Descrevemos um método para a preparação e imagem ao vivo de extratos citoplasmáticos não diluídos de ovos de Xenopus laevis .
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Artigo de método
Xenopus laevis Preparação de extrato de ovo e métodos de imagem vivos para visualização da organização citoplasmática dinâmica
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tradicionalmente usados para ensaios bioquímicos a granel, os extratos de ovos de Xenopus laevis surgiram como uma poderosa ferramenta baseada em imagens para estudar fenômenos citoplasmáticos, como citocinese, formação de fuso mitótico e montagem do núcleo. Com base nos primeiros métodos que visualizavam extratos fixos amostrados em pontos de tempo esparsos, abordagens recentes de extratos ao vivo de imagem usando microscopia de lapso de tempo, revelando características mais dinâmicas com resolução temporal aprimorada. Esses métodos geralmente requerem tratamentos de superfície sofisticados do vaso de imagem. Aqui apresentamos um método alternativo para imagens vivas de extratos de ovos que não requerem tratamento químico de superfície. É simples de implementar e utiliza consumíveis de laboratório produzidos em massa para imagens. Descrevemos um sistema que pode ser usado tanto para microscopia de campo amplo quanto para microscopia confocal. Ele é projetado para extratos de imagem em um campo 2-dimensional (2D), mas pode ser facilmente estendido para imagens em 3D. É bem adequado para estudar a formação de padrões espaciais dentro do citoplasma. Com dados representativos, demonstramos a organização dinâmica típica de microtúbulos, núcleos e mitocôndrias em extratos interfásicos preparados usando este método. Esses dados de imagem podem fornecer informações quantitativas sobre a dinâmica citoplasmática e a organização espacial.
Introdução
O citoplasma constitui o volume principal de uma célula e tem uma organização distinta. Os ingredientes do citoplasma eucariótico podem se auto-montar em uma ampla gama de estruturas espaciais, como as ásteres de microtúbulos e o aparelho de Golgi, que por sua vez são dinamicamente dispostos e transformados dependendo da identidade da célula e do estado fisiológico. Compreender a organização espacial do citoplasma e sua ligação com as funções celulares é, portanto, importante para entender como a célula funciona. Os extratos de ovos de Xenopus laevis têm sido tradicionalmente utilizados para ensaios bioquímicos a granel 1,2,3,4,5,6,7,8....
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Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Stanford.
1. Preparação de lâminas e folhas de cobertura
- Aplique uma camada de fita adesiva de etileno propileno fluorado (FEP) em uma lâmina de vidro com um aplicador de rolos. Corte a fita adesiva excessiva sobre as bordas com uma lâmina de barbear limpa. Prepare as coberturas revestidas com fita FEP da mesma forma (Figura 1A).
- Aplique um espaçador de imagem pegajoso de dupla face no lado revestido de fita FEP do slide. Deixe o forro protetor na parte superior d....
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Resultados
Extratos de ovos de Xenopus laevis podem ser usados para estudar a auto-organização do citoplasma durante a interfase. A Figura 2A mostra os resultados de um experimento bem-sucedido. Suplementamos extratos interfaseados com núcleos de espermatozoides desembranados de Xenopus laevis 19 na concentração de 27 núcleos/μL e 0,38 μM purificados GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteína de fusão c.......
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Discussão
Os extratos de ovos de Xenopus laevis emergiram como um poderoso sistema modelo para estudos baseados em imagens de várias estruturas subcelulares 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organização citoplasmática em um todo
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a J. Kamenz, Y. Chen e W. Y. C. Huang pelos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (R01 GM110564, P50 GM107615 e R35 GM131792) concedidas a James E. Ferrell, Jr.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de centrífuga de 17 ml | Beckman Coulter | 337986 | |
| 22x22 mm quadrado #1 vidro de cobertura | Corning | 284522 | |
| Aprotinin | MilliporeSigma | 10236624001 | Inibidor de protease |
| Cicloheximida | MilliporeSigma | 01810 | Inibidor da síntese de proteínas |
| Citocalasina B | MilliporeSigma | C6762 | Actina inibidor de polimerização |
| Fêmea Xenopus laevis rãs | Nasco | LM00535MX | |
| Fluorescente HiLyte 488 proteína tubulina marcada | Citoesqueleto, Inc. | TL488M-A | Para visualizar o citoesqueleto de microtúbulos |
| Fluorescent HiLyte 647 rotulado com proteína tubulina | Citoesqueleto, Inc. | TL670M-A | Para visualizar o citoesqueleto de microtúbulos |
| Fita opticamente transparente de etileno propileno fluorado (FEP) | CS Hyde company | 23-FEP-2-5 | |
| Pipeta de vidro Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Gonadotrofina coriônica humana (hCG) | MilliporeSigma | CG10 | |
| Espaçador de imagem | Microscopia eletrônica Ciências | 70327-8S | |
| Leupeptina | MilliporeSigma | 11017101001 | Inibidor de protease |
| Lâminas de microscópio | Fisher Scientific | 12-518-100B | |
| Óleo mineral | MilliporeSigma | 330760 | |
| MitoTracker Red CMXRos | Thermo Fisher Scientific | M7512 | Para visualizar mitocôndrias |
| Gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG) | Aplicador | de rolo RP1782725000 | |
| Amazon | B07HMBJSP8 | Para aplicar a fita FEP nas lâminas de vidro e lamínulas | |
| Lâminas de barbear de um gume | Fisher Scientific | 12-640 | Para remover fita FEP excessiva |
| Pipeta de transferência | Fisher Scientific | 13-711-7M |
Referências
- Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
- Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54
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Reimpressões e permissões
