No presente estudo, a expressão é derrubada de dois componentes sinalizadores a jusante da via PERK, a calcineurina citoprotetora e o CHOP pró-apoptótico, utilizando shRNAs específicos. De maneiras opostas, eles modulam a suscetibilidade dos neurônios corticais primários à atrofia da neurite após a indução do estresse do retículo endoplasmático.
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Artigo de método
Modulação molecular por shRNAs específicos entregues por lentivírus em neurônios estressados do retículo endoplasmático
Neste artigo
Resumo
Resumo
O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do retículo endoplasmático (RE), causado por qualquer condição de estresse, desencadeia a resposta proteica desdobrada (UPR) através da ativação de sensores especializados. UPR tenta primeiro restaurar a homeostase; mas se o dano persistir, a sinalização induz a apoptose.
Há evidências crescentes de que o estresse ER sustentado e não resolvido contribui para muitas condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas. Como a RPU controla o destino celular alternando entre processos citoprotetores e apoptóticos, é essencial entender os eventos que definem essa transição, bem como os elementos envolvidos em sua modulação.
Recentemente, demonstramos que o acúmulo anormal de gangliosídeos GM2 causa o esgotamento do conteúdo de ER Ca2+ , que por sua vez ativa a PERK (PKR-like-ER quinase), um dos sensores UPR. Além disso, a sinalização PERK participa da atrofia neurítica e da apoptose induzida pelo acúmulo de GM2. A este respeito, estabelecemos um sistema experimental que nos permite modular molecularmente a expressão de componentes PERK a jusante e, assim, alterar a vulnerabilidade dos neurônios para sofrer atrofia neurítica.
Realizamos knockdown da expressão de calcineurina (citoprotetora) e CHOP (pró-apoptótica) em culturas neuronais corticais de ratos. As células foram infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus e, em seguida, tratadas com GM2 em diferentes momentos, fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-MAP2 (proteína 2 associada a microtubos). Posteriormente, as imagens celulares foram registradas usando um microscópio de fluorescência e o crescimento total de neuritos foi avaliado usando o software de processamento de imagens de domínio público ImageJ. A inibição da expressão desses componentes de sinalização PERK claramente tornou possível acelerar ou retardar a atrofia neurítica induzida pelo estresse do RE.
Essa abordagem pode ser usada em modelos de sistema celular de estresse de RE para avaliar a vulnerabilidade dos neurônios à atrofia de neuritos.
Introdução
O estresse do retículo endoplasmático (RE) é definido como qualquer perturbação que comprometa a capacidade de dobramento de proteínas na organela. O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do lúmen do ER ativa um sinal de cascata de transdução chamado resposta proteica desdobrada (UPR). Esta via de sinalização complexa é orquestrada por três sensores de estresse: PERK (proteína quinase RNA [PKR]-like ER quinase), IRE1 (enzima 1 que requer inositol) e ATF6 (fator de transcrição ativado 6). Todos juntos tentam restaurar a homeostase. Mas se o estresse persistir, a RPU eventualmente induz a morte celular por apoptose1.
PERK, uma proteína transmembrana de RE, sob estresse de RE, lidera a fosforilação do fator de iniciação eucariótico-2 alfa (eIF2α), reduzindo a síntese proteica global e, portanto, a carga proteica no RE2. Demonstramos que a calcineurina A/B (CNA/B), um heterodímero Ca2+ fosfatase, liga-se diretamente ao domínio citosólico da PERK, aumentando sua autofosforilação e aumentando significativamente a inibição da tradução de proteínas e a viabilidade celular 3,4. Curiosamente, o CNA/B é abundante no cérebro de mamíferos, distinguindo duas isoformas da subunidade A do CN: α e β.
Sob estresse sustentado do RE, a via de sinalização PERK é o único ramo UPR que permanece ativado, mediando assim tanto a resposta pró-sobrevivência quanto a resposta apoptótica. Na fase crônica, um dos principais eventos a jusante é a indução do fator de transcrição, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homóloga protein)5. O estresse crônico do RE também é cada vez mais reconhecido como um contribuinte comum para uma extensa gama de distúrbios patológicos, incluindo doenças neurodegenerativas6. É importante compreender como a RPU pode facilitar a sinalização citoprotetora em vez da morte celular 7. No entanto, atualmente pouco se sabe sobre o mecanismo exato que controla a transição entre essas duas fases da RPU.
