Modelagem in vitro para doenças neurológicas usando conversão direta de fibroblastos para células progenitoras neuronais e diferenciação em astrócitos

Resumo

Descrevemos um protocolo para reprogramar fibroblastos derivados da pele humana em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs), e sua subsequente diferenciação em Astrocitos induzidos (iAs). Este método leva a uma geração rápida e reprodutível de iNPCs e iAs em grandes quantidades.

Resumo

Pesquisas sobre distúrbios neurológicos se concentram principalmente no impacto dos neurônios nos mecanismos da doença. A disponibilidade limitada de modelos animais impacta severamente o estudo de contribuições específicas do tipo celular para a doença. Além disso, os modelos animais geralmente não refletem a variabilidade em mutações e cursos de doenças vistos em pacientes humanos. Métodos de reprogramação para geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) revolucionaram pesquisas específicas do paciente e criaram ferramentas valiosas para estudar mecanismos de doença. No entanto, a tecnologia iPSC tem desvantagens como tempo, comprometimento trabalhista, seletividade clonal e perda de marcadores epigenéticos. Modificações recentes desses métodos permitem uma geração mais direta de linhagens celulares ou tipos de células específicas, contornando o isolamento clonal ou um estado de células-tronco pluripotentes. Desenvolvemos um método de conversão direta rápida para gerar células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) a partir de fibroblastos de pele utilizando vetores retrovirais em combinação com a mídia neuralizadora. Os iNPCs podem ser diferenciados em neurônios (iNs) oligodendrocytes (iOs) e astrócitos (iAs). A produção de iAs facilita testes rápidos de medicamentos e mecanismos de doença, pois a diferenciação dos iNPCs leva apenas 5 dias. Além disso, as IAs são fáceis de trabalhar e são geradas em populações puras em grande número. Desenvolvemos um ensaio de cocultura altamente reprodutível usando neurônios GFP+ do camundongo e iAs derivados do paciente para avaliar estratégias terapêuticas potenciais para numerosas doenças neurológicas e neurodegenerativas. É importante ressaltar que os ensaios iA são escaláveis para o formato de 384 poços facilitando a avaliação de múltiplas moléculas pequenas em uma placa. Essa abordagem permite uma avaliação terapêutica simultânea de múltiplas linhas celulares de pacientes com diversos antecedentes genéticos. Fácil produção e armazenamento de iAs e capacidade de triagem de múltiplos compostos em um ensaio torna essa metodologia adaptável para medicina personalizada.

Introdução

A compreensão dos mecanismos subjacentes à doença é fundamental para doenças neurológicas, pois auxilia no desenvolvimento de potenciais estratégias terapêuticas. Embora os modelos animais tenham sido historicamente o padrão-ouro para pesquisar doenças do sistema nervoso, a tradução direta de terapias potenciais em um cenário clínico muitas vezes mostra sucesso limitado^1,2,3. As razões para a falta de tradução são a falta de variabilidade de antecedentes genéticos e mutações em camundongos, exibição incompleta de fenótipos da doença e variação na sensibilidade ou dosagem de drogas em pacientes humanos que não são bem retratados em cepas de camundongos ingenuos. Além disso, para muitas doenças neurológicas raras, não há ou poucos modelos animais disponíveis. Estudar mecanismos de doença diretamente em tipos relevantes de células humanas poderia facilitar a pesquisa e melhorar a tradução para a clínica. Para os distúrbios do CNS, as células humanas primárias são difíceis de recuperar e representam uma fonte muito limitada, pois as biópsias são invasivas ou só podem ser recuperadas após a morte no estágio final da doença. Nos últimos 15 anos, o desenvolvimento da tecnologia de reprogramação celular expandiu rapidamente a capacidade de modelar doenças neurológicas e neurodegenerativas humanas in vitro.

