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Preservação da Fertilidade Através da Vitrificação de Oócitos: Perspectivas Clínicas e Laboratoriais

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DOI:

10.3791/61963

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16 de setembro de 2021

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1Clinica Valle Giulia, GeneraLife IVF

Neste artigo

Resumo

A criopreservação oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas. Estratégias clínicas e laboratoriais adequadas garantem a máxima eficácia, eficiência e segurança dos tratamentos de preservação da fertilidade.

Resumo

A preservação da fertilidade feminina é crucial em um sistema de saúde multifuncional que cuida da qualidade de vida futura das pacientes. A criopreservação de oócito é reconhecida por várias sociedades científicas internacionais como o padrão ouro para a preservação da fertilidade em mulheres pós-púbertas, tanto para indicações médicas quanto não médicas. As principais indicações médicas são doenças oncológicas, doenças ginecológicas como endometriose grave, doenças sistêmicas que comprometem a reserva ovariana e condições genéticas envolvendo menopausa prematura. Este artigo descreve todo o trabalho clínico e laboratorial de um tratamento de preservação da fertilidade, delineando recomendações para aconselhamento objetivo e baseado em evidências. Além disso, foca-se na eficácia do procedimento e descreve as estratégias mais adequadas para explorar plenamente a reserva ovariana e maximizar o número de oócitos recuperados no menor tempo possível. A avaliação da reserva ovariana, a definição de um protocolo ideal de estimulação, bem como os procedimentos de recuperação de oócitos, desnudação e vitrificação foram detalhados, juntamente com abordagens para maximizar sua eficácia, eficiência e segurança.

Introdução

O desenvolvimento e implementação de um programa eficiente de criopreservação para oócitos humanos tem sido um avanço significativo na medicina reprodutiva. De acordo com evidências recentes, a vitrificação é a estratégia mais eficaz para criopreservar os oócitos de metafase II (MII), pois resulta em taxas de sobrevivência estatisticamente mais elevadas em comparação com o congelamento lento, independentemente da população do paciente (pacientes inférteis ou programa de doação de oócitos)1,2,3. As realizações notáveis da vitrificação oócica levaram os Comitês de Prática da Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) e da Sociedade de Tecnologia Reprodutiva Assistida (SART) a pronunciar essa técnica como a mais eficaz para a preservação da fertilidade eletiva em mulheres pós-aubertas, tanto para indicações médicas quanto não médicas4,5,6. As indicações médicas para preservação da fertilidade incluem (i) câncer e doenças autoimunes que requerem terapias7, como radioterapia, quimioterapia citotóxica e terapia endócrina (cujo efeito prejudicial na reserva ovariana está associado à idade materna, bem como tipo e dose do tratamento); (ii) doenças ovarianas que requerem cirurgia repetida ou radical (como a endometriose)8; e (iii) condições genéticas (por exemplo, X-frágil) ou insuficiência ovariana prematura. Além disso, a preservação da fertilidade tornou-se uma opção valiosa para todas as mulheres que não realizaram seu objetivo parental por razões não médicas (também conhecidas como congelamento social).

Independentemente da indicação para a preservação da fertilidade e de acordo com as principais diretrizes internacionais sobre preservação da fertilidade, todos os pacientes dispostos a vitrifar seus oócitos devem receber aconselhamento adequado para serem informados sobre sua chance realista de sucesso, os custos, riscos e limitações do procedimento9,10,11,12,13. Mais importante, deve-se deixar claro que vitrificar uma coorte de oócitos MII não garante uma gravidez, mas que oferece uma maior chance de sucesso para o futuro tratamento de fertilização in vitro (FIV), se necessário14. Nesse sentido, a idade da mulher no momento da vitrificação do oócito é certamente o fator limitante mais importante15, pois a idade materna avançada (AMA; >35 anos) é a principal causa da infertilidade feminina16. Além de uma redução progressiva da reserva ovariana, a AMA está associada a um comprometimento da competência do oócito devido a vias fisiológicas defeituosas, como metabolismo, regulação epigenética, pontos de verificação do ciclo celular e segregação média17. Portanto, o número razoável de ovos para vitrify depende principalmente da idade materna. Em mulheres com menos de 36 anos, pelo menos 8-10 oócitos MII18 são necessários para maximizar a chance de sucesso. Em geral, quanto maior o número de oócitos vitrificados, maior é a probabilidade de sucesso. Portanto, a adaptação da estimulação ovariana de acordo com marcadores de reserva ovariana, como os níveis de hormônio anti-Mülleriano (AMH) ou a contagem de folículos antral (AFC) é crucial para explorar totalmente a reserva ovariana no menor tempo possível.