Recentemente, descobrimos que, em neurônios cultivados, o gangliosídeo GM2 se acumula nas membranas do RE e induz a depleção de cálcio luminal. Isso, por sua vez, ativa a sinalização PERK, que medeia a atrofia neurítica e a apoptose 8. Neste estudo, o acúmulo de GM2 em neurônios cultivados é usado como um modelo de sistema celular de atrofia de neurite induzida por estresse de ER. Especificamente, duas expressões do fator PERK são manipuladas, CN-Aα e CHOP, o que alterna a transição entre eventos precoces/protetores e uma fase crônica/apoptótica. Para conseguir isso, os respectivos genes são silenciados; assim, as culturas primárias de neurônios corticais são infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus. A análise de Western blot revela uma redução significativa dos níveis de expressão de CN-Aα e CHOP em comparação com as células de controle, que estão infectadas com lentivírus que carregam um shRNA embaralhado. Após esse tratamento, os neurônios são submetidos a diferentes tempos de incubação de GM2 exógeno, fixo e imunocorado com anticorpo anti-proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2)9. As imagens são obtidas com um microscópio de epifluorescência. O crescimento total de neuritos é avaliado em relação ao número total de células.
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Protocolo
Os procedimentos animais são realizados seguindo protocolos aprovados pelo Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação para a realização do estudo é concedida pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal (CICUAL) do INIMEC-CONICET-UNC (Resoluções nºs 014/2017 B e 006/2017 A).
1. Culturas primárias de neurônios corticais de ratos
- Anestesiar ratas E18 Wistar prenhes em uma câmara de CO 2 com uma mistura de 80% de CO2 /20% O2 por 60 s de exposição e, em seguida, sacrificar as vértebras cervicais.
- Execute as etapas a seguir em um exaustor de fluxo laminar. Extraia o encéfalo dos embriões com um estilo de pinça # 3 e tesoura de mola pequena afiada reta (Tabela de Materiais) para solução de Hanks em pratos de cultura de células.
- Dissecar o tecido sob lupa de 20x, usando duas pinças de ponta fina estilo # 5, separando o córtex frontal das meninges. Transfira o córtex frontal para um tubo cônico de 15 mL e incube o tecido com 3-4 mL de tripsina-EDTA (0,25%) por 15 min, a 37 °C para digestão química.
- Após a digestão, dilua-o com 3-4mL de meio águia modificado (DMEM) da Dulbecco mais 10% de soro fetal de bezerro (FCS). Em seguida, lave-o 3 vezes com Ca2+/Mg2+ solução livre de Sal Balanceado de Hanks e glicose a 0,1% por centrifugação (3000 g por 5 min).
- Dissociar mecanicamente o tecido 10 vezes pipetando para cima e para baixo usando uma ponta de 1000 μL, em DMEM mais 10% FCS (Tabela de Materiais). Em seguida, centrifugar o homogeneizado a 100 x g por 1 min, coletar o sobrenadante e completar o volume restante a 1000 μL.
- Chapear a suspensão celular em placas de cultura celular a uma densidade de 520 células/mm 2 com2 ml de DMEM contendo 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de um aditivo de aminoácidos essenciais (ver Tabela de Materiais). Em seguida, incubar a 37 °C em ambiente umidificado com 5% de CO 2 por2 h.
- Remoção de matéria orgânica e revestimento de poli-L-lisina de placas de cultura celular
- Remova a matéria orgânica colocando o material de vidro em uma câmara de reação e adicione 96% de álcool etílico para cobrir o material. Em seguida, adicione 68% (p/v) de ácido nítrico gota a gota até que bolhas acastanhadas-esverdeadas comecem a aparecer. Quando isso acontecer, cubra parcialmente o recipiente e permita que a reação continue até que a explosão cesse.
NOTA: Remova a matéria orgânica sob uma cabine de extração de gás para evitar a exposição a gases nocivos. - Antes do revestimento de poli-L-lisina, lave os copos com água Mili-Q estéril cerca de dez vezes. Em seguida, incube os copos e pratos de cultura com 0,1 μg/μL de poli-L-lisina por 4 h antes de usá-los. Após a incubação, lave os copos com água Mili-Q estéril cerca de dez vezes.
- Remova a matéria orgânica colocando o material de vidro em uma câmara de reação e adicione 96% de álcool etílico para cobrir o material. Em seguida, adicione 68% (p/v) de ácido nítrico gota a gota até que bolhas acastanhadas-esverdeadas comecem a aparecer. Quando isso acontecer, cubra parcialmente o recipiente e permita que a reação continue até que a explosão cesse.
- Remoção de matéria orgânica e revestimento de poli-L-lisina de placas de cultura celular
- Para permitir a diferenciação das células neurais, troque o meio por um meio neurobasal livre de soro, com o suplemento sem soro (Tabela de Materiais). Manter as culturas a 37 °C com 5% de CO2 até ao tratamento.