Os métodos tradicionais de reprogramação celular envolvem a reprogramação de fibroblastos ou outros tipos de células em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) capazes de se diferenciar em tipos celulares das três camadas germinativas⁴. Takahashi e Yamanaka foram os primeiros a mostrar que a reexpressão de quatro fatores de transcrição de células-tronco é suficiente para redirecionar células somáticas para se tornarem iPSCs⁵. Os iPSCs podem então ser ainda mais diferenciados em tipos de células específicas. No entanto, a desvantagem desse processo é que é trabalhoso e demorado para gerar e isolar clones de células-tronco estáveis. Mutações somáticas ou aberrancies específicas da célula-mãe também são mantidas no clone de células-tronco e podem impactar os resultados do estudo⁶. Além disso, evidências crescentes sugerem que o processo de reprogramação para células-tronco apaga mudanças epigenéticas valiosas que poderiam influenciar os mecanismos de doenças celulares^4,7,8. Nos últimos anos, pesquisadores se concentraram em métodos de reprogramação modificados permitindo uma geração mais direta de diferentes tipos de células ao contornar o estado de células-tronco pluripotentes^9,10,11,12 (revisado em ^13,14). Avanços iniciais revelaram reprogramação combinatória in vitro de fibroblastos para cardiomiócitos¹⁵, neurônios¹⁶ e hepatócitos¹⁷ por expressão ectópica de múltiplos fatores de transcrição específicos da linhagem ou microRNAs¹⁸. Isso foi seguido por estudos diretamente reprogramando células para modelar distúrbios neurológicos^19,20. Como mencionado acima, tais protocolos de reprogramação direta ou conversão têm vantagens potenciais sobre os protocolos clássicos do iPSC, incluindo velocidade e a ablação da etapa de isolamento clonal. Além disso, as evidências sugerem que esses protocolos permitem manter uma quantidade maior de informações epigenéticas relacionadas à idade do paciente e, provavelmente, o mesmo vale para os marcadores relevantes da doença^7,8.

Até o momento, a maioria das pesquisas in vitro sobre distúrbios neurológicos tem sido focada principalmente em neurônios. No entanto, é sabido que outros tipos de células como astrócitos, microglia e oligodenrócitos desempenham um papel crítico na patologia da doença e na progressão de doenças neurodegenerativas como doença de Alzheimer (DA), Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), Doença de Parkinson (DP), Doença de Huntington (DP), Esclerose Múltipla (EM) e outras patologias neurológicas como síndrome de Rett (TR), distúrbios do sono, vício, epilepsia, distúrbios de armazenamento lyosomal, depressão, enxaqueca e dor patológica^{21,22,23,24,25,26}. Os astrócitos são o tipo celular mais abundante no sistema nervoso central (SNC) e, até recentemente, têm sido amplamente negligenciados do ponto de vista patológico⁷. Eles agora são conhecidos por terem um papel crítico no apoio a quase todas as funções homeostáticas do CNS saudável. Além disso, é evidente que eles têm um importante impacto patológico e são muito valiosos na compreensão do mecanismo da doença e na avaliação das estratégias terapêuticas¹⁹.

Na descrição atual, detalhamos um protocolo de conversão direta de fibroblastos de pacientes humanos em células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs) usando vetores retrovirais expressando os fatores de reprogramação de Yamanaka (Klf4, Oct3/4, Sox2 e c-Myc) e posterior exposição à mídia neuralizadora. Estudos anteriores têm usado diferentes combinações de fatores transcricionais para reprogramação direta para células neurais (revisados em ¹⁴), mas os fatores utilizados no protocolo descrito estão amplamente disponíveis tanto como plasmídeos para a produção interna de vetores virais, ou como comercialmente disponíveis prontos para ir kits de reprogramação viral. Os iNPCs resultantes podem ser ainda mais diferenciados em neurônios induzidos (iNs)^27,oligodendrocytes (iOs)²⁴ e astrócitos (iAS)¹⁹ para estudar seu papel em doenças neurológicas. Nosso protocolo não envolve a geração demorada de iPSCs que a maioria dos protocolos disponíveis utilizam para derivação de astrócitos humanos²⁸. Aproximadamente 98% a 100% dos iNPCs diretamente reprogramados podem se diferenciar em astrócitos²⁹ positivos da GFAP, em comparação com apenas 2% usando método de conversão direta de fibroblastos para astrócitos³⁰. Recentemente, um estudo transcriômico comparativo usando nosso método de reprogramação descrito mostrou que os iNPCs reprogramados de fibroblastos doadores podem reter características de envelhecimento em nível transcricional e funcional semelhantes aos astrócitos pós-morte e astrócitos primários²⁹. Assim, este protocolo de conversão é uma poderosa ferramenta para investigar mecanismos de doença e avaliar novas abordagens terapêuticas para distúrbios neurodegenerativos e neurológicos relacionados à idade.

Aqui descrevemos o protocolo utilizado para gerar iNPCs e maior diferenciação em iAs, que são os mais adequados para ensaios de triagem molecular de grande escala. Mecanismos de doenças e testes medicamentosos com iAs podem ser feitos usando diferentes metodologias, como co-culturas com neurônios ou análise metabólica e bioquímica. A vantagem deste sistema é a velocidade e facilidade de manutenção dessas linhas celulares em comparação com iPSCs. Além disso, os iNPCs podem ser congelados em pequenas porções para diferenciação de iAs, o que facilita o teste de drogas em condições constantes por longos períodos de tempo. No geral, a comparação de números amostrais maiores torna-se possível dessa forma que abre a porta para avaliar o potencial terapêutico dos compostos em uma população maior e mais representativa de pacientes.

