルX-Y-Z電動ステージ、およびデジタルカメラを搭載した逆位相対向顕微鏡の主要コンポーネントで構成されています。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。この研究は、直流(DC)パルス刺激によって誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化を伴う。幹細胞維持培地では、マウスNPC(mNPC)は、DCパルス刺激後にニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化した。この結果は、単純なDCパルス治療がmNPCの運命を制御し、神経系障害の治療戦略を開発するために使用できることを示唆している。このシステムは、複数のチャネルでの細胞培養、長期EF刺激、細胞形態観察、および自動タイムラプス画像取得に使用できます。このマイクロ流体システムは、必要な実験時間を短縮するだけでなく、微小環境の制御精度を向上させます。
Introduction
神経前駆細胞(NPC、神経幹および前駆細胞とも呼ばれる)は、神経変性治療戦略1の有望な候補となり得る。未分化NPCは自己再生能力、多効力、増殖能力2,3を有する。以前の研究では、細胞外マトリックスと分子メディエーターがNPCの分化を調節することが報告されています。表皮成長因子(EGF)及び塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)はNPC増殖を促進し、従って未分化状態を維持する4。
これまでの研究では、電気刺激は、除算5、移動6、7、8、分化1、9、10、および細胞死11のような細胞生理学的活動を調節することができるという報告がある。電気分野(EF)は、中枢神経系の発達12,13,14の発達と再生において重要な役割を果たす。2009年から2019年にかけて、この研究室は、マイクロ流体システム1、6、7、8、15、16、17におけるEFの適用に対する細胞応答を調査した。マルチチャネル、光学的に透明な電気戦術(MOE)チップは、共焦点顕微鏡用の免疫蛍光染色に適するように設計された。このチップは、高い光学透過性と耐久性を有し、1回の研究で3つの独立した刺激実験といくつかの免疫染色条件の同時実施を可能にした。マイクロ流体システムは、全体的な実験のセットアップを簡素化し、さらに試薬とサンプルの消費を簡素化する上で有益です。本論文では、長期細胞分化研究に用いたマイクロ流体細胞培養システムの開発について述べた。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MOEチップの設計と製作
- 適切なソフトウェアを使用して、個々のポリメチルメタクリレート(PMMA)層と両面テープのパターンを描画します(図1A、材料表)。PMMAシートと両面テープの両方をCO2レーザーマシンスクライバで切ります(図1B)。
- CO2レーザースクライバの電源を入れ、パソコンに接続します。ソフトウェアを使用して、設計されたパターンファイルを開きます。
- レーザースクライバのプラットフォーム上にPMMAシート(275mm x 400 mm)または両面テープ(210mm x 297 mm)を置きます(図2A)。オートフォーカスツールを使用して、レーザーをPMMAシートまたは両面テープの表面に焦点を合わせます。
- レーザースクリバをプリンタとして選択し、レーザースクリバを使用してPMMAシートまたは両面テープ上で直接切り捨てを開始し、PMMAシートまたはテープ上の個々のパターンを取得するパターンを「印刷」します(図2B)。
- PMMAシートから保護フィルムを取り出し、窒素ガスを使用して表面を洗浄します。
注:PMMAパターンの描画とPMMAシートの直接加工は、前のレポート17に従って行われました。 - PMMAシートの複数の層を結合する場合は、1mm PMMAシート(層1、2、および3)の3枚を積み重ね、110°Cで30分間熱ボンダーで5kg/cm2の圧力で結合し、流れ/電気刺激チャネルアセンブリを形成する(図2C)。
注:市販のPMMAシートの異なるバッチは、わずかに異なるガラス転移温度(Tg)を有する。最適なボンディング温度は、Tgに近い5°Cの増分でテストする必要があります。 - MOEチップアセンブリのレイヤ1の個々の開口部に、高速作用のシアノアクリレート接着剤で12個のアダプタを貼付します。
