Artigo de método

Modelo microfluido para imitar evento inicial de neovascularização

DOI:

10.3791/62003

⸱

10 de abril de 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, fornecemos um chip microfluido e um sistema microfluido de circulação de circulação automaticamente controlado e altamente eficiente que recapitula o microambiente inicial da neovascularização, permitindo que as células endoteliais (CE) sejam estimuladas pelo alto estresse da cisalhamento luminal, nível fisiológico de fluxo transendelial e distribuição de vários fatores de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A neovascularização é geralmente inicializada a partir de uma vasculatura normal existente e o microambiente biomecânico das células endoteliais (CES) no estágio inicial varia drasticamente do processo seguinte de neovascularização. Embora existam muitos modelos para simular diferentes estágios de neovascularização, ainda falta um modelo 3D in vitro que capitula o processo inicial de neovascularização sob as estimulações correspondentes de microambientes normais de vasculatura. Aqui, reconstruímos um modelo 3D in vitro que imita o evento inicial de neovascularização (MIEN). O modelo MIEN contém um chip de brotação microfluido e um sistema de circulação de controle automático e altamente eficiente. Formou-se um microcanal funcional e perfusível revestido de endotélio e o processo de broto foi simulado no chip de brotação microfluídica. O microambiente fisiológico inicialmente da neovascularização foi recapitulado com o sistema de controle microfluido, pelo qual as CEs seriam expostas ao alto estresse da cisalhamento luminal, fluxo transendotelial fisiológico e várias distribuições de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) simultaneamente. O modelo MIEN pode ser facilmente aplicado ao estudo do mecanismo de neovascularização e mantém uma potencial promessa como uma plataforma de baixo custo para aplicações de triagem de medicamentos e toxicologia.

Introdução

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A neovascularização acontece em muitos processos normais e patológicos1,2,3,4, que incluem dois processos importantes em adultos, angiogênese e arteriogênese5. Além dos fatores de crescimento mais conhecidos, como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)6, estimulações mecânicas, em especial o estresse da cisalhamento induzido pelo fluxo sanguíneo, é importante na regulação da neovascularização7. Como sabemos, a magnitude e as formas de estresse de tesoura variam de forma dramática e dinâmica em diferentes partes da vasculatura, resultando em efeitos importantes sobre as células vasculares8,9,10,11,12. Estudos anteriores mostraram que o estresse da tesoura pode afetar vários aspectos das CE, incluindo alterações fenotípicas celulares, transdução de sinal, expressão genética e a comunicação com células mural13,14,15,16,17,18,19,20; portanto, regular a neovascularização21,22,23,24.

Portanto, para entender melhor a neovascularização, é importante reconstruir o processo no microambiente celular natural in vitro. Recentemente, muitos modelos foram estabelecidos para criar microestinas e fornecer controle preciso do microambiente25,26,27, aproveitando os avanços na microfabagem e tecnologia microfluida. Nesses modelos, os microimpostos podem ser gerados por chips microfluidos de hidrogel28,29, polidimtilsiloxano (PDMS)30,31,32 ou 3D bioimpressora33,34. Alguns aspectos do microambiente, tais como o estresse da cisalhamento luminal22,23,35,36, fluxo transendotelial37,38,39,40, gradiente bioquímico de fatores angiogênicos41,42, tensão/estiramento43,44,45, e co-cultivado com outros tipos de células32,46 foram imitados e controlados. Normalmente, um grande reservatório ou bomba de seringa era usado para fornecer meio perfumado. O fluxo transendotelial nesses modelos foi criado pela queda de pressão entre o reservatório e o micro-tubo22,23,38,40. No entanto, o microambiente mecânico era difícil de manter constantemente desta forma. O fluxo transendotelial aumentaria e, em seguida, excederia o nível fisiológico se uma alta taxa de fluxo com alto estresse de cisalhamento fosse usada para perfusão. Estudo anterior mostrou que, no período inicial de neovascularização, a velocidade do fluxo transendotelial é muito baixa devido às CEs intactas e membrana do porão, geralmente abaixo de 0,05 μm/s8. Enquanto isso, embora o estresse luminal do corte no sistema vascular varie muito, é relativamente alto com valores médios de 5-20 dyn/cm2,11,47. Por enquanto, a velocidade do fluxo transendotelial em trabalhos anteriores tem sido geralmente mantida entre 0,5-15 μm/s22,38,39,40, e o estresse da cisalhamento luminal foi geralmente inferior a 10 dyn/cm223. Continua sendo um assunto difícil de expor constantemente as CEs ao alto estresse luminal da cisalhamento e ao nível fisiológico do fluxo transendotelial simultaneamente. 

