Métodos de imagem e classificação de células de animais vivos para investigar a neurodegeneração em um modelo de necrose excitotóxica de C. elegans

Resumo

Em um modelo de excitotoxicidade de C. elegans , este protocolo emprega imagens in vivo para analisar a regulação da neurodegeneração necrótica, o efeito de genes que codificam mediadores candidatos e o envolvimento de mitocôndrias. A dissociação e classificação celular são usadas para obter especificamente neurônios em risco para análise transcriptômica específica da célula de mecanismos de neurodegeneração e neuroproteção.

Resumo

A necrose excitotóxica é uma das principais formas de neurodegeneração. Esse processo de necrose regulada é desencadeado pelo acúmulo sináptico do neurotransmissor glutamato e pela estimulação excessiva de seus receptores pós-sinápticos. No entanto, faltam informações sobre os eventos moleculares subsequentes que culminam na morfologia distinta do inchaço neuronal desse tipo de neurodegeneração. Outros aspectos, como mudanças em compartimentos subcelulares específicos ou a base para a vulnerabilidade celular diferencial de subtipos neuronais distintos, permanecem pouco explorados. Além disso, uma série de fatores que entram em jogo em estudos que usam preparações in vitro ou ex vivo podem modificar e distorcer a progressão natural dessa forma de neurodegeneração. Portanto, é importante estudar a necrose excitotóxica em animais vivos, monitorando os efeitos de intervenções que regulam a extensão da necrose neuronal no sistema modelo geneticamente passível e transparente do nematóide Caenorhabditis elegans. Este protocolo descreve métodos de estudo da necrose excitotóxica em neurônios de C. elegans , combinando análise óptica, genética e molecular. Para induzir condições excitotóxicas em C. elegans, um nocaute de um gene transportador de glutamato (glt-3) é combinado com um fundo genético sensibilizante neuronal (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) para produzir hiperestimulação e neurodegeneração do receptor de glutamato. O contraste de interferência diferencial de Nomarski (DIC), a microscopia fluorescente e confocal em animais vivos são métodos usados para quantificar a neurodegeneração, acompanhar a localização subcelular de proteínas marcadas com fluorescência e quantificar a morfologia mitocondrial nos neurônios degenerados. A Classificação de Células Ativadas por Fluorescência Neuronal (FACS) é usada para classificar distintamente os neurônios em risco para análise transcriptômica específica do tipo de célula da neurodegeneração. Uma combinação de imagens ao vivo e métodos FACS, bem como os benefícios do organismo modelo C. elegans , permitem que os pesquisadores aproveitem esse sistema para obter dados reprodutíveis com um grande tamanho de amostra. Os insights desses ensaios podem se traduzir em novos alvos para intervenção terapêutica em doenças neurodegenerativas.

Introdução

A excitotoxicidade é a principal causa de morte neuronal na isquemia cerebral e um fator contribuinte em múltiplas doenças neurodegenerativas 1,2,3,4,5,6,7,8,9. A interrupção do fluxo sanguíneo oxigenado para o cérebro (por exemplo, devido a um coágulo sanguíneo) resulta no mau funcionamento dos transportadores de glutamato, levando ao acúmulo de glutamato na sinapse. Esse excesso de glutamato superativa os receptores de glutamato pós-sinápticos (GluRs), levando a um influxo excessivo (catalítico, não estequiométrico) de Ca²⁺ nos neurônios (Figura 1A). Esse influxo prejudicial leva à neurodegeneração pós-sináptica progressiva que varia morfologicamente e mecanicamente da apoptose à necrose regulada 10,11,12. Embora tenham sido baseados em intervenções bem-sucedidas em modelos animais, vários ensaios clínicos de antagonistas de GluR que buscaram bloquear a entrada de Ca²⁺ e promover a viabilidade celular falharam no cenário clínico 13,14,15,16. Um provável contribuinte crítico para essas falhas é o fato de que (em contraste com os modelos animais) o tratamento no ambiente clínico é administrado horas após o início do AVC, fazendo com que a intervenção bloqueie os mecanismos neuroprotetores de ação tardia, ao mesmo tempo em que falha em interromper a sinalização degenerativa a jusante dos GluRs 14,16,17. Uma abordagem alternativa, baseada na trombólise, só pode ser administrada dentro de uma janela de tempo severamente restrita, deixando muitos pacientes (que sofrem AVC em casa com tempo de início pouco identificável) incapazes de se beneficiar dela¹⁷. Esses contratempos enfatizam a necessidade de focar a pesquisa de excitotoxicidade no estudo de eventos que ocorrem após a hiperestimulação de GluR e diferenciar cascatas degenerativas subsequentes de processos neuroprotetores simultâneos. Essa abordagem pode ajudar a prevenir danos celulares e identificar alvos eficientes de medicamentos que podem ser administrados posteriormente após o início do dano.