A segurança de todo o procedimento é a outra questão fundamental na inscrição de pacientes para preservação da fertilidade. Os médicos devem empregar as melhores estratégias para minimizar os riscos e prevenir (i)síndrome de hiperestimulação ovariana (OHSS) usando abordagens seguras, como o protocolo antagonista do hormônio liberador de gonadotrophin (GnRH), seguido por um agonista gnrh gatilho19 e (ii) o remoto, ainda possível, riscos de hemorragia peritoneal, lesão nas estruturas pélvicas (ureter, intestino, apêndice, nervos) ou infecção pélvica durante a recuperação do oócito. Por fim, (iii) os regimes tradicionais de estimulação estão associados ao estradiol soro suprafisiológico e, portanto, não são recomendados em doenças sensíveis ao estrogênio, como o câncer de mama. Protocolos envolvendo inibidores de aromatase (como letrozol ou tamoxifen) são mais adequados nesses casos20,21. No ambiente laboratorial, o protocolo mais difundido para vitrificação de oócitos ainda é o primeiro descrito por Kuwayama e seus colegas2,23, que consiste em um procedimento passo a passo envolvendo a adição gradual de crioprotetores (CPAs). Na primeira fase (equilíbrio/desidratação), os oócitos são expostos em uma solução CPA contendo 7,5% v/v de etileno glicol e 7,5% v/v de sulfóxido de dimetil (DMSO), enquanto na segunda fase, osócitos são movidos para uma solução de vitrificação com 15% v/v de etileno glicol e 15% v/v DMSO, mais 0,5 mol/L sacarose. Após uma breve incubação no meio da vitrificação, os oócitos podem ser colocados em criodes específicos, abertos e finalmente mergulhados em nitrogênio líquido a -196 °C para serem armazenados até o uso.

Aqui, todo o trabalho clínico e laboratorial de um tratamento de preservação da fertilidade foi descrito por (i) delinear recomendações para aconselhamento objetivo e baseado em evidências, (ii) com foco no custo-efetividade do procedimento, e (iii) descrever as estratégias mais adequadas para explorar plenamente a reserva ovariana e maximizar o número de oócitos recuperados no menor tempo possível. A avaliação da reserva ovariana, a definição de um protocolo ideal de estimulação, bem como os procedimentos de recuperação de oócitos, desnudação e vitrificação serão detalhados, juntamente com abordagens para maximizar sua eficácia, eficiência e segurança. Como existem outros protocolos ou adaptações desse protocolo na literatura, os resultados representativos e as seções de discussão deste manuscrito só se aplicam a este procedimento.

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Protocolo

1. Work-up e aconselhamento clínico

NOTA: No caso de pacientes que necessitam de preservação da fertilidade por razões oncológicas, certifique-se de que não há lista de espera para consulta de agendamento, e a consulta é fornecida o mais rápido possível.

