Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

Camila F. Almeida; Emma C. Frair; Nianyuan Huang; Reid Neinast; Kim L. McBride; Robert B. Weiss; Kevin M. Flanigan; Nicolas Wein

doi:10.3791/61991

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Artigo de método

Reprogramação Direta de Fibroblastos Humanos em Myoblasts para investigar terapias para distúrbios neuromusculares

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DOI:

10.3791/61991

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3 de abril de 2021

Camila F. Almeida¹ , Emma C. Frair¹ , Nianyuan Huang¹ , Reid Neinast² , Kim L. McBride²^,³^,⁴^,⁶ , Robert B. Weiss⁵ , Kevin M. Flanigan¹^,⁶ , Nicolas Wein¹^,⁶

¹Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, ²Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, ³The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, ⁴Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, ⁵Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, ⁶Department of Pediatrics, The Ohio State University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve a conversão de fibroblastos de pele em míobios e sua diferenciação em miotubes. As linhas celulares são derivadas de pacientes com distúrbios neuromusculares e podem ser usadas para investigar mecanismos patológicos e testar estratégias terapêuticas.

Resumo

Investigações sobre a fisiopatologia e alvos terapêuticos em distrofias musculares têm sido dificultadas pela capacidade proliferativa limitada de míbios humanos. Vários modelos de camundongos foram criados, mas ou eles não representam verdadeiramente a fisiopatologia humana da doença ou não são representativos do amplo espectro de mutações encontradas em humanos. A imortalização dos mizadolas primários humanos é uma alternativa a essa limitação; no entanto, ainda depende de biópsias musculares, que são invasivas e não estão facilmente disponíveis. Em contraste, as biópsias de pele são mais fáceis de obter e menos invasivas aos pacientes. Os fibroblastos derivados de biópsias de pele podem ser imortalizados e transdiferenciados em míferas, fornecendo uma fonte de células com excelente potencial miogênico. Aqui, descrevemos um método de reprogramação rápida e direta do fibroblasto em uma linhagem miogênica. Os fibroblastos são transduzidos com dois lentivírus: hTERT para imortalizar a cultura primária e um MYODindutível tet , que após a adição de doxiciclina, induz a conversão de fibroblastos em míbios e, em seguida, miotubes maduros, que expressam marcadores de diferenciação tardia. Este protocolo de transdiferenciação rápida representa uma poderosa ferramenta para investigar mecanismos patológicos e investigar bioterapias inovadoras baseadas em genes ou farmacológicas para distúrbios neuromusculares.

Introdução

Modelos celulares obtidos diretamente dos tecidos humanos são úteis para modelar muitas doenças genéticas humanas, com a vantagem de ter o contexto genômico original e, em muitos casos, reproduzir as mesmas marcas moleculares e celulares observadas nos pacientes. No campo das doenças neuromusculares, as biópsias musculares têm sido uma grande fonte de míbios humanos e têm ajudado na elucidação de mecanismos patológicos. Além disso, são uma ferramenta importante para testes in vivo de drogas e terapias genéticas. Por um lado, a derivação de míobios de fragmentos musculares é relativamente fácil. Por outro lado, a cultura e a manutenção dos myoblasts primários ....