Uma abordagem para identificar eventos subsequentes na excitotoxicidade é estudar os mecanismos de sinalização de morte celular a jusante da hiperestimulação de GluR, como aqueles que levam ao colapso mitocondrial. O mau funcionamento drástico da fisiologia e dinâmica mitocondrial é uma marca registrada da neurodegeneração, como visto na excitotoxicidade 18,19,20. Embora todas as células dependam da função e disponibilidade mitocondrial para sobrevivência, atividade e manutenção celular, os neurônios são particularmente dependentes da produção de energia mitocondrial para apoiar a transmissão e propagação do sinal. Especificamente, os neurônios gastam ~ 50% de seu consumo de energia relacionado à sinalização para restaurar o potencial de membrana em repouso após a ativação de receptores / canais pós-sinápticos²¹, com alta dependência de oxigênio e glicose. A disponibilidade reduzida de glicose e oxigênio observada no AVC leva a sérias alterações mitocondriais, causando redução adicional na produção de ATP 19,22,23,24. No entanto, estudos para identificar a sequência de eventos que levam ao colapso mitocondrial produziram resultados controversos e careceram de consenso. A análise da morfologia mitocondrial pode ajudar a entender esses eventos que levam à patologia mitocondrial, pois é um bom indicador da saúde neuronal 25,26,27,28,29. As mitocôndrias filamentosas são representativas de um neurônio saudável, enquanto as mitocôndrias fragmentadas revelam danos neuronais substanciais que podem levar à morte celular. A análise da morfologia mitocondrial em animais vivos sob diferentes condições genéticas pode ajudar a focar em genes e vias específicas envolvidas na neurodegeneração dependente de mitocôndrias na excitotoxicidade.

Outra abordagem para identificar eventos subsequentes que podem regular a extensão da neurodegeneração excitotóxica é estudar os mecanismos neuroprotetores transcricionais que mitigam alguns dos efeitos da excitotoxicidade ^14,16. No entanto, a falta de especificidade dos principais fatores de transcrição neuroprotetores e a divergência das configurações experimentais impedem o sucesso dos esforços para identificar claramente os principais programas neuroprotetores (especialmente na necrose regulada).

Portanto, tanto o estudo das vias de sinalização de morte a jusante quanto o estudo da neuroproteção transcricional na excitotoxicidade encontraram grandes dificuldades e discordâncias nos resultados observados. É provável que grande parte dessa controvérsia surja do uso de modelos ex vivo ou in vitro de excitotoxicidade e da variabilidade introduzida pela especificidade de diferentes configurações experimentais. Portanto, é altamente benéfico focar na identificação dos principais mecanismos altamente conservados e estudá-los in vivo. O sistema modelo simples do nematóide C. elegans oferece uma opção particularmente eficaz, devido à potente combinação de ferramentas de pesquisa particularmente poderosas e diversificadas, à conservação das principais vias de morte celular e às ricas informações sobre a estrutura e conectividade de seu sistema nervoso 30,31,32,33. De fato, o trabalho seminal do laboratório Driscoll sobre a análise genética da neurodegeneração necrótica em neurônios mecanossensoriais é uma excelente demonstração do poder dessa abordagem³⁴. Importante para a análise da excitotoxicidade, a conservação das vias de sinalização no nematóide inclui todos os principais componentes da neurotransmissão glutamatérgica^35,36.

O modelo de excitotoxicidade de nematóides baseia-se nesses estudos seminais, permitindo que o pesquisador estude processos bioquímicos semelhantes aos que ocorrem no acidente vascular cerebral e outras doenças neurodegenerativas afetadas pela neurotoxicidade dependente de glutamato. Para induzir condições excitotóxicas em C. elegans, esta abordagem experimental usa uma cepa de excitotoxicidade que é a combinação de um nocaute de um gene transportador de glutamato (glt-3) e fundo genético de sensibilização neuronal (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) para produzir hiperestimulação e neurodegeneração de GluR³⁷. Esta cepa de excitotoxicidade expõe 30 neurônios específicos (que expressam glr-1) que são pós-sinápticos a conexões glutamatérgicas à neurodegeneração excitotóxica. Desses 30 neurônios em risco, os neurônios individuais passam por necrose à medida que o animal progride no desenvolvimento (com estocasticidade mista e preferência parcial por certos neurônios específicos³⁸), enquanto, ao mesmo tempo, os cadáveres celulares também estão sendo gradualmente removidos. Em combinação com a acessibilidade de muitas cepas mutantes, essa abordagem permite o estudo de múltiplas vias que afetam a neurodegeneração e a neuroproteção. Essas abordagens já foram usadas para analisar algumas das cascatas de sinalização de morte a jusante³⁹ e reguladores transcricionais da neurodegeneração excitotóxica na excitotoxicidade ^38,40. Como outros casos de neurodegeneração necrótica no verme⁴¹, a neurodegeneração excitotóxica do nematóide não envolve apoptose clássica⁴⁰.