  1. Examine o histórico médico e a documentação prévia e avalie o estado geral de saúde do paciente.
  2. Registo todas as informações (incluindo a aprovação do oncologista para se submeter à estimulação ovariana em caso de pacientes com câncer) em um banco de dados relacional.
  3. Fornecer ao paciente aconselhamento específico sobre a viabilidade do procedimento. Explique as etapas do procedimento (estimulação ovariana, recuperação de oócitos, vitrificação de oócitos), e informe-a sobre as chances realistas de sucesso (principalmente dependentes da idade materna e do número esperado de oócitos MII no momento da recuperação do oócito), bem como o custo e limitações do procedimento.
  4. Realizar ultrassom transvaginal para obter informações sobre a reserva ovariana (ou seja, AFC) e avaliar a acessibilidade dos ovários para coleta de óvulos.
  5. Solicite exames de sangue para avaliar o grupo sanguíneo e o fator Rhesus, triagem de coagulação (hemograma, protrombina, tromboplastina, fibrinogênio, proteína C, proteína S, anti-trombina III, homocisteína) e doenças infecciosas (Hepatite B, Hepatite C, HIV, Laboratório de Pesquisa de Doenças Venéreas/Treponema pallidum Hemagglutination Assay).
    NOTA: No caso de pacientes que acessam um programa de preservação da fertilidade por razões médicas não urgentes, uma avaliação mais abrangente pode incluir hormônio estimulante do folículo basal (FSH), hormônio luteinizador (LH), estradiol, AMH, exame de mama, teste papanicolaou, triagem genética de coagulação (fator V de Leiden e protrombina) e rastreamento de TOCHA (toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus).
  6. Solicite uma avaliação cardiológica (eletrocardiograma).
  7. Recomendo aconselhamento psicológico.

2. Protocolos controlados de estimulação ovariana para preservação da fertilidade

NOTA: Quando o tempo disponível antes de iniciar o tratamento do câncer é limitado, o protocolo de início aleatório (ou seja, iniciar a estimulação ovariana a qualquer momento durante o ciclo menstrual) é recomendado para a estimulação ovariana em pacientes oncológicos que são candidatos à preservação da fertilidade. Em um programa de preservação da fertilidade por razões médicas ou sociais não urgentes, a estimulação convencional a partir da fase folicular inicial é preferível, e a estimulação ovariana é iniciada com base no ciclo menstrual. As abordagens de estimulação ovariana controlada (COS) devem ser realizadas de acordo com as recentes diretrizes24da Sociedade Europeia de Reprodução e Embriologia Humana (ESHRE).

  1. Alfaiate cos de acordo com as características do paciente e marcadores de reserva ovariana, principalmente idade materna, ESF, AMH e AFC.
  2. Inicie o COS no dia 5 do ciclo menstrual usando FSH recombinante ou urinário com uma dose fixa de 150-300 UI/dia (protocolo antagonista).
    NOTA: Em uma população específica de pacientes com deficiência de LH ou resposta abaixo do oblícita, o LH adicional 75/150 UI/dia pode ser administrado de acordo com a resposta ovariana, os níveis de LH e o julgamento do ginecologista.
  3. Em pacientes com doenças sensíveis ao estrogênio, incluem gonadotropinas associadas a inibidores de aromatase (letrozole) desde o primeiro dia de estimulação até o dia 7 após a recuperação do oócito.
  4. Administre uma dose fixa de gonadotropinas por 4 dias.
  5. Monitore o crescimento folicular no dia 5 e depois a cada 2-3 dias; eventualmente, ajuste a dosagem de gonadotropina.
  6. Uma vez que pelo menos 3 folículos atinjam 17-18 mm de diâmetro, administre o gatilho para maturação final do oócito com um único bolus subcutâneo de agonista GnRH na dose de 0,5 mL.

