Name: Modulação molecular por shRNAs específicos entregues por lentivírus em neurônios estressados do retículo endoplasmático (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Aprenda a usar shRNAs específicos entregues por lentivírus para modular calcineurina e CHOP em neurônios corticais primários sob estresse do retículo endoplasmático. Este método revela mecanismos de proteção neuronal.

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Agradecemos ao Dr. Gonzalo Quasollo por sua inestimável ajuda com imagens e à Dra. Andrea Pellegrini pelo suporte técnico de cultura celular.
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de: National Institute of Health, EUA (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 entre UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) e da Agência Nacional de Promoção Científica e Tecnológica, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).

Os procedimentos animais são realizados seguindo protocolos aprovados pelo Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. A aprovação para a realização do estudo é concedida pelo Comitê de Ética e Cuidado Animal (CICUAL) do INIMEC-CONICET-UNC (Resoluções nºs 014/2017 B e 006/2017 A).
1. Culturas primárias de neurônios corticais de ratos
<ol><li>Anestesiar ratas E18 Wistar prenhes em uma câmara de CO 2 com uma mistura de 80% de CO2 /20% O2 por 60 s de exposição e, em seguida, sacrificar as vértebras cervicais.</li>
	<li>Execute as etapas a seguir em um exaustor de fluxo laminar. Extraia o encéfalo dos embriões com um estilo de pinça # 3 e tesoura de mola pequena afiada reta (Tabela de Materiais) para solução de Hanks em pratos de cultura de células.</li>
	<li>Dissecar o tecido sob lupa de 20x, usando duas pinças de ponta fina estilo # 5, separando o córtex frontal das meninges. Transfira o córtex frontal para um tubo cônico de 15 mL e incube o tecido com 3-4 mL de tripsina-EDTA (0,25%) por 15 min, a 37 °C para digestão química.</li>
	<li>Após a digestão, dilua-o com 3-4mL de meio águia modificado (DMEM) da Dulbecco mais 10% de soro fetal de bezerro (FCS). Em seguida, lave-o 3 vezes com Ca2+/Mg2+ solução livre de Sal Balanceado de Hanks e glicose a 0,1% por centrifugação (3000 g por 5 min).</li>
	<li>Dissociar mecanicamente o tecido 10 vezes pipetando para cima e para baixo usando uma ponta de 1000 μL, em DMEM mais 10% FCS (Tabela de Materiais). Em seguida, centrifugar o homogeneizado a 100 x g por 1 min, coletar o sobrenadante e completar o volume restante a 1000 μL.</li>
	<li>Chapear a suspensão celular em placas de cultura celular a uma densidade de 520 células/mm 2 com2 ml de DMEM contendo 10% de FCS, 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de um aditivo de aminoácidos essenciais (ver Tabela de Materiais). Em seguida, incubar a 37 °C em ambiente umidificado com 5% de CO 2 por2 h.<ol><li>Remoção de matéria orgânica e revestimento de poli-L-lisina de placas de cultura celular<ol><li>Remova a matéria orgânica colocando o material de vidro em uma câmara de reação e adicione 96% de álcool etílico para cobrir o material. Em seguida, adicione 68% (p/v) de ácido nítrico gota a gota até que bolhas acastanhadas-esverdeadas comecem a aparecer. Quando isso acontecer, cubra parcialmente o recipiente e permita que a reação continue até que a explosão cesse. NOTA: Remova a matéria orgânica sob uma cabine de extração de gás para evitar a exposição a gases nocivos.</li>
			<li>Antes do revestimento de poli-L-lisina, lave os copos com água Mili-Q estéril cerca de dez vezes. Em seguida, incube os copos e pratos de cultura com 0,1 μg/μL de poli-L-lisina por 4 h antes de usá-los. Após a incubação, lave os copos com água Mili-Q estéril cerca de dez vezes.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Para permitir a diferenciação das células neurais, troque o meio por um meio neurobasal livre de soro, com o suplemento sem soro (Tabela de Materiais). Manter as culturas a 37 °C com 5% de CO2 até ao tratamento.</li>
</ol>2. Produção de lentivírus
NOTA: Os oligonucleótidos que contêm as sequências que visam as 3'UTRs da isoforma CN-Aα ou CHOP e com as sequências não direcionadas (scrambles) estão listados na Tabela 1.