Este artigo de métodos descreve o sistema básico para induzir, quantificar e manipular a neurodegeneração necrótica excitotóxica em C. elegans. Além disso, descreve dois protocolos principais que estão atualmente em uso para agilizar os estudos de aspectos específicos da excitotoxicidade dos nematóides. Usando repórteres fluorescentes e imagens ao vivo in vivo, o pesquisador pode estudar o envolvimento e a dinâmica mitocondrial no modelo de nematóide de neurodegeneração excitotóxica. Para determinar o efeito de fatores de transcrição neuroprotetores específicos, o investigador pode usar a expressão específica do tipo celular de marcadores fluorescentes, dissociação de animais em células únicas e FACS para isolar neurônios específicos que estão em risco de necrose por excitotoxicidade. Esses neurônios isolados específicos do tipo de célula podem então ser usados para sequenciamento de RNA em cepas que abrigam mutações nos principais fatores de transcrição. Juntos, esses métodos podem permitir que os pesquisadores descubram os fundamentos moleculares da neurodegeneração excitotóxica e da neuroproteção in vivo com grande clareza e precisão.

Protocolo

1. Cepas usadas para investigar a neurodegeneração excitotóxica e a neuroproteção

1. Use a cepa de excitotoxicidade do nematóide ZB1102 como ponto de referência para a neurodegeneração excitotóxica padrão.
   NOTA: A excitotoxicidade dependente de glutamato em C. elegans é produzida na cepa ZB1102 pela combinação de um nocaute (ko) de um transportador de glutamato com um transgene que sensibiliza os neurônios nesses animais à neurotoxicidade e é expresso em um subconjunto de neurônios pós-sinápticos para conexões glutamatérgicas³⁷. Essa combinação genética é chamada de cepa de excitotoxicidade do nematóide e está disponível gratuitamente no Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
2. Para estudar o efeito de genes que codificam candidatos a reguladores de necrose excitotóxica, combine uma mutação em tais genes (por exemplo, dapk-1 ou crh-1) com a cepa de excitotoxicidade do nematóide.
3. Conduza cruzamentos genéticos de acordo com os métodos padrão de C. elegans ³⁰, conforme descrito no wormbook.org^42,43.
4. Como a base molecular da mutação é normalmente documentada, siga a progênie cruzada genotipando o locus específico usando PCR. Diferencie WT vs mutante por tamanho de fragmento (para deleções) ou sequenciamento (para mutações pontuais).
   NOTA: A Tabela 1 descreve as cepas que foram usadas para estudar vias distintas de neurodegeneração e neuroproteção, especificamente para este protocolo.
5. Derive todas as cepas críticas por duas linhas independentes e teste-as separadamente para confirmar a validade do fenótipo observado.

2. Meios de Crescimento e Pecuária

1. Cultive minhocas a 16-25 ° C em placas NGM padrão 30,37,42 ou placas MYOB ^38,44 semeadas com OP50 E.coli de acordo com os métodos padrão.
   NOTA: As placas MYOB fornecem resultados idênticos aos das placas NGM, mas são um pouco mais fáceis de preparar.
2. Manter as cepas experimentais consistentemente bem alimentadas.
   NOTA: A fome pode afetar a neurodegeneração e reduzir o número de neurônios da cabeça morrendo. Se os vermes forem mal alimentados ou morrerem de fome, coloque-os em pratos novos e espere algumas gerações antes de continuar os experimentos. O efeito transgeracional da fome diminuirá após algumas gerações.

3. Quantificação de neurônios cefálicos degenerados por contraste de interferência diferencial de Nomarski (DIC) e pontuação