Protocolo

mídia	Reagente	Quantidade para misturar	Concentração final (%)
Mídia fibroblasto	DMEM, alta glicose, GlutaMAX	500 mL	89
	Soro bovino fetal	50 mL	10
	Antibiótico-antimíctico	5 mL	1
Mídia base	DMEM/F12 + Glutamax	500 mL	97
	N-2	5 mL	1
	B-27	5 mL	1
	Antibiótico-antimíctico	5 mL	1
Mídia de conversão	Mídia base	50 mL	99.9
	FGF	1 μL	0.02 (20 ng/mL)
	EGF	1 μL	0.02 (20 ng/mL)
	heparina	50 μL	0.1 (5 μg/mL)
Mídia neural progenitora celular (NPC)	DMEM/F12 + Glutamax	500 mL	96.9
	N-2	5 mL	1
	B-27	5 mL	1
	Antibiótico-antimíctico	5 mL	1
	FGF	10 uL	0.002
Mídia de Astrócito	DMEM, alta glicose, GlutaMAX	500 mL	89
	Soro bovino fetal	50 mL	10
	Antibiótico-antimíctico	5 mL	1
	N-2	1 mL	0.2
A mídia deve ser filtrada após a mistura de todos os componentes. Os meios de conversão (com fatores) devem ser preparados frescos a cada semana.

Mesa 1. Receitas de mídia para todos os tipos de células incluídas no protocolo. As mídias devem ser filtradas após a mistura de todos os componentes com um sistema de filtragem de vácuo estéril para grandes volumes ou seringa e filtros de seringa de 0,2 um. Os meios de conversão (com fatores) devem ser preparados frescos a cada semana.

1. Conversão direta de fibroblastos humanos adultos para células progenitoras neuronais

NOTA: Um cronograma esquemático deste protocolo pode ser revisto em Meyer (2014)¹⁹.

1. Use fibroblastos de pele humana primários que podem ser obtidos a partir de bancos celulares ou biópsias de pele³¹. Células de cultura a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido de CO₂ de 5%. Células de passagem para pelo menos 1-2 passagens após o descongelamento antes do uso no experimento. Uma vez que as células estejam prontas, cubra um poço de uma placa de 6 poços com fibronectina humana (1:200 diluída em PBS) em temperatura ambiente por 15-20 min.
2. Quando as células estiverem prontas para serem banhadas, remova a fibronectina do prato e adicione imediatamente a solução celular ou 2 mL de mídia fibroblasto(Tabela 1) - não deixe o prato secar antes de adicionar mídia. Dependendo da rapidez com que as células crescem, a placa 150.000 (crescimento rápido) - 200.000 (crescimento lento) fibroblastos em dois poços de uma placa de fibronectina humana revestida de 6 poços cada.
   NOTA: As células devem ser cerca de 70% confluentes para transdução viral para poder mantê-las na mesma placa por mais alguns dias após a transdução. Pode ser benéfico para a semente em duas densidades diferentes, a fim de ter uma escolha no dia seguinte para conversão.
3. No dia seguinte à semeadura, verifique os fibroblastos sob o microscópio e verifique a densidade celular (entre 70-85%) e até semeando em todo o poço para resultados ótimos.
4. Transduça um bem com todos os quatro vetores retrovirais (Oct3/4, Klf4, Sox2 e c-Myc) - use uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 para crescimento rápido ou 15 para fibroblastos de crescimento lento (a eficiência da transdução deve exceder 70% ou mais células positivas para cada vetor). Adicione mistura regular de fibroblasto médio a viral a um volume total de 1 mL por poço e incubar durante a noite a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido co₂ de 5%. Deixe o segundo poço não tratado e devolva as células à incubadora de cultura tecidual.
   NOTA: Vetores retrovirais podem ser comprados por um fornecedor ou fabricados internamente, protocolos estão disponíveis online³².
5. No dia seguinte à transdução, lave as células 1x com PBS e adicione 1 mL de meio de fibroblasto fresco.
6. No dia seguinte, mude de meio para meio de conversão. Lave as células 1x com PBS para se livrar do meio do fibroblasto residual e, em seguida, adicione 1 mL de meio de conversão. Mude a mídia do poço não tratado para mídia de conversão também.
   NOTA: Algumas alterações morfológicas podem ser observadas até mesmo alterando a mídia nos fibroblastos que não receberam tratamento vetorial retroviral, assim ter um poço não tratado (opcional) será útil na determinação dos efeitos dos vetores virais. As células devem começar a mudar a morfologia 2-4 dias após a mudança para a mídia de conversão.
7. Observe células sob o microscópio e observe mudanças na morfologia(Figura 1). A mídia celular deve ser substituída diariamente durante todo o processo de conversão (1-2 mL de mídia de conversão, Tabela 1) e para a cultura subsequente do iNPC. Mude o meio removendo cuidadosamente 70% do meio do poço, certificando-se de que as células permaneçam cobertas nos 30% restantes da mídia.
   NOTA: A mídia com fatores de crescimento precisa ser consumida dentro de 1 semana de preparação.
   1. Continue observando células e alterando mídia diariamente (1-2 mL de mídia de conversão).
   2. Algumas linhas celulares começam a formar formações redondas elevadas soltas crescendo em esferas como a bola ou esferas neuronais soltas(Figura Suplementar 1 e ^19,33). Tome cuidado para não desapegar essas células. Se as bolas se soltarem, elas podem ser recolhidas e re-banhadas em um novo poço revestido de fibronectina de uma placa de 6 poços.
      NOTA: Se forem expandidas por conta própria, as células terão uma diversidade reduzida em comparação com a placa inicial e podem representar uma linha celular distintamente diferente. Recomendamos combinar essas células com o resto das células convertidas na próxima rodada de divisão.
8. Após cerca de 5-6 dias em mídia de conversão (até 12 dias para linhas celulares difíceis) ou quando as células se tornam muito densas, passá-las 1:2 ou no máximo 1:3.
   NOTA: É muito importante manter as células em alta densidade durante todo o processo de conversão.