No presente estudo, descrevemos um modelo 3D in vitro para imitar o evento inicial de neovascularização (MIEN). Desenvolvemos um chip microfluido e um sistema de circulação automático, altamente eficiente para formar micro-tubos de perfusão e simular o processo de brotaçãode 48. Com o modelo MIEN, o microambiente das CE estimulados no período inicial de neovascularização são, em primeiro lugar, recapitulados. As CE podem ser estimuladas pelo alto estresse luminal da cisalhamento, nível fisiológico de fluxo transendotelial e distribuição de vários VEGF simultaneamente. Descrevemos os passos de estabelecer o modelo MIEN em detalhes e os pontos-chave a serem prestados atenção, na esperança de fornecer uma referência para outros pesquisadores.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparação de wafer

NOTA: Este protocolo é específico para o fotoresist negativo SU-8 2075 utilizado durante esta pesquisa.

  1. Limpe o wafer de silício 3 a 5 vezes com metanol e isopropanol em um revestimento de giro da seguinte forma: primeiro gire por 15 s a 500 rpm, e depois gire por 60 s a 3.000 rpm.
  2. Transfira o wafer de silício para uma placa de aquecimento, que é pré-aquecido a 180 °C e asse o wafer por 10 minutos.
  3. Remova o wafer de silício da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente. Limpe novamente o wafer com ar comprimido antes de prosseguir com o revestimento de giro. Aplique 4 mL do fotoresist SU-8 2075 no centro do wafer.
  4. Obtenha uma altura de característica de 70 μm no revestimento de giro da seguinte forma: primeiro gire para 12 s a 500 rpm e, em seguida, gire por 50 s a 2.100 rpm.
  5. Asse suavemente o wafer em uma placa de aquecimento da seguinte forma: primeiro asse por 8 min a 65 °C e depois asse por 20 min a 95 °C. Em seguida, remova o wafer de silício da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente antes da litografia.
  6. Coloque uma máscara fotográfica no filme fotoresistista. Exponha o wafer com um equipamento de litografia para alcançar uma exposição total de 200 mJ/cm2.
    NOTA: O fotomask contém nove conjuntos de padrões do chip, para que possa fabricar nove chips de brotação microfluídicas cada vez.
  7. Poste exponha o wafer em uma placa de aquecimento da seguinte forma: primeiro asse por 5 min a 65 °C e depois asse por 20 min a 95 °C. Em seguida, remova o wafer de silício da placa quente e esfrie-o à temperatura ambiente antes de se desenvolver.
  8. Transfira o wafer para uma placa de vidro Petri cheia de desenvolvedor SU-8 (PGMEA) para começar a desenvolver.
    ATENÇÃO: O desenvolvedor é irritante para os olhos e trato respiratório. Executar desenvolvendo-se em um capô de fumaça. Use óculos de respingo, luvas de nitrito e máscara aérea durante a operação.
  9. Agite o prato suavemente ao longo da direção do canal de fluxo e mude o desenvolvedor após 10 minutos.
  10. Repita o passo 1.9 3-5 vezes até que os padrões possam ser claramente observados.
    NOTA: Certifique-se de que não há resíduo fotoresistista no wafer, caso contrário, enxágue novamente o wafer no desenvolvedor.
  11. Transfira o wafer para uma placa de aquecimento pré-aquecido a 120 °C e asse por 30 minutos.
  12. Pipet 35 μL de silano em uma mancha de cobertura, em seguida, coloque o deslizamento de tampa junto com o wafer em um desiccator e puxe o vácuo. Selar o dessecante e deixar o wafer sob vácuo por 4h para silanizar o wafer para evitar a adesão do PDMS durante os processos de litografia macia.
    ATENÇÃO: A silane é tóxica. Para evitar o envenenamento, realize a silanização no capô da fumaça e use luvas de nitrito durante o manuseio.
  13. Solte o vácuo do desiccator. Retire o wafer silanizado em uma placa de aquecimento pré-aquecido e asse a 65 °C por 2h.
  14. Armazene o wafer em uma placa de Petri limpa até que seja necessário.