1. Use a cepa de excitotoxicidade do nematóide (ZB1102: glt-3 (bz34) IV; nuIs5 V) como controle experimental para quantificação, representando os níveis normais de excitotoxicidade. O protocolo não segue o mesmo animal em diferentes estágios de desenvolvimento. Em vez disso, fornece um instantâneo de uma população de animais em estágio misto, de modo que, no total, coleta-se informações de diferentes animais para representar todos os estágios de desenvolvimento.
   NOTA: O transgene nuls5 [Pglr-1 :: GαS (Q227L). Pglr-1::GFP]⁴⁵ (que expressa um Gαs e GFP ativados em neurônios pós-sinápticos para conexões glutamatérgicas) produz um nível de neurodegeneração necrótica independente de GluR de ~ 1 neurônio / animal moribundo (a qualquer momento durante o desenvolvimento). A adição de glt-3 (ko) aumenta a neurodegeneração necrótica dos neurônios pós-sinápticos que expressam nuIs5 de maneira dependente de GluR, subindo para 4-5 neurônios cabeça/animal moribundos no terceiro estágio larval (L3)³⁷.
2. Para as estirpes de ensaio, utilizar animais provenientes de um cruzamento genético recentemente concluído ou descongelar estirpes de interesse provenientes de existências congeladas a -80 °C preparadas a partir de cruzamentos frescos. Espere algumas gerações (≥4) antes de pontuar um fenótipo e neurodegeneração.
3. Corte e remova um pequeno pedaço de ágar de um prato de uma população de animais bem alimentados em estágio misto e monte-o em uma lamínula virando o pedaço de ágar, de modo que os animais que estavam rastejando na superfície do ágar agora fiquem de frente para a lamínula.
   NOTA: Os animais ainda podem se mover, mas agora estão um pouco contidos e podem ser observados sem anestesia. Esse pedaço pode ser usado por ~ 1 hora antes de substituí-lo por um novo.
4. Usando uma luneta DIC invertida com ocular x10 e objetiva x40 ou x63, escaneie os animais aleatoriamente deslizando a lamínula manualmente. Embora outras etapas de imagem descritas abaixo possam ser conduzidas em microscópios invertidos ou verticais, o exame de vermes no pedaço de ágar requer um escopo invertido.
5. Identifique o estágio de desenvolvimento de cada animal pela forma de seu útero (consulte os diagramas do útero em wormbook.org).
6. Para cada animal, registre seu estágio de desenvolvimento e o número de neurônios moribundos (ou seja, vacuolizados). Conte e registre o número total de neurônios moribundos na cabeça, o número de neurônios moribundos no gânglio retrovesicular (o que facilita a identificação de células específicas) e o número de neurônios moribundos na cauda (que não é afetado pelo glutamato e serve como um controle interno, confirmando que o transgene sensibilizante nuIs5 está totalmente ativo).
7. Registre esses dados em uma tabela onde os animais de uma determinada cepa são agrupados por categorias de estágio de desenvolvimento.
8. Em cada sessão, colete dados aleatoriamente de vermes de vários estágios de desenvolvimento; Realize várias sessões de pontuação ao longo de vários dias para coletar dados suficientes para análise estatística. Registre os níveis de neurodegeneração em vários estágios e construa um gráfico de barras semelhante à Figura 1C.
   NOTA: Este método permitirá determinar se um determinado tratamento ou mutação aumenta / diminui os níveis de neurodegeneração em todos os estágios (mudando a distribuição para cima / para baixo) ou muda o pico de neurodegeneração para um estágio de desenvolvimento anterior ou posterior (mudando a distribuição para a esquerda / direita).
9. Realize a coleta de dados sem saber a identidade do genótipo. Confirme em dois isolados independentes da linha genética (para minimizar o perigo de efeitos não intencionais de outras diferenças genéticas inesperadas entre os isolados) e reúna os dados para análise.
10. Em cada cepa, calcule a média e o SEM do número de neurônios degenerados na cabeça (incluindo o gânglio retrovesicular) em cada estágio de desenvolvimento (Figura 1D). Realize uma análise semelhante dos neurônios da cauda e do gânglio retrovesicular moribundos, conforme necessário.

4. Identificação de neurônios específicos degenerados da cabeça

1. Monte animais individuais (ou pequenos grupos de) em uma almofada de ágar⁴⁶ e paralise o verme com tetramisol (veja abaixo, seção 5).
2. Com uma fluorescência combinada e escopo DIC (vertical ou invertido), localize neurônios vacuolados específicos.
3. Determine a identidade específica do neurônio vacuolizado rastreando seus processos marcados com GFP e comparando a localização do corpo celular e a forma dos processos com os dos neurônios conhecidos por expressar glr-1 usando o WormAtlas⁴⁷.
   NOTA: Alternativamente, a identificação pode ser auxiliada por novos métodos para identificar rapidamente os neurônios por meio de rotulagem multicolorida que virão em breve do laboratório Hobert⁴⁸.

5. Imagem ao vivo da morfologia mitocondrial neuronal por microscopia fluorescente de cepas repórter

1. Para imagens de alterações mitocondriais em neurônios pós-sinápticos degenerados (que são marcados com GFP citoplasmática na cepa original de excitotoxicidade), examine a fluorescência mito-mCherry.
2. Cruze a cepa de excitotoxicidade de teste com cepas que marcam mitocôndrias de neurônios pós-sinápticos com fluorescência vermelha (expressando uma fusão entre a proteína fluorescente e o N-terminal de TOM-20 sob o promotor glr-1 ; para detalhes sobre construções e cepas, consulte⁴⁹). Os animais agora podem ser fotografados usando um microscópio de epifluorescência comum (vertical ou invertido) ou um microscópio confocal.
3. Para paralisar o verme sem afetar a sobrevivência neuronal, pipete 5 μL de tetramisol 10 mM em uma almofada de agarose recém-preparada. Ver Arnold et ^al.46 para protocolo detalhado sobre a preparação do absorvente.
4. Coloque os animais no centro da queda do tetramisol e monte com uma lamínula.
5. Sele as laterais da lamínula com esmalte e deixe o esmalte secar.
6. Dentro de 20 minutos após o tratamento com tetramisol e usando um escopo com DIC e imagens de fluorescência, localize vermes usando uma lente objetiva de 20x.
7. Uma vez que a cabeça do verme esteja localizada (ou neurônios de interesse), mova-se para uma objetiva de óleo de 100x e concentre-se na marcação de fluorescência das mitocôndrias no soma.
8. Capture imagens Z-stack usando as configurações de filtro DIC, GFP e TxRed.