<ol><li>Para o recozimento, misture dois oligonucleotídeos de fita simples com sequências complementares em quantidades molares iguais, usando tampão de recozimento (10 mM Tris-HCl, pH 7,5-8,0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Aquecer a 95 °C durante 2 min e, em seguida, arrefecer lentamente, transferindo amostras do bloco de calor ou do banho-maria para uma bancada à temperatura ambiente. Diluir o produto resultante [ARN de hairpin curto (shRNA) com extremidades coesivas] até uma concentração final de 0,5 μM, alíquota e conservar a -20 °C.</li>
	<li>Clone a inserção de shRNA no vetor lentiviral pLKO.3G, com GFP como marcador fluorescente verde. Para isso, digerir 1 μg de vetor com as enzimas de restrição EcoRI e PacI misturando o seguinte em um tubo estéril: 2 μL de tampão enzimático de restrição de 10x (100 mM bis-Tris propano-HCl, pH 6,5, 100 mM MgCl2, 1 mg/mL de albumina sérica bovina), 1 μL de 1 μg/μL pLKO.3G, 0,5 μL de 10 U/μL ECoRI, 0,5 μL de PacI (10 U/μL) e 16 μL de água ionizada estéril.<ol><li>Misture suavemente por pipetagem. Incubar a reacção durante 3-4 h a 37 °C. NOTA: As digestão durante a noite são geralmente desnecessárias e podem resultar em degradação do DNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Para a ligadura, misturar o vector digerido e introduzir numa proporção molar de 3:1 e incubá-lo com a ligase T4 e o tampão ligase (fornecidos pelo fabricante) durante a noite a 16 °C. NOTA: Neste ponto, a reacção de ligadura pode ser armazenada a 4 °C até nova utilização.</li>
	<li>Transformar células competentes DH5α (Tabela de Materiais) ou outra cepa de E. coli adequada com a seguinte reação de ligadura.<ol><li>Misture a E. coli competente com o volume total da reacção de ligadura e arrefeça-a no gelo durante 15 min, coloque-a num banho de 42 °C durante 2 min e depois arrefeça-a novamente no gelo durante 15 min.</li>
		<li>Transferir o volume total submetido a choque térmico para um tubo de 15 ml e completar o volume para 1000 μL com meio líquido Luria-Bertani (LB) previamente mantido a 37 °C. Agitar as bactérias durante 90 minutos a 37 °C num agitador orbital a aproximadamente 330 rpm.</li>
		<li>Centrifugar-os a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar 900 μL de sobrenadante. Use o sobrenadante restante para ressuspender o pellet. Espalhe a suspensão de bactérias uniformemente sobre uma placa LB sólida de ampicilina (100 μg/mL).</li>
		<li>Incubar a 37 °C durante a noite e, em seguida, verificar o crescimento bacteriano. Neste ponto, as bactérias podem ser armazenadas a 4 °C por 4-5 dias.</li>
		<li>Escolha uma única colônia para transferir para um tubo de 50 mL com 10 mL de meio líquido LB e ampicilina (100 μg/mL). Agitar as bactérias ON a 37 °C a aproximadamente 330 rpm.</li>
		<li>Centrifugar a cultura para peletizar as bactérias a 5.000 x g durante 5 min a 4 °C, eliminar o sobrenadante e conservar o pellet bacteriano. Este pode ser armazenado a -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Purifice o plasmídeo com um kit de purificação de DNA de pellets de bactérias seguindo as instruções do fabricante (Tabela de Materiais). Calcular a concentração de ADN medindo a absorvância a 260 nm e multiplicando pelo factor de diluição, utilizando a seguinte relação: A260 de 1,0 = 50 μg/ml de ADN de fita dupla pura (ds).</li>
</ol>3. Infecção por Lentivirus
NOTA: Execute o procedimento de geração de lentivírus em um exaustor de fluxo laminar Classe II.