注: アダプターは射出成形によって PMMA で作られています。底面の平らな面はMOEチップに接続するための。1/4W-28メスねじねじを持つアダプターは、白い指密栓、平底コネクタ、またはLuerアダプタを接続するためのものです。速効性シアノアクリル酸接着剤を使用する場合は注意してください。目に飛び散らないように。 - チップを組み立てる前に30分間紫外線(UV)照射を用いて、1mmPMMA基板(層1~3)、両面テープ(層4)、3mm光学グレードPMMA(UV)照射を用いて消毒する(図1A)。
- 3 mm の光学グレード PMMA (レイヤー 5) に 1 mm の PMMA 基板 (レイヤ 1~3) を両面テープ (レイヤ 4) に付着して PMMA アセンブリを完成させます (図1A)。
- チップのアセンブリ用に清潔なカバーガラスを用意します。
- 汚れた瓶に洗剤の10倍の希釈を充填し( 材料のテーブルを参照)、15分間超音波洗浄機を使用して、この洗剤のカバーガラスをきれいにします。
- 水道水の下で染色瓶を十分に洗い流し、洗剤の痕跡をすべて取り除きます。
- 蒸留水ですすい続け、水道水の痕跡をすべて取り除き、ステップ1.7.2を2回繰り返します。
- 洗浄したカバーガラスを窒素ガスで吹き付けて乾燥させます。
- PMMAアセンブリ(層1~5)、両面テープ(層6)、およびカバーガラス(レイヤ7)をバイオセーフティキャビネット内で30分間UV照射して、チップを組み立てる前に消毒する(図1A)。
- 洗浄されたカバーガラス(レイヤ7)を、両面テープ(レイヤ6)でPMMAアセンブリ(レイヤ1~5)に貼り付けます(図1A)。
- MOEチップを真空チャンバーに一晩インキュベートします。後の手順には MOE チップ アセンブリを使用します (図 3)。
2. 細胞培養領域の基質にポリL-リジン(PLL)をコーティング
- ポリテトラフルオロエチレンチューブ、フラットボトムコネクタ、コーンコネクタ、コーンルエルアダプタ、白指密プラグ(ストッパーとも呼ばれる)、ルアーアダプタ、ルアーロックシリンジ、ブラックラバーバン(図4A、材料表)を準備します。121°Cでオートクレーブ内の上記のコンポーネントをすべて30分間殺菌します。
- 寒天ブリッジアダプター(図1A)の開口部を白い指密プラグでシールします。フラットボトムコネクタを、中型の入口アダプタとコンセントアダプタを介してMOEチップアセンブリに接続します(図4B)。コーン-ルアーアダプターを3ウェイストップコックに接続します。
- 0.01% PLL溶液の2 mLを加え、3 mLのシリンジを使用して、媒体の入口の3方向のストップコックに接続します(図4B-
)。 - 空の3 mLシリンジを、媒体出口の3方向ストップコックに接続します(図4B-
)。 - PLL溶液で細胞培養領域を充填します。手動でコーティング溶液をゆっくりと前後にポンプで送ります。2つの三方ストップコックを閉じて、培養地域内の溶液を密封します。
- MOEチップを5%CO2雰囲気で満たしたインキュベーターで一晩37°Cでインキュベートします。
)。
)。3. 塩橋網の整備
- ステップ2.6に続いて、2つの3ウェイストップコックを開き、2つのスポイジを使用してチャネル内でコーティング溶液を前後に手動でポンピングすることによって、チャネル内の気泡を洗い流します。
- 完全な培地(ダルベックの修飾イーグルの培地/ハムの栄養素混合物F-12(DMEM/ F12)からなる幹細胞維持培地)の3 mLを、2%B-27サプリメント、20 ng/mL EGF、および20 ng/mL bFGFを3mLのシンジに引き込み、中型図4B(4B)の3ウェイストップコックに接続する。
- 完全培地の3 mLを加えて、細胞培養領域のコーティング溶液を交換します。空の5 mLシリンジを、媒体出口の3方向ストップコックに接続します(図4B-
)。 - ソルトブリッジネットワークを準備します(図5)。
- 黒いゴムバンを切ってギャップを作り出し、銀(Ag)/塩化銀(AgCl)電極を黒いゴム製のバンを通してルアーロックシリンジに挿入します(図4A)。
- 白い指密プラグをLuerアダプタに交換し、3%の熱いアガロースを注入してLuerアダプタを充填します。
注:熱いアガロースの調製のために、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の100 mLにアガロース粉末の3gを溶解し、30分間121°Cでオートクレーブで殺菌します。 - ルアーロックシリンジをLuerアダプタに接続します。黒いゴム製のバンを通して3%の熱いアガロースを注入し、注射器を針で使用してルアーロックシリンジを充填します。アガロースが冷めて固めるのに10〜20分を許します。