6. Pontuação e quantificação da morfologia das mitocôndrias neuronais

1. Analise a morfologia mitocondrial durante a aquisição de imagens ao vivo do verme ou após a aquisição da imagem usando o ImageJ ou outro software de imagem.
2. Para facilitar a identificação e análise repetida de neurônios específicos, identifique os três neurônios no gânglio retrovesicular, RIGL / R e AVG (em alguns casos, apenas dois estão presentes devido à depuração do cadáver celular na excitotoxicidade).
3. Categorize as mitocôndrias em três grupos principais: filamentosas, intermediárias e fragmentadas 50,51,52.
   NOTA: As mitocôndrias filamentosas aparecem como estruturas finas contínuas no soma dos neurônios, geralmente ao redor do núcleo. As mitocôndrias intermediárias aparecem como uma combinação de pelo menos uma rede filamentosa aparente, embora com quebras, e alguma fragmentação no soma. As mitocôndrias fragmentadas exibem quebras completas na rede mitocondrial, têm aparência inchada e estão espalhadas por todo o soma (Figura 2A).
4. Para cada verme, pontue a porcentagem de neurônios com mitocôndrias filamentosas, intermediárias ou fragmentadas para um total de pelo menos 30 vermes.
5. Realize a análise estatística usando ANOVA de uma via seguida de teste post hoc de Tukey para cada morfologia mitocondrial entre as cepas⁵³.

7. Preparação de tampão e reagente para dissociação de vermes para FACS de neurônios em risco de neurodegeneração

1. Prepare o tampão M9 da seguinte forma: 3 g de KH₂PO₄, 6 g de Na₂HPO₄, 5 g de NaCl, H₂O a 1 L. Esterilizar em autoclave. Adicione 1 mL de MgSO 1 M esterilizado por filtro₄. Armazene em temperatura ambiente.
2. Prepare o tampão de ovo da seguinte forma: 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂ ; autoclave para esterilizar. Adicionar 2 M de solução reserva HEPES pH 7,3 (previamente filtrada com um filtro superior de frasco de 0,2 μm) a uma concentração final de 25 mM. Ajuste o pH para 7,3 com 1 N NaOH (não mais que 10 mL). Use o osmômetro para garantir que a osmolaridade final esteja entre 335 e 345 mOsm. Filtre o tampão de ovos com filtros superiores de frasco de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
   NOTA: Os sais se dissolvem mais facilmente ao usar MgCl₂ · 6H₂O e CaCl₂ · 2H₂O para fazer as respectivas soluções estoque de MgCl₂ e CaCl₂ . Você também pode fazer um estoque de 10x tampão de ovo e diluí-lo quando necessário em água deionizada estéril.
3. Prepare SDS-DTT da seguinte forma: 20 mM HEPES pH 8,0, 0,25% SDS, 200 mM DTT, 3% sacarose. Em uma capa de cultura de tecidos, esterilize SDS-DTT com filtro de seringa de 0,2 μm. Armazenar alíquotas de 300 μL a -20 °C cobertas com papel alumínio para proteger da luz.
4. Prepare a solução de pronase da seguinte forma: prepare no dia da dissociação 15 mg / mL de pronase em tampão de ovo. Armazene no gelo.

8. Sincronização de idade para FACS específico de neurônio

1. Use animais que combinem o genótipo de excitotoxicidade (e outras mutações, conforme desejado) com a expressão transgênica de um forte marcador fluorescente que pode ser prontamente usado para classificação (por exemplo, FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)⁵⁴. Crie animais em duas ou três placas NGM / MYOB de 100 mm a 20 ° C até que a placa esteja cheia de vermes predominantemente grávidas.
2. Lave as minhocas das placas usando tampão M9. Transferir os vermes para tubos cónicos de 50 ml utilizando uma pipeta serológica de vidro de 10 ml.
3. Centrifugue em temperatura ambiente por 2,5 min a 250x g e remova o sobrenadante.
4. Ressuspenda o pellet de minhoca em 10 mL de solução de alvejante (2% de NaOH 10 N e 5% de alvejante doméstico fresco em água desionizada estéril).
5. Coloque os tubos em uma coqueteleira horizontalmente, balance em baixa velocidade. Certifique-se de que os vermes não se depositem no fundo do tubo. O alvejante abre a cutícula do verme, mas não afeta os embriões, que são protegidos pela casca do ovo.
   1. Esta etapa de branqueamento leva aproximadamente 5 minutos, mas isso varia. Para garantir que o branqueamento excessivo não ocorra, monitore o processo recuperando uma amostra a cada minuto: pipete suavemente 10 μL de cada tubo em uma lâmina de microscópio de vidro e examine os vermes usando um microscópio de dissecação.
6. Uma vez que a maioria dos vermes grávidas esteja rachada, mas não completamente dissolvida, interrompa a etapa de branqueamento enchendo os tubos cônicos com tampão de ovo.
7. Para recuperar os ovos/embriões, centrifugue os tubos a 250x g por 2,5 min, remova o sobrenadante e lave novamente com tampão de ovo.
8. Repita mais quatro lavagens.
9. Ressuspenda os ovos pipetando suavemente o pellet e espalhe em quatro placas NGM / MYOB semeadas de 100 mm. Deixe os embriões eclodirem e crescerem a 20 °C por 3 dias.
   NOTA: As placas agora devem estar cheias de vermes predominantemente grávidos.
10. Repita a sincronização de idade repetindo este protocolo de sincronização de alvejante/idade.
11. Pipetar os ovos para oito placas NGM/MYOB de 100 mm. Deixe o animal eclodir e crescer a 20 ° C até o estágio larval desejado.

