Preparação de amostras para perfil metabólico usando imagem de espectrometria de massa MALDI

Metabólitos, intermediários ou produtos finais do metabolismo, incluindo nucleotídeos, amino ou ácidos orgânicos, lipídios, são componentes-chave para funções e processos biológicos. Metabolômica, o estudo dos metabólitos, permite a exploração de suas interações bioquímicas e a compreensão de seus papéis no contexto da pesquisa básica, translacional e clínica. Metabólitos estão fortemente associados aos fenótipos dos organismos e fornecem informações sobre atividades bioquímicas que ocorrem durante o metabolismo celular¹. Portanto, além da genômica e da proteômica, a metabolômica surgiu como uma importante ferramenta na compreensão das condições fisiológicas e patológicas. Por exemplo, a metabolômica é usada para elucidar os mecanismos por trás das drogas existentes, bem como sua tolerância. No desenvolvimento de medicamentos, o metabolismo xenobiótico é útil na avaliação da atividade ou toxicidade de metabólitos entre espécies, o que mais tarde se traduz em apoiar a medicina personalizada². Apesar da ampla aplicação da metabolômica, a imagem de metabólitos pode ser desafiadora devido à reatividade química dos metabólitos, heterogeneidade estrutural e ampla faixa de concentração³. No entanto, as concentrações de metabólitos labile, incluindo compostos de alta energia, glicose, lactato, glicóltico, pentose shunt pathway, e intermediários de ciclo TCA, fosfolipídios, neurotransmissores, compostos de sinalização, podem mudar em segundos e progredir ao longo de minutos quando enzimas teciduais estão ativas durante procedimentos de colheita de tecidos, como isquemia pós-morte na colheita cerebral^4,5,6 . Para garantir a aquisição precisa de dados metabolômicos, a preparação adequada e cuidadosa da amostra é fundamental^7,8. As plataformas estabelecidas atuais para medir metabólitos incluem RMN, ensaios enzimáticos e espectrometria de massa (incluindo cromatografia líquida e gasosa), a última das quais é discutida mais abaixo.

MALDI-MSI é uma técnica de última geração que permite a análise de amostras complexas através da detecção de espécies moleculares individuais. Maldi MSI concede o benefício de ser capaz de medir rapidamente e reprodutivelmente vários compostos moleculares em amostras biológicas. A imagem de espectrometria em massa permite ainda a produção de imagens que representam a biologia tecidual com base em seus metabólitos compostos, e o faz preservando a distribuição espacial dos metabólitos na amostra⁹. A capacidade do MALDI de detectar analitos em uma amostra sem o uso de rotulagem de anticorpos, modificações estruturais ou outros reagentes especializados, como os usados em imunossagens, juntamente com sua capacidade de monitorar centenas de moléculas dentro de um único experimento compreendem apenas algumas das vantagens que a imagem em MS concede quando se trata de perfil metabólico^{10, 11}. Além de matriz comumente utilizada como ácido dihidroxibenómico 2,5 -DIhydroxybenzoic (DHB) e 9-aminoacridina (9-AA), recentemente descoberta nova matriz N -(1-Nafthil) Dihidrocloide de Etilladiamina (NEDC), que é bem adequado para análises de vários metabólitos de baixo peso molecular, melhorou ainda mais a aplicação do MALDI MSI no perfil metabólico¹².

Apesar da ampla aplicação do MALDI MSI, o alto custo do instrumento e a complexidade do procedimento experimental impedem sua implementação mais ampla em laboratórios de pesquisa individuais. Portanto, a maioria dos estudos maldi MSI são suportados através de instalações de núcleo compartilhado. A preparação da amostra, incluindo preparação de slides e revestimento de matriz, é o passo mais crítico no MALDI MSI. No entanto, a preparação do slide é normalmente realizada no laboratório individual do pesquisador, o que cria potenciais variações na aquisição posterior do MSI maldi. Aqui, pretendemos fornecer um protocolo detalhado para a preparação amostral de amostras biológicas antes de prosseguir para as medições maldi MSI, e usar um perfil metabolômico do cérebro do rato de desenvolvimento como exemplo.

O protocolo segue as diretrizes do Centro de Pesquisa em Ciência Avançada (IACUC) da City University of New York (CUNY) Advanced Science Center (ASRC) institucional.