2. Fabricação de chips de broto microfluido

  1. Combine 20 g de agente base e 2 g de agente de cura (proporção 10:1) em um béquer plástico e misture-os completamente com uma haste de mistura.
  2. Coloque o béquer em um desiccador e puxe o vácuo por 1h para remover bolhas de ar na mistura PDMS.
  3. Despeje a mistura PDMS sobre o wafer na placa de Petri e coloque a placa de Petri de volta no desiccador, desgaseando por mais 30 minutos.
    NOTA: É útil usar fita adesiva de dois lados para colar o wafer na parte inferior da placa de Petri para garantir que o wafer seja mantido horizontal durante a desgaseamento e cura.
  4. Retire a placa de Petri do desiccador e coloque-a em um forno seco de 80 °C por 3h para curar.
  5. Separe cuidadosamente a camada PDMS do wafer e corte a camada para nove chips com um bisturi de acordo com o padrão.
    NOTA: Mantenha o lado do recurso para cima após a separação.
  6. Soque duas portas de injeção de hidrogel e quatro portas de injeção de mídia de cada chip usando um soco de 1 mm e uma biópsia de 3,5 mm, respectivamente.
  7. Limpe os chips perfurados com fita sem resíduos para remover resíduos PDMS. Coloque os chips e nove tampas de vidro em um limpador de plasma e trate-os com plasma de oxigênio por 30 s para formar laços covalentes na superfície.
  8. Tire as fichas e as tampas. Conecte o lado do recurso dos chips nas tampas.
  9. Coloque as lascas fixadas em um forno seco de 80 °C por 1h para intensificar a ligação.
  10. Autoclave os chips antes de usar e mantenha-os estéreis para o resto do procedimento.

3. Modificação de superfície e injeção de hidrogel

  1. Para cada chip, pipet 40 μL de 1 mg/mL poli-D-lysine (PDL) e injete-o em canais no chip a partir da porta de injeção de hidrogel.
    NOTA: Certifique-se de que o PDL preencha os canais, especialmente em canais estreitos perto das portas.
  2. Incubar os chips a 37 °C por 4h para modificar a superfície do PDMS .
  3. Pipet 200 μL de água estéril e injetá-la em canais no chip da porta de injeção de hidrogel para lavar PDL.
  4. Remova as lascas em um forno seco de 120 °C por 3h para restaurar a hidroofobidade.
  5. Coloque no gelo um tubo estéril e calcule o volume do colágeno tipo I a ser usado como a seguinte equação.
    Volume final (50 μL) x Concentração final de colágeno (3 mg/mL nesta pesquisa) / Concentração em garrafa = colágeno de volume a ser adicionado
  6. Calcule o volume de NaOH a ser usado como a seguinte equação.
    (colágeno de volume a ser adicionado) x 0,023 = volume 1 N NaOH
  7. Prepare 50 μL de hidrogel no tubo como o seguinte protocolo: adicionar 5 μL de 10x PBS, 0,5 μL de vermelho fenol, volume calculado de 1 N NaOH, 4 μL de 1 mg/mL Fibronectin, volume calculado de colágeno tipo I por sua vez. Adicione a quantidade adequada de dH2O para que o volume total atinja 50 μL. Misture bem todo o conteúdo do tubo.
    NOTA: Realize todas as operações no gelo. Use o vermelho fenol como um indicador à base de ácido para auxiliar na determinação visual do pH do hidrogel. O hidrogel final acaba laranja quando o pH é de cerca de 7,4 e a rigidez é de cerca de 15 kPa49.
  8. Pipet 2-3 μL de hidrogel para cada chip e injetá-lo lentamente no canal central de hidrogel a partir da porta de injeção de hidrogel.
  9. Incubar os chips a 37 °C por 30 min para permitir a gelação.
    NOTA: Sele os chips em uma caixa selada com 1 mL de água estéril se não forem usados imediatamente. Os chips selados podem ser armazenados a 37 °C no máximo 24 h.

