Artigo de método

Dissecção Regional Cerebelr para Análise Molecular

DOI:

10.3791/61922

⸱

5 de dezembro de 2020

 , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota

Neste artigo

Resumo

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Diferentes regiões cerebelares foram implicadas a desempenhar um papel em distintas saídas comportamentais, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Este trabalho descreve um método para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida o córtex cerebelar dos hemisférios, regiões anteriores e posteriores dos vermímis, e os núcleos cerebelares profundos, a fim de sondar as diferenças moleculares isolando o RNA e testando diferenças na expressão genética.

Resumo

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O cerebelo desempenha um papel importante em várias funções-chave, incluindo controle de movimento, equilíbrio, cognição, recompensa e afeto. Estudos de imagem indicam que regiões cerebelares distintas contribuem para essas diferentes funções. Estudos moleculares que examinam as diferenças cerebelares regionais estão defasando, pois são feitos principalmente em extratos cerebelares inteiros, mascarando assim quaisquer distinções em regiões cerebelares específicas. Aqui descrevemos uma técnica para dissecar de forma reproduzivelmente e rápida quatro regiões cerebelares diferentes: os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar vermal anterior e posterior, e o córtex cerebelar dos hemisférios. Dissecar essas regiões distintas permite a exploração de mecanismos moleculares que possam fundamentar suas contribuições únicas para o equilíbrio, o movimento, o afeto e a cognição. Esta técnica também pode ser usada para explorar diferenças na suscetibilidade patológica dessas regiões específicas em vários modelos de doenças de camundongos.

Introdução

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O cerebelo contém mais da metade dos neurônios do cérebro e tem sido historicamente referido como um centro de controle e equilíbrio motor no cérebro1. Mais recentemente, estudos demonstraram que o cerebelo desempenha um papel fundamental em várias outras funções, incluindo cognição, processamento de recompensas e afeto2,3,4,5.

O cerebelo tem anatomia bem descrita: a região do córtex é composta de granulo, Purkinje e camadas moleculares. As células de grânulo formam a camada celular do grân....

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Protocolo

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1. Configuração

  1. Reúna os equipamentos necessários, incluindo tesouras de decapitação, fórceps contundentes, tesoura de dissecção, tesoura vascular, microspatula, matriz cerebral do rato sagitário, lâminas de barbear, 200 pontas de tubulação de μL, placa de petri de vidro, lâmina de vidro e balde de gelo. Coloque todos os equipamentos em uma almofada absorvente.
  2. Coloque placa de petri, placa de vidro e matriz cerebral no gelo.
  3. Usando uma lâmina de barbear em um ângulo perpendicular, corte cerca de 5 mm da ponta de uma ponta de tubulação de 200 μL. Isso faz com que o tamanho da abertura no final da ponta de cerca de 1 mm de....

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Resultados

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Para esses experimentos, foram utilizados quatro camundongos fêmeas de onze semanas de idade, tipo C57/Black6. Um rato foi usado para realizar uma dissecção cerebelar completa que é referida como "cerebelo a granel" e permitiu a comparação dos níveis de RNA em regiões dissecadas a uma dissecção completa. Os outros três camundongos foram usados para conduzir a dissecção cerebelar descrita neste protocolo. O uso de três camundongos torna possível garantir que as tendências detectadas nos ní.......

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Discussão

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O método descrito aqui permite avaliar a expressão genética subjacente e os mecanismos moleculares dentro de quatro regiões cerebelares distintas – os núcleos cerebelares profundos (DCN), o córtex cerebelar anterior dos vermis (CCaV), o córtex cerebelar posterior dos vermis (CCPV) e o córtex cerebelar dos hemisférios (CCH). A capacidade de avaliar essas regiões separadamente ampliará nosso conhecimento da heterogeneidade de regiões cerebelares específicas e possivelmente lançará luz sobre sua contribuição para diversos c.......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Somos gratos a Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa no laboratório de Cvetanovic por sua ajuda na solução de problemas e na extração de RNA e RTqPCR. Esta pesquisa é financiada por M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS Instituto Nacional de Saúde (NIH).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1.5 Tubos de microcentrífugaThermoScietific3456
Álcool isopropílico 100%VWR Ciências da vida1106C361
200 ul Pontas de pipetaGeneMateP-1237-200
Matriz cerebral de camundongo adulto SagittalKent Scientific CorporationRBMA-200S
Pinça
ClorofórmioTesoura
de dissecação
Álcool etílicoPharmco111000200
Lâmina de vidro (para eletroforese)BIORAD
Kimble6HAZ6
Seringa de insulina (.5ml)BD329461
Kit iScript Adv cDNA para RT-qPCRBIORAD1725037
Micro Espátula
Agulha Pinça
Placa de Petri Pyrex
Primetime Primer para Aldolase CIDTMm.PT.58>43415246
Primetime Primer para Kcng4IDTMm.PT.56a.9448518
Primetime Primer para ParvalbuminaIDTMm.PT.58.7596729
Primetime Primer Rps18 IDTMm.PT.58.12109666
Lâminas Rzor de Borda ÚnicaPersonna GEM
Pilões estéreis e de uso únicoReagente12141364
TRIzolAmbion da Life Technologies15596018
Tesouras Vasculares
romba de decapitação Macron 220905 Tesoura Homogeneizador Balde de gelo de nariz

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  2. Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the....

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