9. Dissociação de células de vermes inteiras para FACS

1. Cultive vermes sincronizados até o estágio de desenvolvimento desejado. Lave suavemente as placas de 100 mm com tampão M9 e pipetas sorológicas de vidro e transfira para tubos cônicos de 50 mL.
2. Adicione M9 frio até 45 mL. Coloque os tubos no gelo por 30 minutos para permitir que os vermes se depositem no fundo por gravidade, enquanto quaisquer detritos bacterianos residuais das placas flutuarão no sobrenadante.
3. Remover o sobrenadante e lavar os vermes com M9 fresco.
4. Repita a gravidade de 30 minutos no gelo.
5. Remova o sobrenadante, adicione M9 até 45mL e centrifugue a 250 x g por 5 minutos.
6. Transfira o pellet para um tubo de microcentrífuga e adicione M9 até 1 mL.
7. Gire a 14.000 rpm em uma centrífuga de mesa por 1 min e remova o sobrenadante.
8. Para romper a cutícula, ressuspenda o pellet de minhoca com SDS-DTT usando (aproximadamente) o dobro do volume do pellet e incube com balanço em temperatura ambiente por 4 minutos para os estágios L2-adulto.
   NOTA: Não exceda 4 minutos de incubação em SDS-DTT porque o sinal da proteína fluorescente diminuirá drasticamente com um tratamento mais longo com SDS-DTT. Como o SDS-DTT é sensível à luz, não deve ter mais de 3 meses, pois a solução pode ter perdido potência com o tempo; As dissociações funcionam melhor com a solução SDS-DTT recentemente preparada.
9. Adicione 1x tampão de ovo (pH 7,3, 335-345 mOsm) até 1 mL para interromper o tratamento SDS-DTT.
10. Gire a 14.000 rpm em uma centrífuga de mesa por 1 minuto e remova o sobrenadante.
11. Para romper ainda mais a cutícula e dissociar as células dos animais, ressuspenda o pellet com solução de pronase à temperatura ambiente, usando o triplo do volume do pellet.
12. Incube em temperatura ambiente por 15-30 min.
13. Pipete para cima e para baixo 40 vezes a cada 5 minutos com uma pipeta P-200 ou P-1000, tocando o fundo do tubo com a ponta da pipeta.
    NOTA: A pressão criada pela ponta tocando o fundo do tubo facilita a dissociação do verme. Use uma ponta de filtro para que os vermes não entrem acidentalmente no eixo da pipeta durante a pipetagem rápida.
14. Após 15 min, verifique o progresso da dissociação do verme pipetando suavemente 5μL em uma lâmina de vidro e observando o progresso sob um microscópio de dissecação. Quando a maioria (~ 90%) dos vermes intactos estourou, o processo está completo.
    NOTA: A incubação da Pronase pode ser estendida se muitos vermes permanecerem intactos.
15. Em uma coifa de cultura de células, adicione 1x tampão de ovo de até 1,5 mL para interromper o tratamento com pronase.
16. Transfira para tubos FACS, adicione 5mL de tampão de ovo e gire a 800 x g por 5 min.
17. Remova o sobrenadante e ressuspenda em 3 mL de tampão de ovo.
18. Coloque uma tampa de filtro de célula de 70 μm em novos tubos FACS, pipeta a suspensão de células no filtro e gire a 800 x g por 1 min. Colete a suspensão de células de efluxo.
19. Coloque uma tampa de filtro de célula de 5 μm em novos tubos FACS, suspensão de células de pipeta no filtro e gire a 800 x g por 1 min.
20. Adicione DAPI para uma concentração final de 0,5 μg/mL em tampão de ovo, coloque sobre gelo com uma tampa/tampa para proteger da luz.
21. Execute o FACS o mais rápido possível. O sinal da proteína fluorescente diminui com o tempo e a exposição à luz, portanto, é importante realizar o protocolo de dissociação o mais rápido possível e realizar o FACS imediatamente após a conclusão da dissociação.
    NOTA: O protocolo de dissociação de vermes foi adaptado dos protocolos do laboratório Miller 55,56,57, do laboratório Murphy⁵⁸ e do laboratório Shaham⁵⁹.

10. Modificações na operação da máquina FACS para identificação de neurônios de C. elegans

1. Use 4 litros de tampão de ovo resfriado (4 ° C) em vez do fluido de bainha padrão ao classificar os neurônios de C. elegans .
   NOTA: A osmolaridade das células de C. elegans é muito maior do que as células de mamíferos e o fluido da bainha padrão estourará os neurônios. Todas as configurações e calibrações da máquina são feitas após a adição do tampão de ovo, porque a viscosidade do tampão de ovo é diferente da do fluido de bainha padrão. O técnico de classificação executará os grânulos de diagnóstico na máquina para garantir que os lasers estejam funcionando corretamente.
2. Quando os neurônios classificados forem usados em estudos transcriptômicos subsequentes, classifique um mínimo de 100.000 células GFP+ diretamente em 800 μL de Trizol-LS + 10 μL de inibidor de RNase.
3. Inverta as células em Trizol 15 vezes para misturar.
4. Congelar em um banho de gelo seco/etanol e armazenar a -80 °C até que esteja pronto para extrair RNA de todas as amostras para um experimento de sequenciamento de RNA.
   NOTA: Embora a maioria das células classificadas seja coletada diretamente no Trizol para análise do transcriptoma, certifique-se de recuperar uma pequena amostra de células classificadas GFP+ (de cada cepa) coletadas no tampão de ovo, para validação microscópica da eficiência da classificação.