4. Semeadura celular

  1. Pipet 20 μL de 125 μg/mL Fibronectin em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular.
  2. Corte uma ponta de pipeta para caber na porta do canal de cultura celular com uma tesoura.
  3. Insira a ponta da pipeta na outra porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Em seguida, pipet fora ar do canal de cultura celular para preenchê-lo com Fibronectina.
  4. Incubar os chips a 37 °C por 1h.
  5. Antes da semeadura celular, pipet 20 μL de mídia ECM em cada porta de injeção de mídia e incubar os chips a 37 °C por 30 min.
  6. Em seguida, pipet toda a mídia em todas as portas de injeção de mídia.
  7. Em seguida, pipet 5 μL de suspensão celular em uma porta de injeção de mídia do canal de cultura celular. Em seguida, as células endoteliais rapidamente se espalham por todo o canal sob pressão hidrostática diferencial.
    NOTA: Prepare a suspensão celular tentando experimentar células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) a partir do frasco de cultura e centrifificando-as a 400 x g. Em seguida, resuspende as células para 107 células/mL em um tubo.
  8. Adicione cerca de 4-6 μL de mídia ECM à outra porta para ajustar a pressão hidrostática e parar o movimento da célula.
  9. Remova os chips para a incubadora de células. Em seguida, vire os chips a cada 30 minutos até que as células endoteliais se erquem ao redor da superfície interna do canal de cultura celular 2 h depois(Figura 1).
    NOTA: Para fazer o chip de cabeça para baixo, coloque um pouco de água na parte de trás da tampa. Em seguida, o chip pode anexar à tampa da placa de Petri.
  10. Use a ponta da pipeta para remover as células anexadas nas portas de injeção com muito cuidado.
  11. Em seguida, insira quatro adaptadores luer femininos farpados nas portas de injeção de mídia e encha com mídia ECM.
    NOTA: Os adaptadores podem funcionar como reservatórios fluidos para fornecer nutrientes para as células do canal.
  12. Remova os chips para a incubadora de células. Alterar a mídia ECM em adaptadores Luer a cada 12 h.

5. Medição da permeabilidade difusa do FITC-dextran

NOTA: Para avaliar a função da barreira do micro-vaso, a permeabilidade difusa do canal de cultura CE com ou sem forro celular é avaliada.

  1. Tire um chip de brotação microfluido com hidrogel injetado.
  2. Repita as etapas 4.1-4.6.
  3. Remova todos os adaptadores Luer e descobre todas as mídias em quatro portas de injeção de mídia.
  4. Coloque o chip no microscópio de varredura a laser confocal.
  5. Pipet 5 μL de mídia de cultura contendo 500 μg/mL 40 kDa FITC-dextran para uma porta de canal de cultura celular.
    NOTA: 40 kDa FITC-dextran tem tamanho molecular semelhante ao VEGF-165 (39-45 kDa).
  6. Capture imagens a cada 3 s por 30 s. Assim, a permeabilidade difusa sem forro celular é medida.
  7. Tire o chip de brotação microfluido depois que os HUVECs forem confluentes no canal de cultura celular.
  8. Repita as etapas 5.3-5.5.
  9. Capture imagens a cada 3 s por 30 s. Assim, a permeabilidade difusa com forro celular é medida.
  10. Calcule a permeabilidade difusa ao quantificar alterações de intensidade fluorescente ao longo do tempo usando a seguinte equação modificada50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    onde, Pd é o coeficiente de permeabilidade difusivo, I1 é a intensidade média em um ponto de tempo inicial, I2 é a intensidade média após o tempo delta(Δt), Ib é a intensidade de fundo, S é a área do canal em imagens de fluorescência, e d é o intervalo total de micro-postes em imagens de fluorescência. No presente trabalho, Δt é definido como 9 s.
    NOTA: A equação atual é ligeiramente diferente da50original, devido à direção de difusão da fluorescência no chip é apenas do canal CE ao canal de hidrogel, o que não é como o tubo circular difundindo em toda a direção radial.