2. Produção de lentivírus
NOTA: Os oligonucleótidos que contêm as sequências que visam as 3'UTRs da isoforma CN-Aα ou CHOP e com as sequências não direcionadas (scrambles) estão listados na Tabela 1.
- Para o recozimento, misture dois oligonucleotídeos de fita simples com sequências complementares em quantidades molares iguais, usando tampão de recozimento (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
- Aquecer a 95 °C durante 2 min e, em seguida, arrefecer lentamente, transferindo amostras do bloco de calor ou do banho-maria para uma bancada à temperatura ambiente. Diluir o produto resultante [ARN de hairpin curto (shRNA) com extremidades coesivas] até uma concentração final de 0,5 μM, alíquota e conservar a -20 °C.
- Clone a inserção de shRNA no vetor lentiviral pLKO.3G, com GFP como marcador fluorescente verde. Para isso, digerir 1 μg de vetor com as enzimas de restrição EcoRI e PacI misturando o seguinte em um tubo estéril: 2 μL de tampão enzimático de restrição de 10x (100 mM bis-Tris propano-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/mL de albumina sérica bovina), 1 μL de 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL de 10 U/μL ECoRI, 0,5 μL de PacI (10 U/μL) e 16 μL de água ionizada estéril.
- Misture suavemente por pipetagem. Incubar a reacção durante 3-4 h a 37 °C.
NOTA: As digestão durante a noite são geralmente desnecessárias e podem resultar em degradação do DNA.
- Misture suavemente por pipetagem. Incubar a reacção durante 3-4 h a 37 °C.
- Para a ligadura, misturar o vector digerido e introduzir numa proporção molar de 3:1 e incubá-lo com a ligase T4 e o tampão ligase (fornecidos pelo fabricante) durante a noite a 16 °C.
NOTA: Neste ponto, a reacção de ligadura pode ser armazenada a 4 °C até nova utilização. - Transformar células competentes DH5α (Tabela de Materiais) ou outra cepa de E. coli adequada com a seguinte reação de ligadura.
- Misture a E. coli competente com o volume total da reacção de ligadura e arrefeça-a no gelo durante 15 min, coloque-a num banho de 42 °C durante 2 min e depois arrefeça-a novamente no gelo durante 15 min.
- Transferir o volume total submetido a choque térmico para um tubo de 15 ml e completar o volume para 1000 μL com meio líquido Luria-Bertani (LB) previamente mantido a 37 °C. Agitar as bactérias durante 90 minutos a 37 °C num agitador orbital a aproximadamente 330 rpm.
- Centrifugar-os a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar 900 μL de sobrenadante. Use o sobrenadante restante para ressuspender o pellet. Espalhe a suspensão de bactérias uniformemente sobre uma placa LB sólida de ampicilina (100 μg/mL).
- Incubar a 37 °C durante a noite e, em seguida, verificar o crescimento bacteriano. Neste ponto, as bactérias podem ser armazenadas a 4 °C por 4-5 dias.
- Escolha uma única colônia para transferir para um tubo de 50 mL com 10 mL de meio líquido LB e ampicilina (100 μg/mL). Agitar as bactérias ON a 37 °C a aproximadamente 330 rpm.
- Centrifugar a cultura para peletizar as bactérias a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e conservar o pellet bacteriano. Este pode ser armazenado a -20 °C.
- Purifice o plasmídeo com um kit de purificação de DNA de pellets de bactérias seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Calcular a concentração de ADN medindo a absorvância a 260 nm e multiplicando pelo factor de diluição, utilizando a seguinte relação: A260 de 1,0 = 50 μg/ml de ADN de fita dupla pura (ds).
3. Infecção por Lentivirus
NOTA: Execute o procedimento de geração de lentivírus em um exaustor de fluxo laminar Classe II.
- 24 h antes da transfecção, a semente 1-5 × 106 células HEK 293 em placas de cultura de 100 mm de diâmetro em 8 mL de meio de crescimento e incubá-las a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.
- Misture 14 μg de vetor pKLO.3G com inserção específica, 10,5 μg de plasmídeo de embalagem psPAX e 3,5 μg de plasmídeo de envelope pMD2.G (Tabela de Materiais). Diluir 45 μL de reagente de transfecção plasmídica (Tabela de Materiais) em 700 μL de meio sérico reduzido (Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, combine a mistura de DNA com o reagente de transfecção de plasmídeo diluído, misture suavemente e incube por 20 minutos à temperatura ambiente.
