Montagem rápida de construções multigênicas usando clonagem modular de golden gate

Resumo

O objetivo deste protocolo é fornecer um guia detalhado passo a passo para a montagem de construções multigênicas usando o sistema de clonagem modular baseado na clonagem golden gate. Ele também dá recomendações sobre etapas críticas para garantir a montagem ideal com base em nossas experiências.

Resumo

O método de clonagem golden gate permite a montagem rápida de múltiplos genes em qualquer arranjo definido pelo usuário. Ele utiliza enzimas de restrição tipo IIS que cortam fora de seus sites de reconhecimento e criam uma saliência curta. Este sistema de clonagem modular (MoClo) usa um fluxo de trabalho hierárquico no qual diferentes partes de DNA, como promotores, sequências de codificação (CDS) e terminadores, são primeiramente clonadas em um vetor de entrada. Vários vetores de entrada então se reúnem em unidades de transcrição. Várias unidades de transcrição então se conectam a um plasmídeo multi-gene. A estratégia de clonagem da Golden Gate é de tremenda vantagem porque permite um conjunto sem cicatrizes, direcional e modular em uma reação de um pote. O fluxo de trabalho hierárquico normalmente permite a clonagem fácil de uma grande variedade de construções multigênicas sem necessidade de sequenciamento além dos vetores de entrada. O uso de evasão de proteínas fluorescentes permite uma triagem visual fácil. Este trabalho fornece um protocolo detalhado passo a passo para a montagem de plasmídeos multi-genes usando o kit de clonagem modular de levedura (MoClo). Mostramos resultados ótimos e subótimos da montagem plasmida multigênica e fornecemos um guia para triagem para colônias. Esta estratégia de clonagem é altamente aplicável para a engenharia metabólica de levedura e outras situações em que a clonagem plasmida multi-gene é necessária.

Introdução

A biologia sintética visa projetar sistemas biológicos com novas funcionalidades úteis para indústrias farmacêuticas, agrícolas e químicas. Reunir um grande número de fragmentos de DNA de forma de alto rendimento é uma tecnologia fundamental em biologia sintética. Um processo tão complicado pode se dividir em múltiplos níveis com diminuição da complexidade, conceito emprestado das ciências básicas de engenharia^1,2. Na biologia sintética, fragmentos de DNA geralmente se reúnem hierarquicamente com base na funcionalidade: (i) Nível de peça: "partes" refere-se a fragmentos de DNA com uma função específica, como u....

Protocolo

NOTA: O protocolo hierárquico de clonagem oferecido neste kit de ferramentas pode ser dividido em três etapas principais: 1. Plasmids de peça de clonagem; 2. Unidades de transcrição de clonagem (TUs); 3. Clonagem de plasmídeos multiédis(Figura 1). Este protocolo começa a partir do projeto primer e termina com aplicações do plasmídeo multi-gene clonado.

1. Design primer para clonagem da peça plasmid (pYTK001):

1. Projete os primers dianteiros e invertidos contendo nucleotídeos de flanqueamento TTT no final de 5', um local de reconhecimento BsmBI com um nucleotídeo adicional (CGTCTCN), uma saliência de 4 n....

Resultados

Aqui estão os resultados de quatro pládidos multi-genes replicativos para produção de β-caroteno (amarelo) e licopeno (vermelho). Um plasmídeo multi-gene integrado para interromper o lócus ADE2 foi construído, das quais as colônias são vermelhas.

Clonagem de CDSs no vetor de entrada (pYTK001)
O ERG20 foi amplificado a partir do genoma da levedura e dos três genes carotenoides crtE, .......

Discussão

O kit de clonagem baseado em MoClo desenvolvido por Lee et al. fornece um excelente recurso para montagem rápida de uma a cinco unidades de transcrição em um plasmídeo multi-gene, seja para replicação ou integração no genoma da levedura. O uso deste kit elimina o demorado gargalo de clonagem que existe frequentemente para expressar múltiplos genes na levedura.

Testamos cinco condições diferentes para os ciclos de digestão/ligamento da clonagem golden gate com ligase de DNA T4. Descobrimos que .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5 milímetros de grânulos de vidro	RPI produtos de pesquisa	9831	Para lysing células de levedura
Bacto	Agar BD & Empresa	214010	Componente do meio sintético completo de levedura (CSM)
Bacto Peptone	BD & Empresa	211677	Componente do meio de dextrose peptonada de extrato de levedura (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	uma versão altamente eficiente da enzima de restrição de BsaI
Carbenicilina	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiótico para triagem no nível da unidade de transcrição
Cloranfenicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiótico para triagem no nível de vetor de entrada
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Suplemento de aminoácidos do meio sintético completo de levedura (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Fonte de carbono do meio sintético completo de levedura (CSM)
Base de nitrogênio de levedura Difco sem aminoácidos	BD & Empresa	291940	Fonte de nitrogênio do meio sintético completo de levedura (CSM)
mistura dNTP	Promega	U1515	dNTPs para PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	um isoschizomer altamente eficiente de BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	Para transformação de levedura
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	Para extração de carotenóides de células de levedura
Kanamicina	Fisher Biorreagents	25389-94-0	Antibiótico para triagem no nível de plasmídeo multigênico
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Meio de ágar lisogênico para cultura de E. coli
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Meio líquido lisogênico para E. coli NC1142173 de química
licopeno	Cayman		para quantificação de licopeno
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Laboratório de Depósito: John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	Para purificação de plasmídeo de E.coli
Nanodrop Espectrofotômetro	Thermo Scientific	ND2000c	Para medir concentrações precisas
de DNA NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Enzima de restrição para linearização integrativa de plasmídeo multigênico
Sulfato de Nourseotricina	Goldbio	N-500-100	Marcador de seleção de antibióticos para o plasmídeo pCAS usado neste estudo
Tampão de reação Phusion HF (5X)	New England Biolabs	B0518S	Buffer para PCR usando Phusion polimerase
Polimerase de DNA de alta fidelidade Phusion	New England Biolabs	M0530S	Polimerase de alta fidelidade para todas as reações de PCR
pLM494	Addgene	100539	Plasmídeo usado para amplificar crtI, crtYB e crtE usado neste estudo
Cubeta	de quartzo Thermo Electron	10050801	Para quantificar carotenóides
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase para Golden Termociclador de clonagem de porta
	BIO-RAD	1851148	Para realizar todas as reações de PCR e clonagem
Homogeneizador de Tecidos	Bullet Blender	Modelo: BBX24	Para homogeneização de células de levedura
Espectrofotômetro UV-Vis	Thermo Scientific	Genesys 150	Para quantificar carotenóides
Extrato de levedura	Fisher Bioreagents	BP1422-500	Componente do extrato de levedura peptona dextrose (YPD)
β-caroteno	Alfa Aesar	AAH6010603	Para quantificação de β-caroteno

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