Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca2+ transitórios e corrente de cálcio tipo L

Philipp Tomsits; Dominik Schüttler; Stefan Kääb; Sebastian Clauss; Niels Voigt

doi:10.3791/61964

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Artigo de método

Isolamento de miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade para medidas simultâneas de Ca²⁺ transitórios e corrente de cálcio tipo L

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DOI:

10.3791/61964

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3 de novembro de 2020

Philipp Tomsits^*¹^,²^,³ , Dominik Schüttler^*¹^,²^,³ , Stefan Kääb¹^,² , Sebastian Clauss^*¹^,²^,³ , Niels Voigt^*⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Medicine I, University Hospital Munich, Campus Großhadern, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), ²Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), ³Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), ⁴Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Göttingen, ⁵Partner Site Göttingen, DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), ⁶Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Göttingen

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Modelos murinos permitem estudar os principais mecanismos da arritmogênese. Para isso, cardiomiócitos de alta qualidade são necessários para a realização de medidas de patch-clamp. Aqui, é descrito um método para isolar miócitos murinos atriais e ventriculares via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, que permite medidas simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L.

Resumo

Modelos de camundongos desempenham um papel crucial na pesquisa de arritmias e permitem estudar mecanismos-chave da arritmogênese, incluindo função alterada do canal iônico e manipulação de cálcio. Para isso, cardiomiócitos atriais ou ventriculares de alta qualidade são necessários para realizar medidas de patch-clamp ou explorar anormalidades no manuseio do cálcio. No entanto, o rendimento limitado de cardiomiócitos de alta qualidade obtido pelos protocolos de isolamento atuais não permite ambas as medidas no mesmo camundongo. Este artigo descreve um método para isolar miócitos murinos atrial e ventricular de alta qualidade via perfusão retrógrada de Langendorff baseada em enzimas, para subsequentes medições simultâneas de transientes de cálcio e corrente de cálcio tipo L de um animal. Corações de camundongos são obtidos, e a aorta é rapidamente canulada para remover o sangue. Os corações são então inicialmente perfundidos com uma solução isenta de cálcio (37 °C) para dissociar o tecido ao nível dos discos intercalados e, posteriormente, com uma solução enzimática contendo pouco cálcio para romper a matriz extracelular (37 °C). O coração digerido é posteriormente dissecado em átrios e ventrículos. As amostras de tecido são picadas em pequenos pedaços e dissolvidas por pipetagem cuidadosa para cima e para baixo. A digestão enzimática é interrompida e as células são gradualmente reintroduzidas nas concentrações fisiológicas de cálcio. Após o carregamento com um indicador fluorescente de Ca²⁺, os cardiomiócitos isolados são preparados para a medição simultânea de correntes de cálcio e transientes. Além disso, armadilhas de isolamento são discutidas e protocolos de patch-clamp e traços representativos de correntes de cálcio do tipo L com medidas simultâneas de transientes de cálcio em miócitos murinos atriais e ventriculares isolados como descrito acima são fornecidos.

Introdução

As arritmias cardíacas são comuns e um dos grandes desafios atuais para a saúde, uma vez que afetam milhões de pessoas em todo o mundo. As arritmias estão associadas a alta morbidade e mortalidade ^1,2 e representam a causa básica da maioria das mortes súbitas cardíacas³. As opções de tratamento atualizadas melhoraram a sobrevida do paciente, mas ainda são principalmente tratamentos sintomáticos em vez de visar os mecanismos subjacentes. Assim, esses tratamentos têm eficácia limitada e podem frequentemente causar efeitos colaterais graves ^4,5,6