Amostragem e processamento de escovação nasal usando videomicroscopia ciliar digital de alta velocidade – adaptação para a pandemia de COVID-19

Summary

Para garantir uma análise funcional ciliar bem-sucedida e de alta qualidade para o diagnóstico da DCP, um método preciso e cuidadoso para amostragem e processamento do epitélio respiratório é essencial. Para continuar prestando serviço de diagnóstico de PCD durante a pandemia de COVID-19, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi atualizado para incluir medidas adequadas de controle de infecção.

Abstract

A discinesia ciliar primária (DCP) é uma ciliopatia móvel genética, levando a doença otosinopulmonar significativa. O diagnóstico de DCP é frequentemente perdido ou atrasado devido a desafios com diferentes modalidades diagnósticas. A videomicroscopia ciliar, utilizando a Videomicroscopia Digital de Alta Velocidade (DHSV), uma das ferramentas diagnósticas para a DCP, é considerada o método ideal para a realização da análise funcional ciliar (AFC), compreendendo a análise da frequência dos batimentos ciliares (FSC) e do padrão dos batimentos (CBP). No entanto, o DHSV carece de procedimento operacional padronizado e publicado para processamento e análise de amostras. Ele também usa epitélio respiratório vivo, um problema significativo de controle de infecção durante a pandemia COVID-19. Para continuar prestando um serviço de diagnóstico durante esta crise sanitária, o protocolo de videomicroscopia ciliar foi adaptado para incluir medidas adequadas de controle de infecção.

Aqui, descrevemos um protocolo revisado para amostragem e processamento laboratorial de amostras respiratórias ciliadas, destacando as adaptações feitas para cumprir as medidas de controle de infecção por COVID-19. Resultados representativos da AFC de amostras de escovação nasal obtidas de 16 indivíduos saudáveis, processados e analisados de acordo com este protocolo, são descritos. Também ilustramos a importância da obtenção e processamento de tiras epiteliais ciliadas de ótima qualidade, uma vez que amostras que não atendem aos critérios de seleção de qualidade permitem agora a AFC, potencialmente diminuindo a confiabilidade diagnóstica e a eficiência dessa técnica.

Introduction

A discinesia ciliar primária (DCP) é uma ciliopatia móvel heterogênea hereditária, na qual os cílios respiratórios são estacionários, lentos ou discinéticos, levando ao comprometimento do clearance mucociliar e doença oto-sino-pulmonar crônica1,2,3,4. As manifestações clínicas da DCP são tosse úmida crônica e congestão nasal crônica com início na primeira infância, infecções recorrentes ou crônicas do trato respiratório superior e inferior levando a bronquiectasias, otite média e sinusite recorrentes ou^{crônicas5,6,7}

Protocol

A aprovação foi obtida do comitê de ética do hospital-faculdade de Liège e do Departamento de Higiene e Proteção à Saúde no Trabalho da Universidade.

1. Amostragem do epitélio respiratório ciliado

1. Certifique-se de que os indivíduos estejam livres de infecção por pelo menos 4-6 semanas, e livres de medicação nasal e inalatória, antes da amostragem.
2. Preparar preparação M199 suplementada: Suplemento Meio de Cultura Celular 199 (M199) (500 mL) com solução antibiótica (5 mL de estreptomicina/penicilina (50 μg/mL)) e solução antifúngica (5 mL de anfotericina B (2,5μg/mL)).
3. Preparar 2 (um para cada narina) tubos cônic....

Results

Para ilustrar a eficiência da técnica, apresentamos os resultados da AFC em uma série de 16 voluntários adultos saudáveis (5 homens, faixa etária de 22-54 anos).

Amostras de escovação nasal de 14 (4 homens, faixa etária de 24-54 anos) do total de 16 voluntários forneceram bordas epiteliais adequadas suficientes que satisfizeram os critérios de seleção necessários para a realização da AFC. Destas 14 amostras de escovação nasal, um total de 242 bordas ciliadas foram registradas, e 212 bordas pre.......

Discussion

Este artigo visa fornecer um procedimento operacional padrão para CFA usando amostras de escovação nasal, com ajustes feitos para considerações apropriadas de controle de infecção durante a pandemia COVID-19. O diagnóstico da DCP é desafiador e, atualmente, requer um painel de diferentes testes diagnósticos, de acordo com a recomendação internacional, incluindo dosagem nasal de óxido nítrico, CFA por DHSV, análise ultraestrutural ciliar por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), marcação de proteínas ciliares por i.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos cônicos de 15 mL	FisherScientific	352096	Tubo cônico de polipropileno de alta clareza de 15 ml com tampa
Anfotericina B	LONZA	17-836E	Solução antifúngica
pinça nasal Blakesley-weil	NOVO SURGICAL	E7739-12	Usado para segurar a escova para realizar a escovação nasal
Escova de citologia brônquica	CONMED	129	Usado para nasal escovação
Cotonete	NUOVA APTACA	2150/SG	Usado para testes COVID-19
Câmera digital de videomicroscopia de alta velocidade	IDTeu Inovação em movimento	CrashCam Mini 1510
Lâmina de vidro		ThermoScientific 12372098	Lâminas de microscópio usadas para criar a câmara de visualização
Caixa aquecida	Células IBIDI em foco	10918	Usado para aquecer o amostra
Microscópio de luz invertida	Zeiss	AXIO Vert.A1
Aquecedor de lente	TOKAI HIT	TPiE-LH	Usado para aquecer a lente de imersão em óleo
Medium 199 (M199), HEPES	TermoFisher Scientific	12340030	Cell Culture Medium
Motion Studio X64	IDT Motion	versão 2.14.01	Software
Oil	FischerScientific, Carl Zeiss
Lamínula retangular	VWR	631-0145	Utilizada para cobrir a câmara de visualização
Espaçador (Ispacer) 0,25 mm	Sunjinlab	IS203	Utilizada para a criação da câmara de visualização hermética fechada
Lamínula quadrada	VWR	631-0122	Utilizada para a criação de câmara de visualização aberta construída em laboratório
Estreptomicina/Penicilina	Solução de antibióticos FisherScientific, Gibco	11548876