11. Estratégia de bloqueio FACS

1. Para identificar o sinal positivo GFP, use o laser de 488 nm com o filtro 530/30 e 502 long pass (LP).
2. Para identificar células DAPI positivas e negativas, use o laser de 405 nm com o filtro 450/50.
3. Para identificar células autofluorescentes que podem ser confundidas com células positivas para GFP, use o laser de 488 nm com o filtro 610/20 e 595 LP (comunicação pessoal, Stanka Semova, Gerente de Operações, Centro de Recursos de Citometria de Fluxo, Universidade Rockefeller).
4. Execute uma estratégia de gating padrão e remova eventos com uma grande área de dispersão lateral (SSC-A) e uma pequena área de dispersão direta (FSC-A), que provavelmente representam aglomerados de células e detritos.
5. Isole os singlets de dispersão do prefácio e, em seguida, os singletes de dispersão lateral.
6. Isole as células com alto sinal GFP e baixo sinal de autofluorescência.
   NOTA: Células com alto teor de autofluorescência e menor em GFP não são células GFP positivas verdadeiras.
7. O limiar para a porta GFP+ é determinado comparando as células GFP- (ou seja, N2) com as células GFP+^55,56.
8. Remova quaisquer células mortas com uma porta viva/morta, com base na permeabilidade seletiva do DAPI às células mortas: O limite para a porta morta viva é determinado comparando as células não coradas com as células coradas com DAPI.
   NOTA: Ao classificar várias amostras, lave o fluxo entre as amostras para garantir que não haja contaminação cruzada.

12. Microscopia de neurônios classificados para validar a eficiência da estratégia de gating FACS

1. Desenhe um círculo em uma lâmina de microscópio de vidro com uma caneta repelente de líquidos.
2. Pipetar 10 μL de suspensão de células classificadas em tampão de ovo dentro do círculo. Coloque uma lamínula sobre a amostra e sele com esmalte ao redor do perímetro da lamínula.
3. Depois que o esmalte secar, verifique no microscópio fluorescente vertical / invertido se as células classificadas são de fato principalmente células GFP +.
   NOTA: Execute esta verificação após cada sessão de classificação para validar a estratégia de controle FACS⁵⁷.

13. Extração de RNA e quantificação da qualidade do RNA em um sistema automatizado de eletroforese de controle de qualidade

NOTA: Todo o trabalho de RNA deve ser executado com extremo cuidado para evitar a contaminação com RNase (incluindo preparação cuidadosa de reagentes, consumíveis e melhores práticas seguras de RNase).

NOTA: Execute todas as etapas onde as amostras contêm fenol e/ou clorofórmio em uma capela de exaustão.

1. Descongele frascos de células em Trizol à temperatura ambiente.
2. Usando uma ponta de filtro P200, pipete para cima e para baixo várias vezes para homogeneizar a amostra.
3. Incube em temperatura ambiente por 5 minutos.
4. Adicione 0,2 mL de clorofórmio por 1 mL de reagente Trizol usado para lise e, em seguida, tampe o tubo com segurança.
5. Inverta os tubos 15 vezes e incube (a 20-25 °C) por 2-3 minutos.
6. Centrifugar a amostra durante 15 minutos a 12.000 × g a 4 °C. A mistura se separa em um fenol-clorofórmio vermelho inferior, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor.
7. Colete exclusivamente a fase aquosa superior contendo o RNA e transfira para um novo tubo de ligação de DNA / RNA baixo de 1,5 mL.
   NOTA: Em alguns casos, se a proporção de células no tampão de ovo que caíram do classificador de células para Trizol for maior que uma proporção de 1:3 amostra: Trizol-LS, o alto teor de sal do tampão de ovo pode fazer com que as camadas sejam invertidas; se isso ocorrer, adicione mais Trizol-LS e repita a inversão e centrifugação. Isso também pode ser evitado se você observar o aumento no volume da amostra após a classificação; se a proporção de 1:3 não for mantida, adicione trizol suficiente antes de iniciar a extração de RNA.
8. Para purificar ainda mais o RNA, use a química da coluna de extração de RNA.
9. Use o sistema de eletroforese automatizado de Controle de Qualidade para medir o Número de Integridade do RNA (RIN) e confirmar o RNA RIN de 8,0 ou superior para entrada em experimentos subsequentes de sequenciamento de RNA.

Resultados

Modelo de excitotoxicidade de nematóides e identificação de neurônios degenerados vacuolados
Os dados aqui apresentados são reproduzidos de publicações anteriores^37,38. Para imitar a neurodegeneração induzida por excitotoxicidade, um nocaute do gene transportador de glutamato (glt-3) é combinado com um fundo transgênico sensibilizador neuronal (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L); Pglr-1::GFP)]...