- Enquanto isso, mudar para DMEM fresco o meio do prato de cultura de culturas de células HEK 293 (70% confluente no momento da transfecção). Em seguida, adicione todo o volume da solução de DNA gota a gota. Agite o prato suavemente. Não é necessário adicionar/trocar o meio após a transfecção.
- Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h-72 h para permitir que os shRNAs atinjam a sua transdução óptima verificada por fluorescência de GFP utilizando um microscópio de fluorescência. Depois, recolher o meio com lentivírus e conservar a 4 °C.
- Sobrenadante viral filtrado com membrana de nylon de 0,45 μm. Aliquotar o fluxo-através em 1 mL. Em seguida, centrifugar a 17.000 x g por 4 h. Descarte o sobrenadante e conserve o pellet. Deixe o pellet invisível secar e, uma vez seco, armazene a - 80 °C.
- Realizar titulação viral por citometria de fluxo. Semear 4 x 105 células HEK 293 em placas de 24 poços e incubar a 37 °C por 24 h. Em seguida, ressuscite as partículas virais em 200 μL de meio de cultura DMEM (Tabela de Materiais) e adicione 0,05, 0,02 e 0,005 μL a cada poço.
- Incubar a infecção viral por 72 h, remover o meio e tripsinizar (tripsina a 0,05%, 1 mL) por 3 min. Adicionar 1 mL de DMEM em solução FCS a 10% e centrifugar a 500 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com PBS.
- Ressuscite o pellet com 100 μL de PBS e fixe as células com 100 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) em PBS. Analise as células com um citômetro de fluxo e determine a porcentagem de células fluorescentes GFP. Colete esses dados para calcular a titulação viral usando a seguinte fórmula:
Titulação Viral
4. Culturas primárias de neurônios estressadas com acúmulo de gangliosídeos GM2 e imunocitoquímica usando anticorpo anti-MAP2
- Infectar as culturas de neurônios corticais primários (15 dias in vitro) com oligonucleotídeos específicos de shRNA visando as UTRs de 3' de CN-Aα ou CHOP e incubá-las a 37 °C com 5% de CO2 por 1 dia.
NOTA: Culturas primárias de neurônios corticais de 7-8 dias in vitro também podem ser usadas se as células apresentarem alto crescimento de neurites.- Preparar uma solução-mãe de 500 μM de gangliosídeo GM2 em etanol e sonicá-la por 1 h.
- Adicionar a solução-mãe GM2 ao meio dos pratos de cultura a uma concentração final de 2 μM. Deixar incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 16, 24 e 48 h.
- Use algumas culturas para preparar o homogeneizado celular para análise de western blot (para especificação de anticorpos, consulte a Tabela de Materiais).
- Siga os passos 1.4. e 1.5. e, em seguida, fixar as células com PFA a 4% e sacarose a 120 mM em PBS por 20 min a 37 °C e, em seguida, lavá-las com PBS. Realize este procedimento em uma membrana antiderrapante em uma câmara úmida. Posteriormente, adicionar solução de permeabilização (Triton X-100 a 0,2% em PBS) por 5 min e lavar com PBS.
- Use BSA a 5% diluído em PBS por 45 min para permitir o bloqueio, em seguida, incubar com anticorpo anti-MAP2, diluído 1:800 em solução de bloqueio, a 4 °C durante a noite.
- Ao final do tempo de incubação, lavar duas vezes com PBS e incubar com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) por 1 h. Em seguida, lave as células com PBS e monte os óculos em lâminas usando um meio de montagem aquoso (Tabela de Materiais).
5. Análise da atrofia neurítica
- Obtenha imagens com uma lente de ar de 20x (NA 0,8) usando um microscópio invertido de epifluorescência equipado com uma câmera CCD. Analise imagens com plug-ins ImageJ. Para isso, carregue a imagem no ImageJ e subtraia o plano de fundo clicando em Processo | Subtraia o plano de fundo.
- Clique na imagem | Ajustar | Limite ou digite as seguintes teclas: Ctrl (ou Cmd) + Shift + T. Uma janela se abre para ajustar os valores mínimos, permitindo que os traçados de caminho e soma sejam distinguíveis. Clique na imagem binária (neurites e somas são de cor branca). Nesta imagem, use a seleção à mão livre para excluir somas; a área do soma selecionada fica preta novamente.
- Selecione rastreamentos e clique em Editar | Seleção | Criar seleção. Obtenha o ROI clicando nas teclas Ctrl (ou Cmd) e T da seleção e conserve-o. Abra a imagem original, clique no painel do gerenciador de ROI e selecione o ROI correspondente, obtido anteriormente. Em seguida, clique na imagem original.