1. Colher o tecido

1. Prepare o barco de alumínio. Prepare um retângulo de alumínio 10cm x 20 cm, dobre no meio para fazer 10 cm quadrado de camada dupla. Rotule as informações da amostra de um lado e dobre o outro lado para formar um barco com superfície inferior de cerca de 4 cm x 4 cm.
2. Pré-covil do barco sobre o nitrogênio líquido (LN₂) em uma caixa de isopor.
   NOTA: Se o barco for muito pequeno, a amostra pode cair do barco e ficar congelada entrando em contato direto com a LN₂, o que pode resultar em fragmentação durante a crioseção.
3. Eutanize o animal por deslocamento cervical seguindo as diretrizes institucionais da IACUC, disseca imediatamente o tecido de interesse.
   1. Mantenha o intervalo entre anestesia animal e congelamento de estalos o mais curto possível, para minimizar a alteração de metabólitos durante a colheita de tecidos, especialmente os metabólitos labiais no cérebro devido à isquemia pós-morte.
      NOTA: A perfusão do animal com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) aumentará a duração da isquemia, alterando ainda mais as concentrações de metabólitos labile e exagerando os resultados artefatos. Portanto, a perfusão ou lavagem do tecido com PBS não é recomendada, a menos que a contaminação do sangue ou fluido corporal esteja mais preocupada do que a deterioração ou lavagem de metabólitos para projeto individual.
4. Coloque imediatamente o tecido no barco de alumínio flutuando sobre nitrogênio líquido, feche a tampa da caixa de isopor e congele por 2-10 min dependendo do tamanho do tecido: 2 min, 5 min, 7 min para o dia pós-natal 1 (P1), P21, cérebro de rato P60, respectivamente, e 10 min para cérebro de rato P60.
   NOTA: Não congele o tecido por tempo prolongado (por exemplo, 5 min para cérebro de rato P1) pois o excesso de congelado pode levar à fragmentação do tecido durante a criosecção.
5. Remova o barco por fórceps, dobre a folha para enrolar o tecido, transporte em gelo seco e armazene a -80 °C para uso posterior. Se seguido por secção imediata, leve as amostras em gelo seco para o criostat.
   NOTA: Para preservar melhor os metabólitos, é preferível armazenar a amostra em tecido intacto e secioná-la logo antes de proceder à imagem MALDI. O tecido pode ser armazenado em -80 °C por até 24 meses.

2. Criosection o tecido

NOTA: Use luvas o tempo todo ao manusear os slides de tinóxido de índio (ITO). Evite respirar diretamente na lâmina ou usar máscaras (opcional) para evitar a contaminação da saliva humana na seção tecidual.