3. Recuperação de oócito

  1. Preparando-se para a recuperação de oócitos
    1. Para materiais necessários, consulte a Tabela de Materiais, e mantenha pronto calçados e roupas de laboratório, máscara facial cirúrgica, capa de cabelo, luvas cirúrgicas, um marcador permanente não tóxico, pinças, gazes pequenas estéreis, estéril ou reutilizável, equipamento de cirurgia vaginal e desinfetante superficial. Garantir a disponibilidade de equipamentos de ressuscitação, medicamentos anestésicos para reversão, um kit preparado para o tratamento de choque anafilático e oxigênio na sala de cirurgia.
    2. Realizar o procedimento de recuperação de oócitos de acordo com as recomendações do Grupo de Trabalho ESHRE sobre Ultrassom em tecnologias de reprodução assistida (ART)25.
      1. Administre sedação ou anestesia geral, e antibióticos para profilaxia.
        NOTA: Neste protocolo, a sedação profunda foi alcançada através da administração do propofol (cuja dosagem é ajustada de acordo com o peso do paciente) e 50-100 μg de fentanil, 1000 mg de paracetamol e ventilação de máscara assistida com oxigênio.
      2. Realize a recuperação de oócitos usando uma unidade de aspiração composta por uma bomba de vácuo, um tubo de coleta conectado a uma agulha de 17 G single-lumen, e um tubo coletor de oócito. Durante a coleta, não exceda uma pressão de ~120 mmHg para evitar o risco de danos aos oócitos, como tirar as células cumulus ou fraturar a zona pellucida.
      3. Calibrar a temperatura da superfície de trabalho para garantir 37 °C na mídia cultural. Durante todo o procedimento, minimize a exposição ao oócito até mesmo a temperatura transitória que pode afetar sua competência de desenvolvimento.
      4. Ao final da recuperação do oócito, observe o paciente por 3-4 horas antes da alta.
  2. Operação teatro
    1. Antes de entrar na sala de cirurgia, identifique o paciente e confirme o tempo do gatilho de ovulação.
    2. Que o paciente deite sobre a mesa de cirurgia em uma posição ginecológica.
    3. Limpe a vagina/colo do útero antes da recuperação do oócito para minimizar a contaminação bacteriana.
    4. Realizar um ultrassom transvaginal preliminar para avaliar a posição dos ovários e as relações anatômicas com os diversos órgãos e vasos sanguíneos.
    5. Sob orientação de ultrassom, insira uma agulha de lúmen único através da parede vaginal e em um folículo ovariano, tomando cuidado para não ferir os órgãos ou vasos sanguíneos localizados entre a parede vaginal e o ovário.
    6. Comece a aspiração do folículo mais próximo e passando para os mais distais.
    7. Puna todos os folículos de diâmetro maior que 11-12 mm, realizando "movimentos de torção" da agulha para aspirar todo o fluido folicular, que é então liberado em um tubo estéril (fundo redondo de 14 mL) pré-aquecido no aquecedor de bloco da sala de operação.
    8. Imediatamente após a recuperação, veda e rotule o tubo com detalhes da identidade do paciente.
    9. Certifique-se de que o enfermeiro traga o tubo para o laboratório, onde é imediatamente examinado para a presença de complexos cumulus-oocyte (COCs).
    10. Instrua os embriologistas a informar o médico sobre o número total de COCs recuperados.
    11. Uma vez que o procedimento esteja completo para o primeiro ovário, lave a agulha com meio limpo e proceda com o segundo ovário usando o mesmo procedimento.
    12. Após a recuperação do oócito, avalie qualquer sangramento dos ovários ou vasos sanguíneos do paramétrio e fluido livre na bolsa de Douglas.
      NOTA: Para automatizar e melhorar a eficácia da rastreabilidade de gameto e embrião no nível clínico, foi implementado um sistema eletrônico de testemunha (EWS) no centro26. No entanto, este protocolo não menciona o EWS, para garantir a reprodutibilidade do protocolo em qualquer laboratório de FIV. Ainda assim, considere que todas as etapas do procedimento requerem um segundo operador (ou seja, uma testemunha) para garantir a rastreabilidade de gamete e embrião.

4. Laboratório de FIV

  1. Um dia antes do procedimento de recuperação de oócitos
    1. Preparar tubos de coleta de oócito (consulte a Tabela de Materiais).
      1. Dispense 1 mL de meio de FIV (consulte a Tabela de Materiais) em cada tubo de coleta de oócito (fundo redondo, 5 mL), e cubra com 0,2 mL de óleo mineral (consulte a Tabela de Materiais) para a cultura do embrião.
        NOTA: O número de tubos será definido de acordo com o número de folículos esperados para serem recuperados. Cada tubo pode conter até 4 COCs.
    2. Sele os tubos com a tampa (primeiro estalo). Rotule os tubos com detalhes do tipo de média e data de preparação. Incubar os tubos durante a noite a 37 °C em uma atmosfera controlada (6% CO2, 5% 02).
  2. No dia da recuperação do oócito
    1. Pré-aquecimento dos suprimentos plásticos a 37 °C (pratos de cultura estéril e pipetas Pasteur).
    2. Peça aos pacientes que confirmem sua identidade (nome completo e data de nascimento) e o tempo de ovulação. Anote na folha laboratorial que o procedimento de identificação (RG) foi realizado, e que o tempo do gatilho de ovulação foi confirmado.
    3. Tire os tubos de coleta de oócito da incubadora (logo antes do procedimento começar) e empurre a tampa para garantir o fechamento apertado. Rotule os tubos de coleta de oócitos com as informações do paciente. Coloque os tubos de coleta de oócito no aquecedor de bloco a 37 °C.
    4. Examine o fluido folicular nos pratos de cultura estéril pré-armados e identifique COCs. Uma vez identificados um ou mais COCs, enxágue-os duas vezes em duas gotas de média para remover o fluido folicular e a contaminação sanguínea.
    5. Transfira os COCs para os tubos de coleta de oócitos e anote o número de COCs no tubo. Solte as tampas dos tubos médios e incuba-as prontamente a 37 °C em uma atmosfera de 6% de CO2, 5% O2.
    6. Repita as etapas 7 a 9 de acordo com o número de oócitos recuperados. Atualize a folha de laboratório.
      NOTA: Certifique-se de que uma testemunha verifica se todos os blocos de aquecimento do tubo (incluindo os da sala de cirurgia) estão vazios e assina o fechamento do procedimento na folha de laboratório.
    7. Limpe a etapa de trabalho após a conclusão do procedimento.

