Um método preciso e reprodutível para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos in vivo nas plantas é descrito aqui. Este método emprega um HPLC-MS/MS.
Artigo de método
* These authors contributed equally
Um método preciso e reprodutível para quantificação de nucleosídeos/nucleotídeos in vivo nas plantas é descrito aqui. Este método emprega um HPLC-MS/MS.
Nucleosídeos/nucleotídeos são blocos de construção de ácidos nucleicos, partes de cosubstrates e coenzimas, moléculas de sinalização celular e portadores de energia, que estão envolvidos em muitas atividades celulares. Aqui, descrevemos um método rápido e confiável para a qualificação absoluta do conteúdo nucleosídeo/nucleotídeo nas plantas. Resumidamente, 100 mg de material vegetal homogeneizado foram extraídos com 1 mL de tampão de extração (metanol, acetonitrilo e água a uma razão de 2:2:1). Mais tarde, a amostra foi concentrada cinco vezes em um secador congelado e, em seguida, injetada em um HPLC-MS/MS. Nucleotídeos foram separados em uma coluna de carbono grafitado poroso (PGC) e nucleosídeos foram separados em uma coluna C18. As transições em massa de cada nucleosídeo e nucleotídeo foram monitoradas pela espectrometria de massa. O conteúdo dos nucleosídeos e nucleotídeos foram quantificados em relação aos seus padrões externos (ESTDs). Usando este método, portanto, os pesquisadores podem facilmente quantificar nucleosídeos/nucleotídeos em diferentes plantas.
Nucleosídeos/Nucleotídeos são componentes metabólicos centrais em todos os organismos vivos, que são os precursores de ácidos nucleicos e muitos coenzymes, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD), e importante na síntese de macromoléculas como fosfolipídios, glicólipídios e polissacarídeos. Estruturalmente, o nucleosídeo contém uma nucleobase, que pode ser uma adenina, guanina, uracil, citosina ou timina, e um moiety de açúcar, que pode ser uma ribose ou uma desoxiribose1,2. Os nucleotídeos têm até três grupos fosfatos ligados à posição de 5 carbonos da moiety açucarada dos nucleosídeos....
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1 Crescimento de plantas e coleta de materiais
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Aqui, mostramos a identificação e quantificação da N1-metiladenosina, um nucleosídeo modificado conhecido, em mudas silvestres arabidopsis de 2 semanas de idade (Col-0) como exemplo. O perfil de espectrometria de massa indica que os íons do produto gerados a partir do padrão N1-metiladenosina são de 150 m/z e 133 m/z (Figura 2A),e o mesmo perfil também é observado na extração Col-0(Figura 2B). Devid.......
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Os organismos contêm vários nucleosídeos/nucleotídeos, incluindo os canônicos e aberrantes. No entanto, a origem e os pontos finais metabólicos deles, especialmente os nucleosídeos modificados, ainda são obscuros. Além disso, o entendimento atual da função e da homeostase do metabolismo nucleosídeos/nucleotídeos continua a ser explorado e expandido. Para investigá-los, é necessário utilizar um método preciso e padrão-ouro para esses metabólitos de identificação e quantificação. Aqui, descrevemos um protocolo usando o esp.......
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Os autores não têm conflito de interesses para divulgar.
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelos Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (KJQN202060), a Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31900907), a Fundação de Ciência Natural da Província de Jiangsu (BK20190528), o Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia (CRP/CHN20-04_EC) para M.C., e os Fundos De Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais (LGZD202004) para X.L.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| acetonitrilo | Sigma-Aldrich | 1000291000 | |
| adenosina | Sigma-Aldrich | A9251-1G | |
| acetato de amônio | Sigma-Aldrich | 73594-100G-F | |
| AMP | Sigma-Aldrich | 01930-5G | |
| CMP | Sigma-Aldrich | C1006-500MG | |
| citidina | Sigma-Aldrich | C122106-1G | |
| GMP | Sigma-Aldrich | G8377-500MG | |
| guanosina | Sigma-Aldrich | G6752-1G | |
| coluna Hypercarb | Thermo Fisher Scientific GmbH | 35005-054630 | |
| IMP | Sigma-Aldrich | 57510-5G | |
| inosina | Sigma-Aldrich | I4125-1G | |
| metanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| N1-metiladenosina | Carbosynth | NM03697 | |
| O6-metilguanosina | Carbosynth | NM02922 | |
| Murashige e Skoog Medium | Duchefa Biochemie | M0255.005 | |
| coluna Polaris 5 C18A | Agilent Technologies | A2000050X046 | |
| pseudouridina | Carbosynth | NP11297 | |
| UMP | Sigma-Aldrich | U6375-1G | |
| uridina | Sigma-Aldrich | U3750-1G |
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