1. Antes de seccionar o tecido, reúna o número desejado de lâminas de vidro revestidas de ITO compatíveis com MALDI.
2. Teste a condutividade do slide usando um conjunto de voltímetros para resistência. Rotule o lado onde uma medição de resistência é lida: este será o lado a que as seções teciduais aderem. Coloque sempre o slide em uma toalha de papel limpa para evitar contaminação.
3. Pré-esfrie os slides em um criostat definido para -20 °C.
4. Se as amostras de tecido foram removidas do -80 °C, deixe o tecido equilibrar na câmara criostat por cerca de 45-60 min, dependendo do tamanho do tecido. Se as amostras estiverem se removendo do gelo seco, equilibre-a por cerca de 30 minutos.
5. Limpe completamente o criostat com 70% de etanol. Pré-esfrie todas as ferramentas necessárias, incluindo pincel de artista de ponta fina e fórceps na câmara criostat.
6. Ajuste a temperatura da câmara criostat e da cabeça da amostra de acordo com o tipo do tecido: -14 °C para fígado, -20 °C para músculo e -25 °C para pele⁹.
7. Monte o tecido para o mandril usando tecido criográfico incorporando composto OCT, evitando OCT da região de interesse.
8. Coloque uma lâmina limpa no palco e bloqueie. Ajuste a posição do estágio e o ângulo da amostra para alcançar o ângulo de corte desejado.
   NOTA: Se diferentes tipos/genótipos de tecido forem cortados, certifique-se de reposicionar a amostra para que uma parte limpa da lâmina seja usada ou mudar para uma nova lâmina antes de cortar a próxima amostra para evitar contaminação cruzada.
9. Continue cortando até que a região de interesse (por exemplo, corpus calosum no cérebro) seja encontrada. Certifique-se de manter o palco limpo, escovando peças extras com um pincel de artista que foi equilibrado no criostat.
10. Uma vez que a região desejada é revelada, corte seções menores de 10-12 μm de espessura. Se a seção tende a se desfazer ou desmoronar facilmente, aumente a temperatura do criostat, permanecendo na faixa de -22 °C a -11 °C. Descobrimos que a temperatura de corte ideal para o tecido cerebral é de -15 °C a - 18 °C.
11. Uma vez que uma boa seção tenha sido cortada, adere ao slide ITO (opere na câmara criostat).
12. Transfira uma seção do tecido para lâminas ITO usando a ponta da escova de artista.
13. Aqueça a seção colocando um dedo sob o slide para aquecer a seção para garantir a montagem segura. A seção tecidual primeiro se transformará em transparente em 5-10 s e, em seguida, ficará opaca em cerca de 30-60 s.
14. Coloque cuidadosamente o slide de lado no criostat.
15. Repita passos para outras amostras de tecido, garantindo que cada seção do tecido seja colocada uniformemente na lâmina e esteja o mais alinhada possível.
16. Uma vez que o alvo MALDI pode conter até dois slides, coloque as seções de várias amostras da mesma coorte em um único slide ou em dois slides, para garantir que eles possam ser analisados ao mesmo tempo.
17. Quando terminar, coloque os slides da ITO em uma caixa de vácuo e transfira para um dessecante com dessecante. Seque o slide por 45-60 min.
    NOTA: Se um desiccador de vácuo não estiver disponível no laboratório, mantenha os slides abaixo de -20 °C o tempo todo para evitar a deterioração dos metabólitos.
18. Armazenamento e envio de slides: a menos que a amostra seja preparada pelas instalações do núcleo de imagem MALDI para proceder diretamente à imagem MALDI, armazene os slides a -80 °C ou envie para instalações centrais ou outros laboratórios de pesquisa MALDI em gelo seco.
19. Para melhor preservar as amostras, coloque os slides no transportador de slides, encha-os com nitrogênio (opcional), lacre com parafilm, coloque em um saco zip, que é então colocado em outro saco zip contendo dessecante. Rotule o saco zip externo.
20. Prossiga para armazenamento a -80 °C (até 6 meses) ou transporte com gelo seco adequado.

3. Preparação matricial

1. Prepare a matriz.
   NOTA: Todos os reagentes devem ser de grau HPLC.
   1. Prepare NEDC em uma concentração de 10 mg/mL. Prepare 10 mL de matriz dissolvida em um solvente de 70% de metanol (100 mg de NEDC, 7 mL de metanol, 3 mL de H₂O).
   2. Além disso, prepare um adicional de 10 mL de 70% de solução de metanol:água para lavar o sistema de pulverizador antes de preencher a matriz.
2. Uma vez que os slides estejam desidratados na etapa 2.17, coloque marcas "X" no espaço em branco do deslizamento de vidro fora das seções de tecido usando um marcador de prata de ponto ousado, e, em seguida, coloque um segundo "x" com um marcador preto de ponto fino em cima do "X" prata. O "X" preto com um contraste acentuado do fundo prateado (o prata ousado "X") mais tarde servirá como marcador fiduciário para a posterior aquisição de espectros em massa no instrumento MALDI.
3. Carregue o slide no alvo de metal de slides MALDI. Use tampa plástica e desenhe/delineie onde as amostras estão na tampa de plástico. Reservar.
4. Escaneie a imagem do slide juntamente com o alvo MALDI usando o scanner de cama plana. Os parafusos na superfície do alvo servirão como espaçador para evitar danos ou contaminação da seção tecidual pelo scanner. Visualize e escaneie a área de slides selecionada em escala de cinza de 16 bits e 2400 dpi. Salve a imagem para uso posterior no MSI MALDI.

4. Depoimento matricial

NOTA: Existem vários métodos para aplicar uma camada uniforme de matriz em tamanho de cristal fino no slide MALDI, incluindo sublimação, impressão de jato de tinta de gotícula, pulverizador de matriz automática e spray manual usando o artista airbush⁹. Usaremos o pulverizador de matriz automático como exemplo neste protocolo para sua alta reprodutibilidade.

