Apresentado aqui é um protocolo para fornecer oligonucleotídeos como RNA de pequena interferência (siRNA), imitações de micro-RNA (miRs) ou anti-micro-RNA (anti-miR) em adipócitos maduros para modular proteína e expressão micro-RNA.
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Artigo de método
Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito
Neste artigo
Resumo
Resumo
A alteração da função adipócito contribui para a patogênese de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo 2 e resistência à insulina. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. A modulação da expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos continua sendo altamente desafiadora. Este artigo descreve um protocolo para diferenciar os fibroblastos murinos em adipócitos maduros e modular a expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos maduros através de transfecção reversa usando RNA de pequena interferência (siRNA) e micro-RNA imitando (miR imitar) oligonucleotídeos. Este protocolo de transfecção reversa envolve a incubação do reagente transfeccionado e dos oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular à qual os adipócitos maduros são adicionados. Os adipócitos são então autorizados a recolocar à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Análises funcionais como o estudo da sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise podem ser realizadas nos adipócitos maduros 3T3-L1 transfetípidos para estudar o impacto da manipulação de proteínas ou micro-RNA na função adipócito.
Introdução
A obesidade é considerada um dos principais fatores de risco para inúmeras doenças metabólicas, incluindo resistência à insulina (IR), Diabetes Tipo 2 (T2D) e doenças cardiovasculares1. As terapias atuais não conseguiram parar o constante aumento da prevalência dessas doenças, e o manejo do IR de pacientes obesos e diabéticos continua sendo uma questão clínica importante. O tecido adiposo desempenha um papel crucial no controle da homeostase energética, e sua expansão patológica durante a obesidade contribui para o desenvolvimento de IR e T2D2,3. Isso destaca a necessidade de entender m....
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Protocolo
NOTA: Use técnicas estéreis para executar todas as etapas do protocolo em uma capa de cultura de célula de fluxo laminar. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os reagentes e equipamentos.
1. Diferenciação de fibroblastos murine 3T3-L1 em adipócitos
- Cresça os fibroblastos 3T3-L1 em pratos de 100 mm em cultura média-DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, soro de bezerro 10% recém-nascido e 1% penicilina e estreptomicina(Figura 1A). Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecidos (7% CO2 e 37 °C).
- Dois dias após a confluência, mude o m....
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Resultados
Utilizando-se o procedimento de transfecção reversa descrito aqui para modular a expressão de proteínas ou micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, os adipócitos têm mostrado preservar sua morfologia após a transfecção (Figura 1B,C). De fato, 2 dias após a transfecção, os adipócitos foram bem espalhados e ligados à placa e apresentaram gotículas lipídicas multiloculares que são uma característica de adipócitos 3T3-L1 maduros. O teor lipíduo não foi d.......
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Discussão
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a diferenciação e transfecção de adipócitos maduros. Este método de transfecção reversa é um método simples, econômico e altamente eficiente para transfetar oligonucleotídeos como, mas não se limitando a, siRNAs, imitações de micro-RNA e anti-micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, que é uma das linhas celulares mais difíceis de transfeito. Este método tem algumas limitações que precisam ser consideradas. Este protocolo não é eficiente para transfecção com DNA plasmídeo, o que l.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho contou com o apoio do INSERM, da Université Côte d'Azur e da Agência Nacional de Pesquisa francesa (ANR) por meio do programa Investimentos para o futuro Laboratório de Excelência (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Iniciativa de Excelência (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. é apoiado por subsídios da Société Francophone du Diabète (SFD), da Associação Francesaise d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), do Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e da Fondation Benjamin-Delessert. J.G. é suportado pelo ANR-18-CE14-0035-01. A J-F.T. é apoiada pela anr grant ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e uma subvenção da Fondation....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de cultura de tecidos de 12 poços | Dutscher | 353043 | |
| 2,5% de tripsina (10x) | Gibco | 15090-046 | diluída a 5x com D-PBS |
| 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| 3-Isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Piscina sem direcionamento | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Albumina de Soro Bovino (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Colágeno tipo I da pele de bezerro | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Meio de Eagles Modificado (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4,5 g/L D-Glicose; L-Glutamina; sem piruvato |
| etanol | Sigma | 51976 | |
| negativo marcado com FAM si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Soro bovino fetal | Gibco | 10270-106 | |
| Reagente de glicerol livre | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Solução padrão de glicerol | Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 anticorpo | Santa Cruz | sc-131119 | Diluição: 0,5 µ g/mL |
| Meio Essencial Mínimo Melhorado (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulina, Recombinante Humano | Gibco | 12585-014 | |
| micro-RNA miRIDIAN imita | Horizon Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT | Kit Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Ensaios Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Ensaios Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Soro de bezerro recém-nascido | Gibco | 16010-159 | |
| Óleo Vermelho O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Descoberta | L-056623-01-0005 | |
| Penicilina e Estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Anticorpo Perilipina-1 | Sinalização celular | 3470 | Diluição: 1/1000 |
| Placa de Petri 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| anticorpo PKB | Sinalização celular | 9272 | Diluição: 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 anticorpo | Célula Sinalização | 9275 | Diluição: 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Reagente de transfecção (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| &alfa;-tubulina | anticorpo Sigma aldrich | T6199 | Diluição: 0,5 µ g/mL |
| anticorpo Vamp2 | R& D Sistemas | MAB5136 | Diluição: 0,1 µ g/mL |
Referências
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E.
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Reimpressões e permissões