6. Configuração do sistema de controle microfluido

NOTA: O sistema de controle microfluido no presente estudo é composto por uma bomba de micro-seringa, uma válvula de pinça eletromagnética, um chip de armadilha de bolhas, um chip microfluido, uma bomba micro-peristáltica e um reservatório. Cada parte do sistema pode ser substituída por alternativas capazes de executar a mesma função.

  1. Fabricação de chip de armadilha de bolhas
    NOTA: O chip de armadilha de bolhas é usado para remover bolhas de ar em circulação. O chip consiste em três camadas PDMS. A camada superior é construída usando litografia macia para formar estrutura de grade como a câmara líquida. Cada canal da estrutura da grade tem 100 μm de largura. A camada inferior é um pedaço PDMS com um buraco. Entre as duas camadas, um filme PDMS fino de 100 μm é colocado.
    1. Repita o passo 1 para preparar o wafer para o chip de armadilha de bolhas.
    2. Repita as etapas 2.1-2.5 para fabricar a camada superior e a camada inferior do chip de armadilha de bolhas.
      NOTA: A máscara fotográfica da camada superior contém três conjuntos de padrões, então corte a camada PDMS para três chips de acordo com o padrão.
    3. Faça seis furos na extremidade dos canais de entrada e saída da camada superior usando um soco de biópsia de 3,5 mm.
    4. Faça dois furos na posição correspondente da camada inferior usando um soco de biópsia de 6 mm de acordo com o padrão na camada superior.
    5. Repita as etapas 2.1-2.2 para preparar 10 g de mistura PDMS e despeje-a no centro de um wafer de silício limpo.
    6. Fabricar um filme PDMS de 100 μm aplicando o seguinte protocolo de giro: girar para 15 s a 500 rpm, aumentar a velocidade de giro para 1.300 rpm e manter aqui por 45 s.
    7. Transfira o wafer para uma placa de aquecimento pré-aquecido a 180 °C e asse por 30 minutos.
    8. Limpe as camadas perfuradas com fita sem resíduos para remover resíduos PDMS. Coloque as camadas superiores e o wafer em um limpador de plasma e trate-as com plasma de oxigênio por 30 s para formar laços covalentes na superfície.
    9. Tire as camadas superiores e o wafer. Conecte o lado do recurso das camadas superiores ao filme PDMS.
    10. Corte o filme cuidadosamente ao longo da borda das camadas superiores com uma agulha.
    11. Lentamente separe o filme do wafer e vire os chips para fazer o filme ficar lado a lado após a separação.
    12. Coloque as camadas inferiores e os chips conectados em um limpador de plasma e trate-as com plasma de oxigênio para 30 s novamente.
    13. Tire camadas inferiores e chips conectados. Conecte as camadas inferiores ao filme PDMS e os chips de armadilha de bolhas são feitos.
      NOTA: Alinhe os orifícios na camada inferior com os padrões na camada superior ao anexar.
    14. Coloque as lascas em um forno seco de 80 °C por 1h para intensificar a ligação.
  2. Monte o sistema de controle microfluido
    NOTA: Todas as partes do sistema, como chip de armadilha de bolhas, reservatório, tubos e conectores são usadas após a esterilização automática, exceto equipamentos eletrônicos. Monte o sistema de controle microfluido em um banco limpo.
    1. Para montar o sistema de controle microfluido, prepare dois tubos de politetrafluoroetileno, dois tubos curtos de silicone, três tubos de silicone longos, um adaptador luer feminino farpado, um conector tipo Y e três conectores tipo L.
      NOTA: A vantagem do tubo de politetrafluoroetileno é a baixa elasticidade, portanto, menos mídia é necessária no pipeline. O tubo de silicone, em contraste, tem alta elasticidade, portanto, é adequado para a válvula de beliscão e a bomba peristáltica.
    2. Encha a seringa com 10 mL de meio ECM pré-aquecido (37 °C).
      NOTA: O pré-aquecimento ajuda o gás dissolvido de liberação média.
    3. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno à seringa por um adaptador luer fêmea farpado. Em seguida, conecte a outra extremidade do tubo de politetrafluoroetileno a um conector do tipo Y.
    4. Em seguida, conecte dois tubos de silicone longos às outras duas extremidades do conector tipo Y com um tubo que se conecta ao reservatório e o outro tubo que se conecta ao chip de armadilha de bolhas.
    5. Conecte outro tubo de silicone longo ao reservatório.
    6. Em seguida, use dois tubos curtos de silicone para conectar todos os orifícios de entrada e saída na camada superior do chip de armadilha de bolhas. Conecte um tubo de politetrafluoroetileno ao backend do chip.
    7. Em seguida, fixe a seringa na bomba de micro-seringa.
    8. Corte dois tubos de silicone longos na válvula de beliscão eletromagnética.
    9. Em seguida, troque a válvula de beliscão eletromagnética para abrir o gasoduto entre a seringa e o reservatório. Injete a mídia no reservatório usando uma bomba de micro-seringa para esgotar o ar no tubo.
    10. Em seguida, troque a válvula novamente para abrir o gasoduto entre a seringa e o chip de armadilha de bolhas. Injete a mídia para encher a câmara líquida e o tubo de encosto do chip de armadilha de bolhas.