5. Desnudação de oócito

  1. Pré-aquecimento 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES)-médio tamponado e hialuronidase (consulte a Tabela de Materiais) a 37 °C pelo menos 1 h antes de começar.
  2. Prepare uma placa de FIV de 4 poços (consulte a Tabela de Materiais) com 0,6 mL/poço de meio pré-equipado com hepes tampão (suplementada com 5% de albumina de soro humano [HSA]) coberta com 0,3 mL de óleo mineral para cultura de embriões, e quente a 37 °C por pelo menos 30 min.
  3. Rotule a placa de desnudação de oócito com detalhes da identidade do paciente.
  4. Imediatamente antes de iniciar o procedimento, adicione hialuronidase ao primeiro poço para obter uma concentração final de cerca de 20 UI/mL.
  5. Coloque um número limitado de COCs (até 6) no primeiro poço contendo a enzima para dispersar as células cumulus.
  6. Para melhorar a remoção enzimática das células cumulus e corona, realize a desmontagem de células cumulus ao pipetar os oócitos repetidamente através de uma pipeta Pasteur com um diâmetro interno de aproximadamente 250 μm por até 30 s. Após a dissociação celular inicial, transfira os oócitos para o segundo poço contendo apenas meio tamponado com HEPES, tomando o cuidado de transportar uma quantidade mínima da enzima.
  7. Realize uma desnudação adicional para remover as células corona usando pipetas desnuding com diâmetros internos decrescentes (170-145 μm). Utilize diâmetros inferiores (135μm) somente se estritamente necessário.
  8. Lave cuidadosamente os oócitos desnudos para lavar a enzima.
  9. Após a desnudação, examine os oócitos sob um microscópio invertido para avaliar sua integridade e estágio de maturação. Separar os oócitos MII dos imaturos (vesícula germinal e metafásico-I).
  10. Mova os oócitos MII para a área de vitrificação para realizar imediatamente a criopreservação. Atualize a folha de laboratório.

6. Vitrificação oócica

NOTA: Realize a vitrificação oócito preferencialmente dentro de 38 h de recuperação de oócito e imediatamente após a desnudação. O procedimento de vitrificação descrito aqui deve ser realizado à temperatura ambiente (RT) e usando uma pipeta stripper com diâmetro interno de 170 μm para não danificar oócitos durante a manipulação.