Discussão

Embora as controvérsias e falhas predominantes sugiram que a excitotoxicidade apresenta um processo excepcionalmente difícil de decifrar, a análise da excitotoxicidade no nematóide oferece uma estratégia particularmente atraente para iluminar as vias de morte celular neuronal conservadas nesta forma crítica de neurodegeneração. O investigador pode contar com a rica coleção de ferramentas de pesquisa disponíveis neste sistema e, particularmente, com a transparência do animal (permitindo a...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ágar	VWR	AAA10752-0E
Bactopeptona	VWR	90000-264
BD FACSAriaIII
Bleach	Qualquer CaCl
2	VWR	97062-586
CaCl2· 2H2O	BioExpress	0556-500G
Cell Strainer, PluriStrainer mini 70um	PluriSelect	43-10070-40
Cell Strainer, PluriStrainer mini 5um	PluriSelect	43-10005-60
Centrifuge - 15-50 mL Sorval benchtop  LEGENDX1R TC	Centrífuga Fisher Sci	75618382
- microcentrífuga; Ependorff 5424	VWR	MP022629891
Clorofórmio	VWR	97064-680
Colesterol	Sigma	C8667-25G
DAPI	Fisher Sci	EN62248
Gelo seco	United City Ice Cube
DTT	VWR	97061-340
E. coli OP50	CGC	OP50
Etanol (100%)	VWR	EM-EX0276-1S
Etanol (90%)	Tubos FACS VWR	BDH1160-4LP
	USA Sci	1450-2810
Pontas de filtro	USA Sci	1126-7810
Glass 10 mL pipetas sorológicas	USA Sci	1071-0810
	BioExpress	D-2250
Hepes	VWR	97061-824
Óleo de imersão - Carl Zeiss Immersol	Fisher Sci	12-624-66A
Isopropanol	VWR	EM-PX1830-4
KCl	VWR	BDH9258-2.5KG
KH2PO4	VWR	BDH9268-2.5KG
Tubos de 1,5mL de ligação baixa	EUA Sci	4043-1021
Software de Imagem Metamorph	Molecular Devices
MgCl2	VWR	97063-152
MgCl2· 6H2O	BioExpress	0288-500g
MgSO4	VWR	97061-438
Microscópio, Confocal, para Imagem de Fluorescência	Microscópio Zeiss	LSM 880
, Invertido, para Imagem de Fluorescência	Microscópio Zeiss	Axiovert 200 M
Câmera	Q-Imaging	Retiga R1
Microscópio Fonte de luz para imagem de fluorescência	Lumencor	SOLA SE Light Engine
Microscópio, Nomarski DIC	Zeiss	Axiovert Observer A1
Microscópio, Nomarski DIC	Nikon	Eclipse Ti-S
Na2HPO4	VWR	97061-588
NaCl	VWR	BDH9286-2.5KG
NaOH	VWR	97064-476
Fisher Sci	FB0875712		de 100 mm
TriTech	T3308		de 60 mm
	P2002
Pipetador P10 Dicas	USA Sci	1110-3000
Pipettor P1000 Dicas	USA Sci	1111-2020
Pipettor P200 Tips	USA Sci	1110-1000
Pronase	Sigma	P8811-1G
RNAse away spray	Fisher Sci	7000TS1
Pipetas sorológicas livres de RNAse	USA Sci	1071-0810
Tubos de 50 mL sem RNAse	USA Sci	5622-7261
RNeasy micro	Qiagen	74004
SDS	VWR	97064-496
Sulfato de estreptomicina	Sigma	S6501-100G
Sacarose	VWR	AAJ63662-AP
SUPERase· inibidor de RNase Fisher	Sci	AM2694
Sistema automatizado de eletroforese de controle de qualidade: Tapestation - Fita de tela de RNA de alta sensibilidade	Agilent	5067-5579
Tapestation - Tela de RNA de Alta SensibilidadeEscada de Fita	Agilent	5067-5581
Tapestation - Tampão de Amostra de Fita de RNA de Alta Sensibilidade	Agilent	5067-5580
Tapestation - Vórtice IKA MS3	Agilent/IKA	4674100
Tapestation - Adaptador de vórtice IKA a 2000 rpm	Agilent/IKA	3428000
Tapestation - Dicas de carregamento	Agilent	5067- 5152 ou 5067- 5153
Tapestation - Tampa Óptica 8x Tira	Agilent	401425
Tapestation - Tubo Óptico 8x Tira	Agilent	401428
Sistema automatizado de eletroforese de controle de qualidade: TapeStation 2200	Agilent	G2964AA
Tetramisole	Sigma	L9756-10G
Base	TrisFisher Sci	BP152-500
Cloridrato de Tris	Fisher Sci	BP153-500
Trizol-LS	Fisher Sci	10296-010
Wescor Vapro 5520 Osmômetro de Pressão de Vapor	Fisher Sci	NC0044806
Wheaton Unispense μ Dispensador P	VWR	25485-003