7. Ensaio de broto endotelial

NOTA: Uma incubadora de topo de estágio montada com microscópio de contraste de fase é utilizada no presente estudo para observar o processo de brotação em tempo real. A incubadora superior do estágio pode manter a temperatura, a umidade e o controle de CO2 em estágios de microscópio, sendo bom para imagens de células vivas. Mas o equipamento não é necessário para o ensaio. Os protocolos aqui fornecidos também podem ser trabalhados em uma incubadora celular básica.

  1. Retire chips endoteleliais da incubadora celular.
  2. Em seguida, remova os adaptadores Luer no lado da cultura celular. Insira dois plugues de tubo nas portas de injeção de hidrogel do chip de brotação microfluida.
    NOTA: Os plugues podem se transformar a partir de agulhas e sua principal função é evitar que a mídia derrame.
  3. Conecte o tubo backend do chip de armadilha de bolhas a uma porta de canal de cultura celular.
    NOTA: Certifique-se de que não há bolhas no tubo antes da conexão.
  4. Insira um conector tipo T na outra porta e conecte-o a um tubo de silicone longo conectado com o reservatório.
  5. Corte o tubo de silicone longo na bomba micro-peristáltica.
  6. Em seguida, insira um filtro de ar no reservatório.
  7. Em seguida, monte o chip de brotação microfluidic para a incubadora de topo do palco.
  8. Em seguida, conecte a bomba de vácuo aos orifícios na camada inferior do chip de armadilha de bolhas com um tubo TPU.
  9. Configure o volume de circulação e a taxa de fluxo no programa personalizado, que controla a bomba de micro-seringa e a válvula de beliscão eletromagnética simultaneamente(Figura 2).
    NOTA: A taxa de fluxo através do canal de cultura celular endotelial é calculada de acordo com a equação clássica.
    τ = 6μQ / Wh2
    onde, τ é o estresse de cisalhamento (dyn/cm2), μ é viscosidade do meio (8,8 x 10-4 Pa•s), Q é a taxa de fluxo através do canal de cultura celular endotelial (ml/s), h é altura do canal (70 μm), e W é largura de canal (1.000 μm). A viscosidade do meio é medida usando um viscometro rotacional tipo cilindro coaxial. A altura e largura do canal são predeterminadas e confirmam manualmente usando um microscópio de contraste de fase na ampliação de 4x. O volume de circulação é de 5 mL e a vazão é de 85 μL/min (média de 0,2 m/s no canal de cultura celular) para 15 dyn/cm2 cisalhamento de acordo com o cálculo.
  10. Em seguida, configure a taxa de fluxo da bomba micro-peristáltica.
    NOTA: A taxa de fluxo da bomba micro-peristáltica é ligeiramente maior do que a bomba de micro-seringa, a fim de evitar que a mídia derrame.
  11. Ligue a bomba de micro-seringa. Em seguida, o sistema de controle de circulação é estabelecido.

