Os procedimentos experimentais para a realização de rotulagem covalente à base de diethylpirocarbonato com detecção espectrométrica em massa são descritos. O dietilpirocarbonato é simplesmente misturado com o complexo de proteínas ou proteínas de interesse, levando à modificação de resíduos de aminoácidos acessíveis solventes. Os resíduos modificados podem ser identificados após a digestão proteolítica e a análise da cromatografia líquida/espectrometria de massa.
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Artigo de método
Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Caracterizar a estrutura de alta ordem de uma proteína é essencial para entender sua função. A espectrometria de massa (MS) emergiu como uma ferramenta poderosa para este fim, especialmente para sistemas proteicos difíceis de estudar pelos métodos tradicionais. Para estudar a estrutura de uma proteína por MS, reações químicas específicas são realizadas em solução que codifica as informações estruturais de uma proteína em sua massa. Uma abordagem particularmente eficaz é o uso de reagentes que modificam covalentemente cadeias laterais de aminoácidos acessíveis de solvente. Essas reações levam a aumentos de massa que podem ser localizados com resolução de nível de resíduo quando combinados com digestão proteolítica e espectrometria de massa tandem. Aqui, descrevemos os protocolos associados ao uso de diethylpirocarbonato (DEPC) como um reagente de rotulagem covalente juntamente com a detecção de MS. O DEPC é uma molécula altamente eletrofílica capaz de rotular até 30% dos resíduos na proteína média, proporcionando assim excelente resolução estrutural. O DEPC tem sido usado com sucesso junto com a MS para obter informações estruturais para pequenas proteínas de domínio único, como β2-microglobulina, para grandes proteínas multi-domínio, como anticorpos monoclonais.
Introdução
Proteínas são biomoléculas essenciais em praticamente todos os processos fisiológicos. A variedade de funções que as proteínas realizam são possíveis devido às estruturas que adotam e às interações que têm com outras biomoléculas. Para entender a função proteica em um nível mais profundo, ferramentas bioquímicas e biofísicas são necessárias para elucidar essas importantes características e interações estruturais. Tradicionalmente, a cristalografia de raios-X, a microscopia eletrônica criogênica e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) forneceram o detalhe desejado do nível atômico para revelar a estrutura proteica. No entanto, inúmeros sistemas protei....
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Protocolo
1. Preparação de proteínas e reagentes
NOTA: Este protocolo inclui um fluxo de trabalho de exemplo para rotular uma proteína com DEPC. Algumas condições e concentrações de reagentes listadas podem variar de acordo com a proteína escolhida.
- Prepare todas as soluções de reagente em tubos de microcentrifus de 1,5 mL.
- Prepare uma solução proteica de concentração desejada, geralmente na faixa de dezenas de μM, em um tampão de ácido propanesulfônico de 10 mM 3-(N-morpholino)em pH 7.4. Alternativamente, prepare uma solução proteica existente de troca de buffer em 10 mM pH 7.4 MOPS se a amostra contiver um tampão nucleofílico qu....
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Resultados
Identificação de locais de modificação do DEPC e percentagens de modificação
A adição em massa devido à rotulagem covalente pode ser medida nos (a) níveis de proteína intacta e (b) peptídeo8,9. No nível intacto, uma distribuição de espécies proteicas com diferentes números de rótulos pode ser obtida a partir de análise direta ou LC-MS de amostras de proteínas rotuladas. Para obter informações estruturais de maior resolução (ou seja, dados de rotulagem.......
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Discussão
Passos críticos
Vários pontos relativos ao design experimental devem ser considerados para garantir resultados confiáveis de rotulagem. Primeiro, para maximizar a rotulagem de proteínas, é necessário evitar buffers com grupos fortemente nucleofílicos (por exemplo, Tris) porque eles podem reagir com o DEPC e diminuir a extensão da rotulagem. Também é concebível que tais tampões possam reagir com resíduos rotulados, causando a remoção do rótulo e, portanto, a perda de informações estruturais. Recomendamos MOPS .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) sob o Grant R01 GM075092. O espectrômetro de massa Thermo Orbitrap Fusion usado para adquirir alguns dos dados aqui descritos foi adquirido com recursos do Instituto Nacional de Saúde s10OD010645.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| Ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico | Millipore Sigma | M1254 | |
| Sal de sódio ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Coluna | Thermo Scientific | 164537 | 300 μ m x 15 cm, C18, 2 μ m, 100 A |
| Acetonitrila | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Dietilpirocarbonato | Millipore Sigma | D5758 | |
| Água de grau HPLC | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazol | Millipore Sigma | I5513 | |
| Quimotripsina imobilizada | ProteoChem | g4105 | |
| Tripsina imobilizada, TPCK Thermo | tratado Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamida | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carboxietil)fosfina | Millipore Sigma | C4706 |
Referências
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrog....
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Reimpressões e permissões