1. Inicie: Ligue a unidade do pulverizador de matriz, tendo certeza de que a válvula está posicionada no LOAD e inicie o software do pulverizador. Verifique se o ventilador de escape está funcionando bem. Não inicie a bomba de solvente se a ventilação ativa não estiver funcionando corretamente.
2. Confirme na guia Comms que tudo está se comunicando e, em seguida, inicie a bomba de solvente a .1 mL/min, com uma pressão traseira de ~500 psi (ou 3,4 MPa).
3. Inicie o fluxo de ar comprimido para o pulverizador de matriz, colocando o tanque de nitrogênio em 30 psi. Em seguida, ajuste o regulador de pressão na parte frontal do pulverizador para 10 psi, e ajuste a temperatura do bocal do pulverizador conforme desejado.
   NOTA: Se a pressão de ar na oração for inferior a 5 psi, o bocal do pulverizador não será capaz de aquecer para proteção.
4. Com a válvula ainda na posição LOAD, use uma seringa para lavar o laço com 7 mL de 70% de metanol e, em seguida, encha o laço com 6 mL de matriz.
5. Coloque os slides do tecido nos suportes do pulverizador, gravando as duas extremidades para evitar o movimento, e para preservar uma borda livre de matriz para evitar a contaminação do grampo metálico no alvo MALDI pela matriz.
   NOTA: Testar o spray de matriz em um slide de microscópio em branco primeiro antes de proceder a slides de amostra preciosos é altamente recomendado.
6. Verifique se a vazão e a temperatura estão estáveis para começar a pulverizar.
7. Selecione o método desejado pré-testado usando slide de vidro em branco.
8. Pressione Start. Isso definirá a temperatura do bocal e ajustará a taxa de fluxo da bomba para corresponder ao método selecionado. Mude a válvula da posição Carregar para Spray e confirme clicando em Continuar.
9. Permita que o sistema seja executado, o que levará de 5 a 20 minutos por slide, dependendo do método. Mude a válvula da posição Spray para Carregar e confirme clicando em Continuar quando terminar.
10. Remova o slide(s) do pulverizador, examine o padrão de revestimento matricial sob microscópio para garantir uma camada uniforme de cristal de matriz fina.
11. Após a deposição da matriz, coloque o slide(s) no suporte MALDI metálico para uso imediato. Se houver apenas um slide de amostra, adicione outro slide em branco para preencher os dois espaços do suporte MALDI.
12. Limpe o sistema imediatamente após o uso seguindo as instruções do fabricante, para evitar o entupimento do bocal do pulverizador.
13. Depois que o slide da amostra for revestido com matriz, proceda imediatamente ao instrumento de imagem MALDI, ou envie-o com gelo seco usando a mesma preparação de saco zip duplo descrito na etapa 2.19.
    NOTA: Em circunstâncias emergenciais, como o instrumento MALDI não está disponível para uso imediato, armazene o slide revestido em condição de vácuo ou a -20 °C por até 24 horas, embora a deterioração de alguns metabólitos possa acontecer durante o armazenamento, o que não foi exaustivamente estudado.

O experimento representativo foi realizado de acordo com o fluxo de trabalho mostrado na Figura 1. Os cérebros de camundongos de desenvolvimento C57BL do pós-natal dia 1, 21, 60 (adulto) foram colhidos conforme descrito acima seguindo as diretrizes do CUNY IACUC e foram congelados por 2, 5 e 7 minutos, respectivamente, em um barco de alumínio flutuando em nitrogênio líquido. Os tecidos congelados foram criosecionados a seções de espessura de 10 μm a -15 °C para a cabeça do espécime e para a câmara. As crioseções teciduais foram então gentilmente transferidas para o lado condutor pré-resfriado de lâminas de vidro revestidas de ITO para imagens MALDI. As crioseções montadas nos slides do ITO foram dessecadas no vácuo por 45 minutos à temperatura ambiente, seguidas pela deposição matricial usando pulverizador automático de matriz. Matrix NEDC foi utilizado para detectar metabólitos, e uma solução matricial de 10 mg/mL em metanol/água (70/30, v/v) foi depositada a uma taxa de fluxo de 0,1 mL/min e uma temperatura de bico de 75 °C para 12 ciclos com secagem de 5 s entre cada ciclo. Foi utilizada uma velocidade de pulverização de 1300 mm/min, espaçamento de 2 mm, pressão gasosa N2 de 10 psi e vazão de 3 L/min e altura do bocal de 40 mm.