メモ: アガロースのボリューム容量を増やすために、Luerロックシリンジは Luer アダプタに取り付けられています(図 4 および 図 5)。次いで、大きな電極をルアーロックシリンジに挿入する。電極は、長期実験に安定した電気刺激を提供することができる。
)。4. mNPCの準備
- mNPC1を完全培地で37°Cで25T細胞培養フラスコで培養し、5%CO2雰囲気で満たしたインキュベーターに培養する。細胞を3〜4日ごとにサブ培養し、元のソースから3〜8回の通過を受けた細胞を用いて全ての実験を行う。
- 細胞懸濁液を15 mL円錐状チューブに移し、5分間100×gで神経球をスピンダウンします。上清を吸引し、1xダルベッコのPBS(DPBS)で神経球を洗う。神経球を100×gで5分間スピンダウンします。
- 1x DPBSを吸引し、その後、完全な培地中の神経球を再中断します。よくやさしく混ぜます。
- 出口の3方向の停止コックに接続する1 mLのシリンジを使用して、神経圏懸濁液の1 mLを加える(図4B- )。
DCパルス刺激用マイクロ流体システムのセットアップ (図6)
- プログラム可能な X-Y-Z の電動ステージに取り付けられている透明な ITO ヒーターにセルシード MOE チップを取り付けます。
メモ:ITO表面温度は、比例積分誘導制御装置によって制御され、37°Cに維持されます。 K型熱電対は、チップとITOヒーターの間にクランプされ、チップ内の細胞培養領域の温度を監視します。MOEチップはプログラム可能なX-Y-Zのモーター化された段階で取付けられ、個々のチャネルセクションの自動タイムラプス画像獲得のために適している。ITOヒーターの製造と細胞培養加熱システムの設定については、前に18,19を説明した。 - MNPCを、媒体出口を介してMOEチップに手動でポンピングして注入します。セルシードの MOE チップを 37 °C ITO ヒーターに 4 時間インキュベートします。
- 4時間経過後、シリンジポンプを使用して、20 μL/hの流量で媒体入口を介してMOEチップを介して完全な媒体をポンプします。
注: mNPC は、細胞の取り付けと増殖を可能にする EF 刺激の前に、さらに 24 時間、チップ内で成長および維持されます。廃液は、出口の3方向停止コックに接続された空の5mLシリンジに集め、 図6Aの「廃棄物」として示す。MOE マイクロ流体システム構成を 図 6に示します。このマイクロ流体システムは、細胞に栄養の連続的な供給を提供します。完全な新鮮な媒体は連続的に一定のpH値を維持するためにMOEチップにポンプで送られます。したがって、細胞はCO2 インキュベーターの外側で培養することができる。 - 電線を使用して、EF マルチプレクサをチップの Ag/AgCl 電極を介して MOE チップに接続します。EF マルチプレクサとファンクション ジェネレータをアンプに接続して、50% デューティ サイクルで 100 Hz の周波数で 300 mV/mm の大波 DC パルスを出力します (50% タイムオンと 50% のタイムアウト) (図 6B)。
- 電線をEFマルチプレクサに接続します。Ag/AgCl電極を介して電気線をMOEチップに接続します。
- EF マルチプレクサを電気線でアンプに接続します。ファンクション・ジェネレータをアンプとデジタル・オシロスコープに接続します。
メモ:EFマルチプレクサは、回路内の培養チャンバのインピーダンスを含み、並列電子ネットワーク内のすべての個々のチャンバーを接続する回路です。3つの培養チャンバのそれぞれは、マルチプレクサ内の可変抵抗(Vr)とアンメクタ(図6AでμAとして示す)に直列で電気的に接続されています。各培養チャンバーを通る電流はVrを制御することによって変化し、電流は対応する電流計に示される。各細胞培養領域の電界強度はオームの法則によって計算され、I=σEAは電流、σ(DMEM/F122用1.38S・m-1に設定)は、培養媒体の電気伝導率、Eは電界、Aは電気戦術室の断面積である。図1に示す細胞培養領域寸法の場合、電流は、DCおよびDCパルスの場合、それぞれ50%デューティサイクルで〜87mA、〜44mAである。
- mNPC を 48h の 100 Hz の周波数で 300 mV/mm のマグニチュードで正方形 DC パルスにします。完全な培地を10 μL/hの速度で連続的にポンプで送り、細胞に十分な栄養を供給し、培地中で一定のpH値を維持します。