  1. Aproximadamente 30 minutos antes do procedimento, leve a solução de equilíbrio (ES) e a solução de vitrificação (VS) para RT (25-27 °C).
  2. Rotule corretamente os criodevices com o nome e identificação do paciente, identificação do tratamento, data de congelamento, número de oócitos e criobarcódigo.
  3. Encha um rack de resfriamento descartável até o topo com nitrogênio líquido fresco e inicie o processo de esterilização.
  4. Rotule a placa de vitrificação (consulte a Tabela de Materiais) com o nome e identificação do paciente. Peça a uma testemunha que verifique a identificação correta dos criodevices.
  5. Inverta cuidadosamente cada frasco duas vezes para misturar seu conteúdo antes de usar, e prepare a tampa de uma placa de Petri de 6 mm com uma gota de 30 μL de meio tamponado hepes (com 5% HSA) e uma gota adjacente de 30 μL de ES.
    NOTA: Coloque as gotas pouco antes de usar para limitar a evaporação média.
  6. Utilizando uma pipeta stripper de 170 μm de diâmetro, coloque os oócitos (até 9) na primeira gota com o menor volume possível de meio. Utilizando a pipeta de stripper, crie uma ponte de meio entre a gota n.1 e n.2 para obter um aumento gradual na concentração dos CPAs (Figura 1A).
  7. Incubar os oócitos na primeira queda por 3 minutos. Adicione uma terceira gota de 30 μL de ES (n.3). Após 3 min, transfira os oócitos para a segunda gota do ES, e crie uma ponte média entre as gotas n.3 e n.2(Figura 1B). Incubar os oócitos em queda n.3 por 3 min.
  8. Durante a incubação, adicione uma gota de 30 μL de ES para cada criodevice que será usado (se 9 oócitos forem criopreservados, coloque 3 gotas de ES com 3 oócitos em cada gota de ES). Mova os oócitos para uma solução ES pura, e deixe-os por 6-9 min (até recuperarem seu tamanho inicial após o encolhimento)(Figura 1C).
  9. Prepare um prato de poço central (60 x 15 mm) com 1 mL de VS. No final dos primeiros 6 minutos, transfira os oócitos para serem criopreservados na solução VS, liberando o mínimo possível. Deixe os oócitos em VS por 1 min, e lave-os cuidadosamente movendo-os da parte inferior para a parte superior do prato para remover o excesso de ES.
  10. Aproximadamente 10 s antes do fim do minuto de incubação, coloque o criodevice sob o microscópio, e ajuste o foco na marca preta (ou seja, a ponta do criodevice). Coloque os oócitos no criodevice ao lado da marca preta com a quantidade mínima de VS (Figura 2A).
  11. Mova a pipeta de stripper para longe dos oócitos e remova o excesso de meio VS(Figura 2B) para que os oócitos permaneçam cobertos por uma fina camada de meio(Figura 2C).
  12. Mergulhe rapidamente o criodevice em nitrogênio líquido, sacudindo-o rapidamente para remover bolhas de ar de sua superfície. Segure a tampa protetora do criodevice com pinças e encha-a com nitrogênio líquido; em seguida, insira o criodevice nele enquanto mantém as tiras de propileno em nitrogênio líquido.
  13. Armazene o criodevice em um visiotube previamente rotulado com as informações do paciente. Atualize a folha de laboratório.

7. Aquecimento do oócito

  1. Aproximadamente 30 minutos antes do procedimento, aqueça a solução de descongelamento (TS), a solução de diluição (DS) e a solução de lavagem (WS) para RT (25-27 °C). Inverta cuidadosamente cada frasco duas vezes para misturar seu conteúdo. Coloque 1 mL de TS em uma placa de Petri de poço central, e aqueça-a a 37 °C por pelo menos 1 h antes de iniciar o procedimento.
  2. Rotule todos os suprimentos plásticos com o nome e identificada do paciente e o tipo de solução. Peça a uma testemunha para confirmar as informações do paciente sobre o dispositivo criodevice.
  3. Para cada criodevice a ser aquecido, prepare uma placa de 6 poços com 200 μL de DS no primeiro poço e uma quantidade igual de WS no segundo e terceiro (chamado WS1 e WS2, respectivamente). Adicione salina tamponada de fosfato (PBS) ou água estéril na área fora dos poços para evitar a evaporação.
  4. Retire o prato TS da incubadora e coloque-o sob o microscópio. Ajuste o foco do microscópio para o centro da placa de Petri.
  5. Torça cuidadosamente e remova a tampa protetora do criodevice, mantendo as tiras de propileno em nitrogênio líquido. Transfira o criodevice de nitrogênio líquido para o TS o mais rápido possível para evitar o risco de desvitarificação e iniciar a contagem regressiva (1 min).
  6. Localize os oócitos focando na ponta do criodevice (ou seja, a marca preta). Usando uma pipeta de stripper, solte os oócitos do criodevice.
    NOTA: Tente não aspirar os oócitos do criodevice; liberte suavemente alguns meios de comunicação sobre eles até que eles se movam para o TS.
  7. Usando uma pipeta stripper de 170 μm de diâmetro, transfira os oócitos para DS com uma pequena quantidade de TS (para criar um gradiente), e deixe-os no DS por 3 minutos. Mova os oócitos para ws1 da mesma forma, e deixe-os por 5 minutos. Finalmente, transfira os oócitos para ws2 por 1 min.
  8. Transfira os oócitos para um meio de cultura de FIV pré-aquilibrado apropriado e incuba-os por 1h antes de prosseguir com a injeção intracytoplasmática de espermatozoides (ICSI). Atualize a folha de laboratório.

