Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Resumo

Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), uma centrifugação de gradiente de glicerol na presença de um crosslinker, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas.

Resumo

O emendamento pré-mRNA é um processo muito dinâmico que envolve muitos rearranjos moleculares dos subcoplexos de emenda durante a montagem, processamento de RNA e liberação dos componentes complexos. A centrifugação de gradiente de glicerol tem sido usada para a separação de complexos de proteínas ou RNP (RiboNucleoProtein) para estudos funcionais e estruturais. Aqui, descrevemos a utilização do Grafix (Gradient Fixation), que foi desenvolvido pela primeira vez para purificar e estabilizar complexos macromoleculares para microscopia crio-elétron de partículas únicas, para identificar interações entre fatores de emenda que se ligam transitoriamente ao complexo de emendas. Este método baseia-se na centrifugação das amostras em uma concentração crescente de um reagente de fixação para estabilizar complexos. Após a centrifugação de extratos totais de levedura carregados em gradientes de glicerol, as frações recuperadas são analisadas por mancha de ponto para a identificação dos sub complexidades e determinação da presença de fatores de emenda individuais.

Introdução

O splicing é um processo altamente dinâmico que requer a vinculação e liberação de uma infinidade de fatores de forma coordenada. Esses fatores de emenda incluem proteínas de ligação de RNA, ATPases, helicases, quinases de proteínas e fosfattases, ligaduras de ubiquitina, entre outros^1,2,3; e para permitir que os rearranjos moleculares ocorram, alguns desses fatores se ligam muito transitoriamente aos subcoplexos de emenda, tornando muito desafiador o isolamento e identificação desses complexos intermediários RNP.

Aqui, utilizamos o método Grafix

Protocolo

1. Preparação total do extrato de levedura

1. Cresça as células de levedura expressando um dos fatores de emenda fundidos à tag TAP⁹ em 1 L YNB-glu (Base de Nitrogênio levedura suplementada com 2% m/v de glicose) com os aminoácidos apropriados ou bases nucleicas, neste caso, adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptofano (30 μg/mL), até OD₆₀₀ = 1,0.
2. Colete as células da cultura 1 L por centrifugação em três garrafas centrífugas de centrífugas de 500 mL a 17.000 x g por 10 min a 4 °C e lave duas vezes com água estéril fria de 10 mL.
3. Resuspenha as células de levedura coletadas em 1/10 do volume c....

Resultados

Para analisar o perfil de sedimentação do Cwc24-TAP e determinar se o método Grafix foi eficaz para estabilizar sua vinculação a subcomplexos de emenda, separamos extratos totais de leveduras de células expressando Cwc24-TAP através da centrifugação em gradientes de glicerol, na presença ou ausência de glutaraldeído como agente de ligação cruzada. Amostras de 24 frações de 500 μL foram então analisadas por mancha de slot com anticorpo contra a porção CBP da tag TAP. Os resultados mostram que, na ausência do crosslinker, .......

Discussão

Interações proteína-proteína e ácidos ribonucleicos-proteínas podem ser estabilizadas usando agentes de crosslinking. É importante que o complexo resultante seja estável para suportar a ultracentrifugação no gradiente de glicerol. Além disso, as condições do buffer devem permitir a interação, mas ser rigorosas o suficiente para evitar ligações não específicas. Nos experimentos aqui mostrados, utilizamos uma solução tampão já estabelecida para reações in vitro de emenda¹⁵.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Epítopo de proteína de ligação anti-calmodulina	Millipore	07-482
ECL anti-coelho IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Partes do EconoSystem usadas: bomba peristáltica, detector UV e coletor de frações
Inibidor de protease sem EDTA Cocktail	Roche	11873580001
Sistema de Recuperação de Frações	Beckman Coulter	270-331580	Dispositivo de perfuração de tubos que foi conectado às peças do EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Moinho Misturador MM 200	Retsch	207460001	Dispositivo de Moinho
de Bolas Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrífuga	Thermo Scientific	36-101-0816
Rotor de Balde Oscilante P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Tubos de Centrífuga Ultra-Clear (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059