6. パルスDC刺激後のmNPCの免疫蛍光アッセイ
注:このステップでは、すべての試薬は、注射器ポンプを使用して媒体の入口を介してポンプされます。
- 1を播種した後、3、7、または14日間のインビトロ(DIV)培養後、25μL/minの流量で細胞を20分間洗浄します。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)で細胞を固定します。20分間、25 μL/minの流量で4%PFAをチップに送り込み、1x PBSを交換します。4%のPFAを交換するには、25μL/minの流量で20分間、細胞を1x PBSで洗浄します。
- 0.1%トリトンX-100を50μL/minの流量でチップに送り込み、細胞を透過させます。さらに30分間細胞と反応するために流量を50 μL/hに減らします。0.1%トリトンX-100を交換するには、50μL/minの流量で1x PBSで細胞を6分間洗浄します。
- 1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSで細胞をブロックし、非特異的抗体結合を低減する。50 μL/min の流量で 1% BSA をチップに 6 分間ポンプで送ります。流量を100μL/hに下げ、ポンプを1時間下げます。
- 2重免疫染色用の抗体を50 μL/minの流量でチップに6分間ポンプで送り込み、4°Cで18時間インキュベートします。 50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。
- Alexa Fluor結合二次抗体を、50 μL/minの流量でチップに6分間ポンプで送ります。流量を50μL/hに下げ、暗い温度で1時間抗体をポンプで送ります。50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。
- 核染色の場合、Hoechst 33342を20 μL/minの流量で、暗闇の中で室温で10分間チップに送り込みます。50 μL/minの流量で1x PBSで細胞を15分間洗浄します。
- 免疫染色後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察する。
7. 画像解析とデータ処理
- 測定ツールを内蔵したソフトウェアを使用して蛍光画像を分析します( 材料表を参照)。
- コントロール群と治療群におけるHoechstカウンタード核(細胞の総数)を比較し、各表現型マーカーを発現する細胞の割合を計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MOE チップの詳細な構成を図 1に示します。マイクロ流体チップは、実験用セットアップサイズ、サンプル量、試薬量を削減するための有益なアプローチを提供します。MOEチップは、単独の研究で3つの独立したEF刺激実験と複数の免疫染色条件を同時に行うよう設計された(図3)。また、高い光学透過性を有するMOEチップは、共焦点顕微鏡検査に適しています。MOEチップはまた、異なる細胞培養条件(例えば、複数のEF刺激、複数の薬物、異なるコーティング基材、複数の一連の細胞)の効果を1回の実験で同時に調査するように設計されている。
mNPCは、方形波DCパルス(100Hzの周波数でマグニチュード300mV/mm)にさらされた。DCパルス刺激を48時間行った。分化した細胞を、Tuj1(ニューロン特異的III型βチューブリン)、グリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAPがアストロサイトを同定する)、およびオリゴデンドロサイトマーカーO4で免疫染色した。DCパルス処理後、mNPCはDIV 7で有意に多くのニューロン(Tuj1+細胞)を発現した。DIV 3では、アストロサイト(GFAP+細胞)は、コントロール(CTL)群よりも刺激群において比較的高いレベルで存在した。CTL群と比較して、オリゴデンドロサイト(O4+細胞)は、DIV 7およびDIV 14における刺激群において有意に高かった(図7)。これらの結果は、DCパルス刺激が幹細胞維持培地においてmNPCがニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに同時に分化することを示した。これらの結果は、MOEマイクロ流体システムが顕微鏡による長期細胞分化研究に適していることを示唆している。