8. Análise de dados

NOTA: Para quantificar os brotos, calculou-se a área normalizada de broto, comprimento médio do broto e maior comprimento do broto. Os resultados representam ± SEM obtidos em três estudos independentes. A significância estatística (P < 0,05) é avaliada pelo teste t-do-aluno.

  1. Fixar células e brotos no chip de brotação microfluido após experimentos com 4% de paraformaldeído em PBS por 15 minutos. Núcleos de manchas com 4′,6-diamidino-2-fenilídeos (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) por 10 min e depois mancha citoesqueleto com fálica TRITC (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) por 1h. Lave as células com PBS três vezes em intervalos de 5 minutos entre cada passo.
  2. Pegue imagens confocal dos chips em um modo de revestimento e costure-os usando software de edição de imagem.
  3. Conte o número de pixels fluorescentes de imagens de projeção Z usando um código personalizado em software de programação para quantificar a área normalizada de broto (Ver Arquivo Suplementar).
  4. Identifique e rotule manualmente cada ponta de brotos em imagens de projeção Z e calcule distâncias entre as pontas dos brotos até a membrana do porão dos CES usando outro código personalizado para quantificar o comprimento médio do broto e o maior comprimento do broto (Ver Arquivo Suplementar).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O modelo 3D in vitro para imitar o evento inicial de neovascularização (MIEN) apresentado aqui consistia em um chip de broto microfluido e um sistema de controle microfluido. O chip de broto microfluido foi otimizado a partir das publicações anteriores22,23,37,40,51,52,53. Resumidam...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Por muito tempo, a observação em tempo real da neovascularização tem sido um problema. Várias abordagens foram desenvolvidas recentemente para criar forro de vasos perfumados com CEs e adjacentes à matriz extracelular para brotar22,32,40,46,54, mas o microambiente mecânico ainda é difícil de manter constantemente. Continua sendo um sujeito difícil de imitar o ...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Research Foundation of China Grants-in-Aid (grant nº 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 e 32071311), programa nacional de pesquisa e desenvolvimento da China (grant nº 2016YFC110101 e 2016YFC1102202), o Projeto 111 (B13003) e a Fundação de Ciências Naturais de Pequim (4194079).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,25% Trypsin-EDTAGenviewGP3108
Colágeno I, cauda de ratoCorning354236
DAPISigma-AldrichD9542
Válvula de pitada eletromagnéticaTecnologia Wokun WK02-308-1/ 3
Meio de célula endotelial (ECM)Sciencell1001
Soro bovino fetal (FBS)Cada VerdeNA
FibronectinaCorning354008
FITC-dextranMiragen60842-46-8
Ambiente de programação gráficaLab VIEWNA
Software de edição de imagemPhotoShopNA
Programa de processamento de imagemImageJNA
IsopropanolSigma-Aldrich91237
Equipamento de litografiaInstituto de óptica e eletrônica, academia chinesa de ciênciasURE-2000/35
Sigma-Aldrich82762
dechumboBT101L
Bomba de micro-seringa Fluido dechumboTYD01
Plasma de oxigênioMING HENGPDC-MG
ParaformaldeídoSigma-AldrichP6148
PBS (10x)BeyotimeST448
Epóxi permanente negativo fotorresistenteMicrochemSU-8 2075
Sal de sódio vermelho de fenolSigma-AldrichP5530
Polidimetilsiloxano (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Bromidrato de poli-D-lisina (PDL)Sigma-AldrichP7886
PolitetrafluoretilenoTeflonNA
Software do programaMATLABNA
Humano recombinante VEGF-165StemImmune LLCHVG-VF5
Hidróxido de sódio (NaOH)Sigma-Aldrich1.06498
Incubadora superior de estágioTokai HitNA
SU-8 desenvolvedorMicrochemNA
Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silanoSigma-Aldrich448931
TRITC FaloidinaSigma-AldrichP5285
Metanol Bomba microperistáltica Fluido

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261(1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249(2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209(2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869(2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56(2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737(2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880(2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092(2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657(2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046(2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863(2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64(2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443(2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188(1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

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