<ol><li>24 h antes da transfecção, a semente 1-5 × 106 células HEK 293 em placas de cultura de 100 mm de diâmetro em 8 mL de meio de crescimento e incubá-las a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>Misture 14 μg de vetor pKLO.3G com inserção específica, 10,5 μg de plasmídeo de embalagem psPAX e 3,5 μg de plasmídeo de envelope pMD2.G (Tabela de Materiais). Diluir 45 μL de reagente de transfecção plasmídica (Tabela de Materiais) em 700 μL de meio sérico reduzido (Tabela de Materiais) e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, combine a mistura de DNA com o reagente de transfecção de plasmídeo diluído, misture suavemente e incube por 20 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Enquanto isso, mudar para DMEM fresco o meio do prato de cultura de culturas de células HEK 293 (70% confluente no momento da transfecção). Em seguida, adicione todo o volume da solução de DNA gota a gota. Agite o prato suavemente. Não é necessário adicionar/trocar o meio após a transfecção.</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 durante 48 h-72 h para permitir que os shRNAs atinjam a sua transdução óptima verificada por fluorescência de GFP utilizando um microscópio de fluorescência. Depois, recolher o meio com lentivírus e conservar a 4 °C.</li>
	<li>Sobrenadante viral filtrado com membrana de nylon de 0,45 μm. Aliquotar o fluxo-através em 1 mL. Em seguida, centrifugar a 17.000 x g por 4 h. Descarte o sobrenadante e conserve o pellet. Deixe o pellet invisível secar e, uma vez seco, armazene a - 80 °C.<ol><li>Realizar titulação viral por citometria de fluxo. Semear 4 x 105 células HEK 293 em placas de 24 poços e incubar a 37 °C por 24 h. Em seguida, ressuscite as partículas virais em 200 μL de meio de cultura DMEM (Tabela de Materiais) e adicione 0,05, 0,02 e 0,005 μL a cada poço.</li>
		<li>Incubar a infecção viral por 72 h, remover o meio e tripsinizar (tripsina a 0,05%, 1 mL) por 3 min. Adicionar 1 mL de DMEM em solução FCS a 10% e centrifugar a 500 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e lave o pellet duas vezes com PBS.</li>
		<li>Ressuscite o pellet com 100 μL de PBS e fixe as células com 100 μL de paraformaldeído a 2% (PFA) em PBS. Analise as células com um citômetro de fluxo e determine a porcentagem de células fluorescentes GFP. Colete esses dados para calcular a titulação viral usando a seguinte fórmula: Titulação Viral <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/61974/61974eq01.jpg"></li>
	</ol></li>
</ol>4. Culturas primárias de neurônios estressadas com acúmulo de gangliosídeos GM2 e imunocitoquímica usando anticorpo anti-MAP2
<ol><li>Infectar as culturas de neurônios corticais primários (15 dias in vitro) com oligonucleotídeos específicos de shRNA visando as UTRs de 3' de CN-Aα ou CHOP e incubá-las a 37 °C com 5% de CO2 por 1 dia. NOTA: Culturas primárias de neurônios corticais de 7-8 dias in vitro também podem ser usadas se as células apresentarem alto crescimento de neurites.<ol><li>Preparar uma solução-mãe de 500 μM de gangliosídeo GM2 em etanol e sonicá-la por 1 h.</li>
		<li>Adicionar a solução-mãe GM2 ao meio dos pratos de cultura a uma concentração final de 2 μM. Deixar incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 16, 24 e 48 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Use algumas culturas para preparar o homogeneizado celular para análise de western blot (para especificação de anticorpos, consulte a Tabela de Materiais).</li>
	<li>Siga os passos 1.4. e 1.5. e, em seguida, fixar as células com PFA a 4% e sacarose a 120 mM em PBS por 20 min a 37 °C e, em seguida, lavá-las com PBS. Realize este procedimento em uma membrana antiderrapante em uma câmara úmida. Posteriormente, adicionar solução de permeabilização (Triton X-100 a 0,2% em PBS) por 5 min e lavar com PBS.<ol><li>Use BSA a 5% diluído em PBS por 45 min para permitir o bloqueio, em seguida, incubar com anticorpo anti-MAP2, diluído 1:800 em solução de bloqueio, a 4 °C durante a noite.</li>
		<li>Ao final do tempo de incubação, lavar duas vezes com PBS e incubar com anticorpo secundário (Tabela de Materiais) por 1 h. Em seguida, lave as células com PBS e monte os óculos em lâminas usando um meio de montagem aquoso (Tabela de Materiais).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Análise da atrofia neurítica
<ol><li>Obtenha imagens com uma lente de ar de 20x (NA 0,8) usando um microscópio invertido de epifluorescência equipado com uma câmera CCD. Analise imagens com plug-ins ImageJ. Para isso, carregue a imagem no ImageJ e subtraia o plano de fundo clicando em Processo | Subtraia o plano de fundo.</li>
	<li>Clique na imagem | Ajustar | Limite ou digite as seguintes teclas: Ctrl (ou Cmd) + Shift + T. Uma janela se abre para ajustar os valores mínimos, permitindo que os traçados de caminho e soma sejam distinguíveis. Clique na imagem binária (neurites e somas são de cor branca). Nesta imagem, use a seleção à mão livre para excluir somas; a área do soma selecionada fica preta novamente.</li>