図1: マルチチャンネル光学的に透明な電気戦術チップの詳細な構成。 MOEチップは、PMMAシート(50mm x 25 mm x 1 mm)、両面テープ(50mm×25mm x 0.07 mm)、アダプター(10mm x 10 mm x 6mm)、光学グレードPMMAシート(50mm x 75 mm x 3 mm)、両面テープ(24mm x 60mm x 0.07mm)、×mm(10mm)で構成されています。MOEチップには3つの細胞培養チャンバーがあります。MOEチップには、中程度の入口/出口と寒天塩橋の接続穴があります。細胞培養領域で培養した細胞(幅3mm×長さ42mm×高さ0.07mm)図1AはChangら6から修正された。(B)アダプター、PMMAシート、両面テープ、カバーガラスを含むMOEチップの写真。略語: MOE=マルチチャネル光学的に透明な電気的な電気的な戦術;PMMA = メタクリレートポリメチル。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:MOEチップの製造と組み立てプロセス (A) PMMAシートまたは両面テープの設計パターンをレーザーマイクロマシニングを用いて作製した。(B)個々のPMMAシートをCO2 レーザースクライバで切断した。(C)洗浄されたPMMAシートの複数の層を、熱ボンダによって結合した。略語: MOE=マルチチャネル光学的に透明な電気的な電気的な戦術;PMMA = メタクリル酸ポリメチル;CO2 = 二酸化炭素。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: MOEチップの写真 この図は、チャンら 6. から変更されています。略語: MOE=多チャンネル光学的に透明な電気的な電気的な戦術。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:MOEチップへの中電気接続( A)PTFEチューブ、フラットボトムコネクタ、コーンコネクタ、コーンルアーアダプタ、ホワイトフィンガータイトプラグ、ルアーアダプタ、ルアーロックシリンジ、ブラックラバーバン、Ag/AgCl電極を含む、MOEマイクロ流体システムの中流ネットワークおよびEFネットワークのコンポーネントの写真。(B)媒体流動ネットワークの構成の写真。略語: MOE=マルチチャネル光学的に透明な電気的な電気的な戦術;EF = 電場;PTFE = ポリテトラフルオロエチレン;Ag = シルバー;AgCl = 塩化銀。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:MOEチップを顕微鏡で示す写真。 略語: MOE=マルチチャネル光学的に透明な電気的な電気的な戦術;Ag = シルバー;AgCl = 塩化銀;ITO = インジウムスズ酸化物. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: DCパルス刺激に使用する構成とシステム( A) DCパルス刺激のためのシステム全体の構成。MOEチップに接続された注射器を中液注入および廃液流出に使用した。チップ内のDCパルスは、Ag/AgCl電極を介して行われた電源によって供給されました。装置のセットアップはデジタル カメラが装備されている逆の位相対照顕微鏡のX-Y-Zモーター化段階に取付けられた。(B)研究室のベンチでのセットアップを示す写真。略語: MOE=マルチチャネル光学的に透明な電気的な電気的な戦術;Ag = シルバー;AgCl = 塩化銀;ITO = インジウムスズ酸化物;EF = 電場。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:制御群(CTL)およびDパルス刺激群における制御3、7、および14におけるmNPC細胞の分化ニューロン(Tuj1+細胞)、アストロサイト(GFAP+細胞)、およびオリゴデンドロサイト(O4+細胞)の割合(A-C)におけるCTL群および(D-F)刺激(DCパルス)群。この図は、Changらの1によって出版されています。略語: CTL: 制御;DC = 直流電流;Tuj1 = ニューロン特異的クラス III βチューブリン;GFAP = グリア性フィブリル酸タンパク質;O4 = オリゴデンドロシテマーカーO4.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MOEチップの製造中、アダプターは高速作用性シアノアクリレート接着剤でMOEチップのレイヤ1に取り付けられます。接着剤は、アダプターの4つのコーナーに適用され、その後、圧力は、アダプターの上に均等に適用されます。接着剤の完全な重合を確実にするために接着剤の過剰な量を避ける必要があります。さらに、完成したMOEチップアセンブリは真空チャンバ内でインキュベートされます。このステップはPMMA層、両面テープおよびカバーガラス間の気泡を取り除くのに役立つ。