- Depois que o ROI for rastreado na imagem, digite Ctrl (ou Cmd) e as teclas M (Analisar | Medida). Uma janela se abre; copiar o valor médio (unidades arbitrárias a.u.) para processar a análise estatística.
NOTA: Para obter valores como μm, clique em Analisar | Definir escala. Uma janela aparece aberta para definir valores. Certifique-se de adicionar a escala correta (Analisar | Set Scale) dependendo das características do microscópio utilizado.
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Resultados
Aqui, abordamos a questão de saber se o silenciamento de dois componentes PERK a jusante afeta a fase de transição da UPR em um modelo de célula de estresse ER. Para conseguir isso, silenciamos o gene CN-Aα, bem como o gene CHOP por duas sequências específicas de shRNA para cada um (Tabela 1) em cultura de células de neurônios primários por 1 dia10. A expressão é analisada por Western blotting (Figura 1 e Figura 2...
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Discussão
Descrevemos um sistema experimental que permite a modulação molecular da transição das fases de sobrevida para UPR apoptótica em um modelo celular neuronal.
Para uma análise adequada da atrofia neurítica, é essencial a obtenção de culturas primárias de neurônios com processos numerosos, longos e altamente ramificados 9,11. Isso facilita o exame da extensão do processo dos neurônios, permitindo que as diferenças claras entre os tratamen...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Gonzalo Quasollo por sua inestimável ajuda com imagens e à Dra. Andrea Pellegrini pelo suporte técnico de cultura celular.
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de: National Institute of Health, EUA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 entre UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 anti-Mouse | Thermo Fisher Scientific | #R37120 | |
| anti-CHOP | Thermo Fisher | # MA1 - 250 | |
| Anti-CN-Aα | Millipore | # 07-067 | |
| Anti-GM2 | Matreya | #1961 | |
| anti-MAP2 | Sigma Aldrich | # M2320 | |
| anti-β-actina | Thermo Fisher | # PA1 - 183 | |
| aprotinina | Santa Cruz Biotechnology | #3595 | |
| Axiovert 200 microscópio de epifluorescência | Zeiss | ||
| B27 suplemento | Life Technologies | #17504944 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | #11966025 | |
| EcoRI | Promega | #R6011 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Life Technologies | #16000044 | |
| Pinça de ponta fina estilo #5 | Pinça Dumont | ||
| estilo #3 | Dumont | ||
| HEK 293 | ATCC | #CRL-1573 | |
| IRDye 680 CW anticorpo secundário | LI-COR Biosciences | #92632221 | |
| IRDye 680 anticorpo secundário | LI-COR Biosciences | #92632220 | |
| IRDye 800 CW anticorpo secundário | LI-COR Biosciences | #92632210 | |
| IRDye 800 CW anticorpo secundário | LI-COR Biosciences | #92632211 | |
| plasmídeo de envelope lentiviral pMD2.G | Addgene | #12259 | |
| plasmídeo de empacotamento lentiviral psPAX2 | Addgene | #12260 | |
| vetor lentiviral pLKO.3G | Addgene | #14748 | |
| Hemissulfato de leupeptina | Santa Cruz Biotecnologia | #295358 | |
| Lipofectamina LTX & Plus Reagent (reagente de transfecção de plasmídeo) | Life Technologies | #A12621 | |
| MISSÃO shRNA Sigma | Aldrich | ||
| Monosialoganglioside GM2 | Matreya | #1502 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | #21103049 | |
| Membrana de nitrocelulose 0.45 & Micro; m | BIO-RAD | #1620115 Sistema de | |
| imagem infravermelha Odyssey | LI-COR Bioscience | ||
| OneShot Top 10 | Life Technology | #C404010 | |
| Opti-MEM (Mídia de soro reduzida) | Life Technologies | #105802 | |
| PacI | BioLabs | #R0547S | |
| penicilina-estreptomicina | Life Technologies | #15140122 | |
| Pestatina A | Santa Cruz Biotechnology | #45036 | |
| fluoreto de fenilmetilsulfonil | Santa Cruz Biotechnology | #329-98-6 | |
| Poly-L-lysine | sigma aldrich | P#2636 | |
| Tesoura de mola pequena e afiada reta | Ferramentas de ciência | ||
| fina T4 DNA Ligase | Promega | #M1801 | |
| Tripsina-EDTA 0,25 | Life Technologies | # 25200056 | |
| Processador de líquido ultrassônico de célula vibratória (VCX 130) | Sonics | ||
| Wizard mais sistema de purificação de DNA SV Minipreps | Promega | #A1330 |
Referências
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- Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
- Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
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- Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170(2009).
- Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
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- Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
- Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
- Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).
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Reimpressões e permissões