	<li>Selecione rastreamentos e clique em Editar | Seleção | Criar seleção. Obtenha o ROI clicando nas teclas Ctrl (ou Cmd) e T da seleção e conserve-o. Abra a imagem original, clique no painel do gerenciador de ROI e selecione o ROI correspondente, obtido anteriormente. Em seguida, clique na imagem original.</li>
	<li>Depois que o ROI for rastreado na imagem, digite Ctrl (ou Cmd) e as teclas M (Analisar | Medida). Uma janela se abre; copiar o valor médio (unidades arbitrárias a.u.) para processar a análise estatística. NOTA: Para obter valores como μm, clique em Analisar | Definir escala. Uma janela aparece aberta para definir valores. Certifique-se de adicionar a escala correta (Analisar | Set Scale) dependendo das características do microscópio utilizado.</li>
</ol>

<ol><li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mammalian unfolded protein response.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).</li>
<li>Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+PERK+kinase+domain+suggests+the+mechanism+for+its+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica.+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation.</a> Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).</li>
<li>Bollo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+interacts+with+PERK+and+dephosphorylates+calnexin+to+relieve+ER+stress+in+mammals+and+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs.</a> PLoS One. 5, 11925(2010).</li>
<li>Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+beta+protects+brain+after+injury+by+activating+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response.</a> Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).</li>
<li>Harding, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+stress+response+regulates+amino+acid+metabolism+and+resistance+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress.</a> Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).</li>
<li>Hetz, C., Saxena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration.</a> Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).</li>
<li>Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+effects+of+PERK+and+IRE1+signaling+on+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability.</a> PLoS One. 4, 4170(2009).</li>
<li>Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+atrophy+and+apoptosis+mediated+by+PERK+signaling+after+accumulation+of+GM2-ganglioside%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).</li>
<li>Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglioside-enhanced+neurite+growth%3A+evidence+for+a+selective+induction+of+high-molecular-weight+MAP-2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2.</a> The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).</li>
<li>Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+hairpin+RNA+%28shRNA%29%3A+design%2C+delivery%2C+and+assessment+of+gene+knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown.</a> Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Rusnak, F., Mertz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin%3A+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcineurin: form and function.</a> Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).</li>
<li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+by+calcium%2C+calcineurin%2C+and+NFAT%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT.</a> Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).</li>
<li>Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBP+homologous+protein+%28CHOP%29+is+crucial+for+the+induction+of+caspase-11+and+the+pathogenesis+of+lipopolysaccharide-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation.</a> Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Descrevemos um sistema experimental que permite a modulação molecular da transição das fases de sobrevida para UPR apoptótica em um modelo celular neuronal.
Para uma análise adequada da atrofia neurítica, é essencial a obtenção de culturas primárias de neurônios com processos numerosos, longos e altamente ramificados 9,11. Isso facilita o exame da extensão do processo dos neurônios, permitindo que as diferenças claras entre os tratamen...

O estresse do retículo endoplasmático (RE) é definido como qualquer perturbação que comprometa a capacidade de dobramento de proteínas na organela. O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do lúmen do ER ativa um sinal de cascata de transdução chamado resposta proteica desdobrada (UPR). Esta via de sinalização complexa é orquestrada por três sensores de estresse: PERK (proteína quinase RNA [PKR]-like ER quinase), IRE1 (enzima 1 que requer inositol) e ATF6 (fator de transcrição ativado 6). Todos juntos tentam restaurar a homeostase. Mas se o estresse persistir, a RPU eventualmente induz a morte celular por apoptose1.