電極材料の選択は、培地中に豊富に存在する塩化物イオンが細胞培養領域を流れる電解物であるという事実に基づいている。EF刺激実験の間、電極の周囲のpHは一定のままでした。電極材料として白金(Pt)を用いたより簡単な構成は、水を電解し、正極と負極で水素イオン(H+)および水酸化物イオン(OH-)を生成し、それぞれ培養領域におけるpH変化を誘発する。Pt電極の使用を避けることは、EF刺激実験中のpH変化の問題を回避する。
塩橋網の準備中に、熱いアガロースと無泡アガロースが不可欠です。熱いアガロースは高い流動性を有し、容易に塩橋網に注入することができる。3%のホットアガロースをLuerアダプタに注入した後、LuerロックシリンジをLuerアダプタに接続します。このステップの間に、アガロースは塩橋ネットワークの泡のないしっかりした接続を達成することができるようにLuerロックシリンジに押し上げられる。塩橋の泡は電気抵抗を増加させるので、予想される電流に到達することができません。アガロース注射後、アガロースが冷却し、細胞培養領域に固化アガロース残骸の形成を防ぐために10〜20分間室温で固化するのを待つことが重要です。
MOEチップはプログラム可能なX-Y-Zのモーター化された段階でロックされるITOのヒーターに置かれる。システム全体は、デジタルカメラを搭載した逆位相対比顕微鏡に構築され、チップ内の細胞培養領域内の細胞分化を監視します。細胞の形態を観察し、インキュベーターの外のMOEマイクロ流体システムの自動タイムラプス画像の取得を行うのが便利です。このマイクロ流体システムは、必要な実験時間を短縮するだけでなく、微小環境の制御精度を向上させます。
mNPC細胞は、培養培地中で懸濁液として増殖する。しかし、MOEチップのPLLコーティングされたプレートに付着したmNPCは、差別化に不可欠です。30〜40細胞によって形成される神経球は、mNPC分化を開始するために好ましい。mNPCの過剰増殖は分化プロセス中の細胞生存を損なう。さらに、パルスDC刺激後、実験実験で免疫蛍光染色を流量に影響させることができる。したがって、洗浄中に細胞を剥離しないように、異なるステップでいくつかの流量を使用してください。
本研究では、この技術の限界は、チップの徹底的な洗浄が困難なためにMOEチップを再利用できないことである。しかし、MOEチップは位相コントラスト顕微鏡または走査型共焦点顕微鏡の下に直接配置することができます。報告されたマイクロ流体システムの水密設計は、バッファー/媒体の蒸発が発生しないことを保証し、バッファー/媒体の正確な濃度とそれに対応する電気的特性を維持します。試薬量と対応する動作時間を削減することにより、MOEマイクロ流体システムは、細胞分化を研究するための効率的なアプローチを提供します。
以前の研究では、EGFとbFGFが未分化状態でのNPC生存、拡張、およびメンテナンスを促進することを示している4.本研究では、DCパルスは、EGFおよびbFGFを含む幹細胞維持培地中のmNPCの分化を誘導した。これまでの研究では、EFはEGFおよびbFGF14、21、22を使用せずに分化培地中のNPCの分化を促進することが報告されている。これらの結果は、mNPCがDCパルス刺激後にニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイトに分化したことを示している。彼らはまた、単純なDCパルス治療がNPCの運命を制御することができることを示唆している。刺激時間、EF強度、またはデューティサイクルに関するさらなる最適化により、DCパルスはNPC分化を操作するために適用され、神経系障害を治療するためにNPCを採用する治療戦略の開発に使用され得る。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、シンニカ医教アカデミー生物医学研究所の唐K.唐教授に対し、マウス神経幹細胞および前駆細胞(mNPC)の提供に協力してくれたことに感謝している。著者らはまた、mNCCの差別化に関する貴重な議論をした唐K.唐教授とインシャン・リー氏に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