Os espectros de massa MALDI foram adquiridos no modo íon negativo pelo instrumento MSI tempo de voo MALDI (TOF). 0,5-1 μL de fósforo vermelho (agrupamentos pn com n = 1 - 90) emulsão em metanol foi depositado nos slides do ITO, ao lado dos tecidos montados, e usado para calibrar o instrumento na faixa de massa de 100 - 1000 m/z, aplicando curva de calibração quadrática13. Os diâmetros da mancha de laser foram focados no perfil do feixe modulado "Médio" para largura de raster de 50 μm. Espectros dentro da faixa de massa de m/z 50 a 1000 foram adquiridos a 1000 Hz para 500 shots. Os dados de espectros em massa foram registrados, e a imagem foi ainda analisada utilizando-se de um software avançado de análise de dados MALDI MSI. As imagens de íon foram geradas com a normalização do quadrado de raiz (RMS) em uma largura de lixeira de ±0,25 Da.

Os resultados da Figura 2 mostram imagens de saída do software de análise de dados MALDI MSI de espectros m/z selecionados a cada intervalo de 100 Dalton, representando claramente a utilidade para identificação de espectros de metabólitos de moléculas pequenas a lipídios de alto peso molecular. Cada linha retrata os respectivos mapas de calor de íons contendo informações espaciais e espectrais de uma determinada espécie metabólica em três tecidos coletados nos dias 1, 21 e 60 pós-natal. Para cada representante m/z, a análise da distribuição regional e das abundâncias de íons pode ser utilizada para comparar quantidades relativas de espécies correspondentes entre diferentes idades. Uma força da metodologia MALDI MSI é a capacidade de discernir a especificidade de determinadas espécies identificadas por m/z para marcos de desenvolvimento ou estruturas anatômicas específicas. Alguns metabólitos são observados para serem enriquecidos em recém-nascidos P1 (m/z 320,1), enriquecidos em adultos P60 (m/z 846,5) ou distribuídos uniformemente entre idades (m/z 480,3); outras espécies moleculares são especificamente enriquecidas em matéria cinzenta (m/z 117,1; 524,3; 765,1), matéria branca (m/z 673,4; 846,5) ou CSF/ventrículos (m/z 239,0)(Figura 2A). A distribuição espacial de metabólitos representativos incluindo hipoxantina (m/z 135,0), ácido N-Acetil-L-aspartic (m/z 174.0), ácido aracidônico (m/z 303.2), e vários lipídios como lisofosphatidylethanolamina LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(2 00:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfattidyletanolamina PE (44:6 10) (m/z 838,5), Fosphatidylinositol PI (38:4) (m/z 885,6) também são mostrados(Figura 2B).

Figura 1. Fluxo de trabalho de imagens de espectrometria de massa MALDI-time of flight (TOF). O tecido congelado é criuado em criostat e montado no slide ITO. → O slide com seções de tecido é revestido com uma fina camada de matriz usando pulverizador de matriz automático. → espectros de massa é coletado pelo instrumento MALDI-TOF MSI em um raster de 20-200um. → Os dados são analisados e as imagens são geradas usando um software avançado de análise de dados MALDI MSI. Barra de escala: 2 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Saída representativa com espectrotrais m/z selecionados da espectrometria de massa adquirida a resolução lateral de 50 μm. (A) Um mapa de calor retrata a distribuição espacial de espécies metabólitos específicas selecionadas a cada intervalo de 100 Dalton m/z através dos três marcos de desenvolvimento identificados em P1, P21 e P60. (B) Distribuição espacial de metabólitos representativos em P1, P21 e P60, incluindo: hipoxantina, ácido N-Acetil-L-aspartic, ácido aracidonico e diferentes espécies lipídicas como lisofosofosphatidylethanolamina (LPE), fosfatidylethanolamina (PE), Fosfatidylinositol (PI). Barra de escala, 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.