PERK, uma proteína transmembrana de RE, sob estresse de RE, lidera a fosforilação do fator de iniciação eucariótico-2 alfa (eIF2α), reduzindo a síntese proteica global e, portanto, a carga proteica no RE2. Demonstramos que a calcineurina A/B (CNA/B), um heterodímero Ca2+ fosfatase, liga-se diretamente ao domínio citosólico da PERK, aumentando sua autofosforilação e aumentando significativamente a inibição da tradução de proteínas e a viabilidade celular 3,4. Curiosamente, o CNA/B é abundante no cérebro de mamíferos, distinguindo duas isoformas da subunidade A do CN: α e β.
Sob estresse sustentado do RE, a via de sinalização PERK é o único ramo UPR que permanece ativado, mediando assim tanto a resposta pró-sobrevivência quanto a resposta apoptótica. Na fase crônica, um dos principais eventos a jusante é a indução do fator de transcrição, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homóloga protein)5. O estresse crônico do RE também é cada vez mais reconhecido como um contribuinte comum para uma extensa gama de distúrbios patológicos, incluindo doenças neurodegenerativas6. É importante compreender como a RPU pode facilitar a sinalização citoprotetora em vez da morte celular 7. No entanto, atualmente pouco se sabe sobre o mecanismo exato que controla a transição entre essas duas fases da RPU.
Recentemente, descobrimos que, em neurônios cultivados, o gangliosídeo GM2 se acumula nas membranas do RE e induz a depleção de cálcio luminal. Isso, por sua vez, ativa a sinalização PERK, que medeia a atrofia neurítica e a apoptose 8. Neste estudo, o acúmulo de GM2 em neurônios cultivados é usado como um modelo de sistema celular de atrofia de neurite induzida por estresse de ER. Especificamente, duas expressões do fator PERK são manipuladas, CN-Aα e CHOP, o que alterna a transição entre eventos precoces/protetores e uma fase crônica/apoptótica. Para conseguir isso, os respectivos genes são silenciados; assim, as culturas primárias de neurônios corticais são infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus. A análise de Western blot revela uma redução significativa dos níveis de expressão de CN-Aα e CHOP em comparação com as células de controle, que estão infectadas com lentivírus que carregam um shRNA embaralhado. Após esse tratamento, os neurônios são submetidos a diferentes tempos de incubação de GM2 exógeno, fixo e imunocorado com anticorpo anti-proteína 2 associada a microtúbulos (MAP2)9. As imagens são obtidas com um microscópio de epifluorescência. O crescimento total de neuritos é avaliado em relação ao número total de células.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-Mouse</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#R37120</td><td></td></tr><tr><td>anti-CHOP</td><td>Thermo Fisher</td><td># MA1 - 250</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CN-A&alpha;</td><td>Millipore</td><td># 07-067</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GM2</td><td>Matreya</td><td>#1961</td><td></td></tr><tr><td>anti-MAP2</td><td>Sigma Aldrich</td><td># M2320</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-actina</td><td>Thermo Fisher</td><td># PA1 - 183</td><td></td></tr><tr><td>aprotinina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#3595</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200 microscópio de epifluorescência</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>#17504944</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>#11966025</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>Promega</td><td>#R6011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>#16000044</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de ponta fina&nbsp; estilo #5</td><td>Pinça Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>estilo #3</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293</td><td>ATCC</td><td>#CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 CW anticorpo secundário</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632221</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 anticorpo secundário</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632220</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW anticorpo secundário</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800 CW anticorpo secundário</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>#92632211</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo de envelope lentiviral pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>plasmídeo de empacotamento lentiviral psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>vetor lentiviral pLKO.3G</td><td>Addgene</td><td>#14748</td><td></td></tr><tr><td>Hemissulfato de leupeptina</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>#295358</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina LTX & Plus Reagent (reagente de transfecção de plasmídeo)</td><td>Life Technologies</td><td>#A12621</td><td></td></tr><tr><td>MISSÃO