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Resultados

Visão geral do programa de preservação da fertilidade no centro

Durante um período de 12 anos (2008-2020), 285 mulheres foram submetidas a pelo menos uma recuperação de oócitos, implicando a vitrificação de toda a coorte de ovos maduros coletados. A maioria dessas mulheres (n=250) foi submetida a uma única recuperação, e 35 foram submetidas a múltiplas recuperações. As razões para a recuperação de oócitos para vitrificação de óvulos são resumidas em 4 categorias: médica (excet...

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Discussão

Considerações clínicas

Embora estratégias emergentes, como a criopreservação do tecido ovariano e a maturação in vitro, tenham sido exploradas, a vitrificação oócida após a COS é a técnica padrão-ouro para a preservação da fertilidade. Nesse cenário, o número de oócitos recuperados e criopreservados deve ser maximizado no menor tempo possível, pois a maioria dos pacientes com câncer pode se beneficiar apenas de um ciclo ovariano antes de ter que iniciar seu tratamento contra ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Collection
Equipment
Hot plateIVF TECH
Marcadores de laboratórioSigma Aldrich
Laminar Flow HoodIVF TECHGrau A fluxo de ar
EstereomicroscópioLeicaLeica M80
Termômetro
Tubo de ensaio Aquecedor
Incubadora Tri-gasPanasonicMCO-5M-PE02 / CO2
Bomba de vácuoCookK-MAR-5200
Consumíveis
CSCM (Continuos single culture complete) médioFujifilm Irvine Scientific90165Meio de cultura de fertilização in vitro suplementado com óleo mineral HSA
para cultura de embriõesFujifilm Irvine Scientific9305
Agulha de Aspiração de Óvulo (Lúmen Único)CookK-OSN-1730-B-60
Prato PrimariaCorning353803Prato Primaria 100x20 mm estilo prato de cultura de células padrão
Tubos de fundo redondoFalconTubo deensaio de poliestireno de fundo redondo 352001 Falcon 14ml com tampa de pressão
Tubos de fundo redondoFalcon352003Tubos de coleta de oócitos/ Falcon 5ml 12x75 Tubo de ensaio de polipropileno de fundo redondo com tampa de pressão
Bulbo de borrachaSigma AldrichZ111589-12EA
Pipetas Pasteur de vidro estérilHunter ScientificPPB150-100PLPipeta Pasteur Cotonate, 150mm, MEA e CE
Denudation
Equipment
CO2 incubadoraEppendorfGalaxy 14S
Flexipet conjunto de alças ajustáveisCookG18674Stripper  suporte
Gilson PipetmanGilson66003p20
Incubadora k-SystemCoopersurgicalG210Invicell
Marcadoresde Laboratório Sigma Aldrich
Capuz de Fluxo LaminarFIV TECHGrau A
EstereomicroscópioLeica LeicaM80
Consumíveis
Biopur epTIPS RackEppendorf30075331Micropipetas epTIPS Biopur 2-200 µ l
Albumina de soro humanothermoFisher Scietific9988
HialuronidaseFujifilm Irvine Scientific9010180 UI / mL de enzima hialuronidase em placa de cultura de fertilização in vitro HTF tamponada com HEPES
(60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria placa de cultura de células padrão
Placa de fertilização in vitro Placa de 4 poços com tampa deslizanteThermoFisher Scietific176740Multiplates 4 poços (Nunc)
FIV Um prato de poçoFalcon353653Falcon 60 x 15 mm TC tratado com poço central FIV
Óleo mineral para cultura de embriõesFujifilm Irvine Scientific9305