shRNA Sigma</td><td>Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monosialoganglioside GM2</td><td>Matreya</td><td>#1502</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>#21103049</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose 0.45 & Micro; m</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620115 Sistema de</td><td></td></tr><tr><td>imagem infravermelha Odyssey</td><td>LI-COR Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OneShot Top 10</td><td>Life Technology</td><td>#C404010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (Mídia de soro reduzida)</td><td>Life Technologies</td><td>#105802</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>BioLabs</td><td>#R0547S</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pestatina A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#45036</td><td></td></tr><tr><td>fluoreto de fenilmetilsulfonil</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine</td><td>sigma aldrich</td><td>P#2636</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola pequena e afiada reta</td><td>Ferramentas de ciência</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fina T4 DNA Ligase</td><td>Promega</td><td>#M1801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25</td>% <td>Life Technologies</td> <td># 25200056</td><td></td></tr><tr><td>Processador de líquido ultrassônico de célula vibratória (VCX 130)</td> <td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard mais sistema de purificação de DNA SV Minipreps</td><td>Promega</td><td>#A1330</td><td></td></tr></tbody></table>

modulação molecular por shrnas específicos entregues por lentivírus em neurônios estressados do retículo endoplasmático

Molecular Modulation by Lentivirus-Delivered Specific shRNAs in Endoplasmic Reticulum Stressed Neurons

O acúmulo de proteínas desdobradas dentro do retículo endoplasmático (RE), causado por qualquer condição de estresse, desencadeia a resposta proteica desdobrada (UPR) através da ativação de sensores especializados. UPR tenta primeiro restaurar a homeostase; mas se o dano persistir, a sinalização induz a apoptose.
Há evidências crescentes de que o estresse ER sustentado e não resolvido contribui para muitas condições patológicas, incluindo doenças neurodegenerativas. Como a RPU controla o destino celular alternando entre processos citoprotetores e apoptóticos, é essencial entender os eventos que definem essa transição, bem como os elementos envolvidos em sua modulação.
Recentemente, demonstramos que o acúmulo anormal de gangliosídeos GM2 causa o esgotamento do conteúdo de ER Ca2+ , que por sua vez ativa a PERK (PKR-like-ER quinase), um dos sensores UPR. Além disso, a sinalização PERK participa da atrofia neurítica e da apoptose induzida pelo acúmulo de GM2. A este respeito, estabelecemos um sistema experimental que nos permite modular molecularmente a expressão de componentes PERK a jusante e, assim, alterar a vulnerabilidade dos neurônios para sofrer atrofia neurítica.
Realizamos knockdown da expressão de calcineurina (citoprotetora) e CHOP (pró-apoptótica) em culturas neuronais corticais de ratos. As células foram infectadas com shRNA específico entregue por lentivírus e, em seguida, tratadas com GM2 em diferentes momentos, fixadas e imunocoradas com anticorpo anti-MAP2 (proteína 2 associada a microtubos). Posteriormente, as imagens celulares foram registradas usando um microscópio de fluorescência e o crescimento total de neuritos foi avaliado usando o software de processamento de imagens de domínio público ImageJ. A inibição da expressão desses componentes de sinalização PERK claramente tornou possível acelerar ou retardar a atrofia neurítica induzida pelo estresse do RE.
Essa abordagem pode ser usada em modelos de sistema celular de estresse de RE para avaliar a vulnerabilidade dos neurônios à atrofia de neuritos.

Aqui, abordamos a questão de saber se o silenciamento de dois componentes PERK a jusante afeta a fase de transição da UPR em um modelo de célula de estresse ER. Para conseguir isso, silenciamos o gene CN-Aα, bem como o gene CHOP por duas sequências específicas de shRNA para cada um (Tabela 1) em cultura de células de neurônios primários por 1 dia10. A expressão é analisada por Western blotting (Figura 1 e Figura 2...

No presente estudo, a expressão é derrubada de dois componentes sinalizadores a jusante da via PERK, a calcineurina citoprotetora e o CHOP pró-apoptótico, utilizando shRNAs específicos. De maneiras opostas, eles modulam a suscetibilidade dos neurônios corticais primários à atrofia da neurite após a indução do estresse do retículo endoplasmático.

Modulação molecular por shRNAs específicos entregues por lentivírus em neurônios estressados do retículo endoplasmático

The accumulation of unfolded proteins within the endoplasmic reticulum (ER), caused by any stress condition, triggers the unfolded protein response (UPR) ...

Esta abordagem pode ser usada em modelos de sistema celular de estresse do retículo endoplasmático, manipulando a expressão molecular de componentes de pares a jusante. A principal vantagem desta técnica é remover o impacto da sinalização emparelhada pela visualização e medição das vias neurais. Este método pode contribuir para a compreensão da base molecular da transição entre as fases aguda e crônica do estresse do RE em diversos modelos de doenças neurodegenerativas, além da gangliosidose GM2 Para começar, disseque o tecido sob uma lupa 20X com duas pinças de ponta fina número cinco, separando o córtex frontal das meninges.Transfira o córtex frontal para um tubo cônico de 15 mililitros e incube o tecido com três a quatro mililitros de tripsina EDTA por 15 minutos a 37 graus Celsius para digestão química. Depois disso, lave-o três vezes com solução salina de Hank livre de íons de cálcio e magnésio e 0,1% de glicose. Dissociar mecanicamente o tecido 10 vezes pipetando para cima e para baixo usando uma ponta de 1.000 microlitros em DMEM mais 10% FCS.Centrifugar o homogeneizado a 100 G durante um minuto, recolher o sobrenadante e completar o volume restante em 1 000 microlitros. Chapear a suspensão celular em placas de cultura celular a uma densidade de 520 células por milímetro quadrado com dois mililitros de DMEM contendo 10% FCS, 1% de estreptomicina de penicilina e 1% de um aditivo de aminoácidos essenciais. Incubar a 37 graus Celsius em um ambiente umidificado com 5% de dióxido de carbono por duas horas.Para permitir a diferenciação de células neurais, mude o meio para um meio neurobasal livre de soro com o suplemento sem soro. Mantenha as culturas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono até o tratamento. Para o recozimento, misture dois oligonucleotídeos de fita simples com sequências complementares em quantidades molares iguais.Aqueça a 95 graus Celsius por dois minutos. Transferir as amostras do bloco de calor e diluir o produto resultante para uma concentração final de 0,5 micromolar. Para clonar o shRNA inserir no vetor lentiviral pLKO.3G, digerir um micrograma do vetor com as enzimas de restrição EcoR1 e PAC1. Misture suavemente por pipetagem e incube a reação por três a quatro horas a 37 graus Celsius. Para ligadura, misture o vetor digerido e insira-o em uma proporção molar de 3:1.Incube-o com a ligase T4 e o tampão ligase durante a noite a 16 graus Celsius. Em seguida, misture o componente E.coli com o volume total da reação de ligadura e resfrie-o no gelo por 15 minutos. Coloque-o em um banho de 42 graus Celsius por dois minutos e, em seguida, esfrie no gelo novamente por 15 minutos.Transfira o volume total submetido ao choque térmico para um tubo de 15 mililitros e complete o volume para 1.000 microlitros com Luria-Bertani, ou meio líquido L-B. Agite as bactérias por 90 minutos de 37 graus Celsius em um agitador orbital a aproximadamente 330 RPM. Centrífuga que atendeu a 5.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Descarte 900 microlitros do sobrenadante e use o sobrenadante restante para ressuspender o pellet. Espalhe a suspensão de bactérias uniformemente sobre uma placa sólida de ampicilina L-B e incube por 37 graus Celsius durante a noite. Escolha uma única colônia para transferir para um tubo de 15 mililitros com 10 mililitros de meio líquido L-B e ampicilina.Agitar as bactérias a 37 graus Celsius a aproximadamente 330 RPM e centrifugar a cultura para peletizar as bactérias a 5.000 G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Depois de descartar o sobrenadante, conserve o pellet bacteriano a menos 20 graus Celsius. 