Meio HTF modificadoFujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered médio
Bulbo de borrachaSigma AldrichZ111589-12EA1 mL para pipetas pasteur
Pipetas de vidro estéril Pipetas PasteurHunter ScientificPPB150-100PLPipeta Pasteur Cotonate, 150 mm, MEA e CE
pipeta de decapagem  pontas (140 µ m)CookK-FPIP-1140-10BS-6PIPETA FLEXIPETS PER DENUDING
pontas de pipeta de decapagem (130 µ m )CookK-FPIP-1130-10BS-7PIPETA FLEXIPETS PER DENUDING
pontas de pipeta de decapagem (170 µ m)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETA FLEXIPETS POR DENUDING
strong>Vitrification
Equipment
Electronic Timer
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper  holder
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Marcadores de LaboratórioSigma Aldrich
Capuz de Fluxo LaminarIVF TECHGrade A fluxo de ar
Recipiente de aço inoxidável para rack de resfriamentoKitazatoRecipiente de nitrogênio líquido para vitrificação
EstereomicroscópioLeicaLeica M80
Consumíveis
Biopur epTIPS Rack Eppendorf30075331Micropipetas epTIPS Biopur 2-200 µ L
Albumina de Soro HumanoFujifilm Irvine Scientific9988
Prato de cultura de fertilização in vitro (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60 x 15 mm TC Primaria prato de cultura de células
padrão de FIV 6 poçosOosafeOOPW-SW02OOSAFE  PRATO DE 6 POÇOS COM SUPORTE DE CANUDO
MediumModificado Fujifilm Irvine Scientific90126HEPES-Buffered pontas
de pipeta de decapagem médias (170 µ m)CookK-FPIP-1170-10BS-5PIPETA FLEXIPETS POR DESNUDAMENTO
Kit de congelamento de vitrificaçãoFujifilm Irvine Scientific90133-so2 frascos de ES (Solução de Equilíbrio, 2 x 1 mL) e 2 frascos de VS (Solução de Vitrificação, 2 x 1 mL)
VitrifitCoopersurgical Origio42782001AVitriFit  Caixa
Aquecimento
Equipamento
Conjunto de alças ajustáveisCookG18674Porta-decapantes 
Gilson PipetmanGilsonF123601p200
Incubadora k-SystemCoopersurgicalG210Invicell
Marcadores de LaboratórioSigma Aldrich
Capuz de Fluxo LaminarFIV TECHGrau A Fluxo de ar
Recipiente Inoxidável para Rack de ResfriamentoKitazatoRecipiente de nitrogênio líquido para vitrificação
EstereomicroscópioLeicaLeica M80
Consumíveis
Biopur epTIPS Rack Eppendorf30075331Micropipetas epTIPS Biopur 2-200 µ L
CSCM (Continuos single culture complete) meioFujifilm Irvine Scientific90165meio de cultura de fertilização in vitro suplementado com HSA
IVF placa de cultura (60 x 15 mm)Corning353802Corning Primaria Falcon Dish 60X15mm TC Primaria placa de cultura de células padrão Placa
de fertilização in vitro Placa de 4 poços com tampa deslizanteThermoFisher Scietific176740Multiplates 4 poços (Nunc)
Placa de fertilização in vitro 6 poçosOosafeOOPW-SW02OOSAFE®   PRATO DE 6 POÇOS COM SUPORTE DE CANUDO
Óleo Mineral para cultura de embriõesFujifilm Irvine Scientific9305
Pontas de pipeta de viagem (300µ m)CozinheK-FPIP-1300-10BS-5PIPETA FLEXIPETS POR DESNUDAMENTO
Kit de descongelamento de vitrificaçãoFujifilm Irvine Scientific90137-so4 frascos de TS (solução de descongelamento, 4 x 2 mL) + 1 frasco de DS (solução de diluição, 1 x 2 mL) + 1 frasco de WS (solução de lavagem, 1 x 2 mL)
de fluxo de ar <Temporizador Eletrônico

Referências

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