24 horas antes da transfecção, semeie de 1 a 5 milhões de células HEK-293 em placas de cultura de 100 milímetros.Misture 14 microgramas de pKLO. Vetor 3G com uma inserção específica, 10,5 microgramas de psPAX plasmídeo de embalagem e 3,5 microgramas de plasmídeo de envelope pMD2. G.Diluir 45 microlitros de reagente de transfecção plasmídica em 700 microlitros de meio sérico reduzido e incubar durante cinco minutos à temperatura ambiente.Em seguida, combine a mistura de DNA com o reagente de transfecção de plasmídeo diluído, misture suavemente e incube por 20 minutos à temperatura ambiente. Altere o meio da placa de cultura das células HEK-293 com um meio fresco após a transfecção e adicione todo o volume da solução de DNA gota a gota. Agite o prato suavemente e incube as células a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono por 48 a 72 horas para permitir que os shRNAs atinjam sua transdução ideal.Recolha o meio com lentivírus e guarde a quatro graus Celsius. Filtre o sobrenadante viral com uma membrana de nylon de 0,45 micrômetro e alíquota de um milímetro do fluxo. Centrífuga a 17.000 G por quatro horas.Descarte o sobrenadante e conserve o pellet. Deixe o pellet invisível secar e, uma vez seco, armazene a menos 80 graus Celsius. Infectar as culturas de neurônios corticais primários com oligonucleotídeos específicos de shRNA, visando as UTRs de três primos da calcineurina A-alfa ou CHOP e incubá-las a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por um dia.Em seguida, adicionar a solução-estoque de GM2 ao meio do prato de cultura a uma concentração final de dois micromolares e incubar a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 16, 24 e 48 horas. Fixar as células com 4%paraformaldeído e sacarose 120 milimolares em PBS durante 20 minutos a 37 graus Celsius e depois lavá-las com PBS. Adicionar solução de permeabilização por cinco minutos e lavar com PBS.Use BSA a 5% diluído em PBS por 45 minutos para permitir o bloqueio. Em seguida, incubar com o anticorpo anti-MAP2 a quatro graus Celsius durante a noite. Depois de lavar as células duas vezes com PBS no final do tempo de incubação, incubar com um anticorpo secundário por uma hora.Monte os copos depois de lavar as células com PBS. Após a obtenção das imagens com um microscópio invertido de epifluorescência, carregue a imagem para obter ImageJ e subtraia o fundo clicando em Processo seguido de Subtrair Fundo. Clique em Imagem, Ajustar, Limite para ajustar os valores mínimos, permitindo que o caminho e alguns traçados sejam distinguíveis.Exclua somas usando a seleção à mão livre. Selecione Rastreamentos e clique em Editar, Seleção, Criar Seleção. Obtenha o ROI clicando nas teclas de controle e T da seleção e conserve-o.Abra a imagem original. Clique no painel Gerenciador de ROI e selecione o ROI inicial. Em seguida, clique na imagem original.Uma vez que o ROI rastreia na imagem, pressione controle e as teclas M para processar a análise estatística. Uma tentativa foi feita aqui para verificar se o silenciamento de componentes a jusante do 2pERK afeta a fase de transição da resposta proteica desdobrada no modelo de células de estresse ER. O gene A-alfa da calcineurina e o gene CHOP foram silenciados por duas sequências específicas de shRNA em uma cultura primária de células de neurônios por um dia.A expressão é analisada por Western blotting. Observa-se uma clara inibição do aumento do nível de calcineurina A-alfa mediado por estresse do RE e do nível de CHOP nas células knockdown. A possível ligação do estresse do RE induzido pelo acúmulo de GM2 com a degeneração neuronal foi examinada através da realização de imunocoloração MAP2 de culturas neuronais primárias.A atrofia dos neuritos aumenta significativamente após a indução do estresse do RE pela incubação de GM2 em 16 a 48 horas. O silenciamento da expressão de calcineurina A-alfa aumenta significativamente a atrofia dos neuritos, particularmente às 16 horas de acumulação de GM2 em relação aos grupos GM2 não tratados. Assim, o knockdown da calcineurina A-alfa acelerou o processo de degeneração nos neurônios, corroborando o efeito pró-sobrevivência da calcineurina durante a fase inicial da resposta proteica desdobrada.Por outro lado, o knockdown do CHOP resultou em atrofia de neurite significativamente diminuída em relação aos controles precisamente em 16 a 24 horas. o protocolo celular com a cultura de células primárias adequada e a obtenção de 90 ou mais porcentagens de células infectadas com o respectivo lentivírus. Como a perda do axônio terminal neural é o primeiro passo que estabelecemos em nosso processo, também é possível avaliar isso realizando um ensaio.Esta técnica permite que o nosso grupo e outros avaliem algumas moléculas como potenciais ferramentas terapêuticas.

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