2. Processo de conversão e cisão do INPC

1. Aqueça a solução de descolamento celular (por exemplo, Accutase) e cubra um número apropriado de poços de um 6-well com fibronectina (1:200 em PBS, 1 mL de volume de revestimento) por 15-20 min à temperatura ambiente. O revestimento da fibronectina pode ser mais longo sem impacto negativo, mas deve-se tomar cuidado para não encurtar o tempo de revestimento.
2. Lave as células cuidadosamente com PBS sem separar nenhuma célula (use a parede do poço para aplicar PBS suavemente nas células). Remova cuidadosamente o PBS com pipetas ou por aspiração.
3. Adicione 0,5 mL de solução de descolamento celular e incubar 2-3 min a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido. Verifique sob o microscópio para verificar se a maioria das células se desprendeu. Se todas as células tiverem saído, adicione 2 mL de mídia de conversão fresca e pipeta suavemente para cima e para baixo 2-3 vezes para dissociar aglomerados (se necessário).
4. Colete as células em um tubo de 15 mL e adicione 3 mL adicionais de mídia para diluir ainda mais a solução de descolamento celular. Lave o poço com a mídia extra primeiro para garantir que todas as células tenham sido coletadas.
5. Centrífuga por 4 min a 200 x g em temperatura ambiente.
   NOTA: As células de conversão ou iNPCs são extremamente sensíveis à presença de solução de descolamento celular na mídia. É absolutamente necessário remover a enzima residual por centrifugação e retirada de supernasce.
6. Remova o supernascedor da pelota celular e resuspense as células em 1 mL de meio fresco. Pipeta suavemente para cima e para baixo 2-3 vezes para resolver aglomerados celulares. Remova a fibronectina de 6 poços revestidos e adicione 1 mL de mídia fresca a cada poço imediatamente (não deixe a fibronectina secar). Para uma relação dividida de 1:2, adicione 0,5 mL da suspensão celular em um poço e o outro 0,5 mL em um segundo poço.
   1. Células de cultura a 37 °C em uma incubadora de cultura tecidual.
7. Distribua as células agitando suavemente o 6-well na direção norte-sudeste-oeste (não circular) e coloque na incubadora de cultura tecidual.
8. Observe as células sob o microscópio no dia seguinte e mude a mídia (1-2 mL). Mude a mídia todos os dias até que as células estejam prontas para serem divididas novamente.
   NOTA: Neste ponto, a proliferação celular deve começar a acelerar, e as células devem estar prontas para uma segunda divisão dentro de 2-3 dias (4 dias para linhas de crescimento muito lenta).
   1. Nesta nova divisão, semente um poço de células em mídia de conversão e o outro poço em mídia NPC contendo apenas FGF em maior concentração sem EGF/heparina (Tabela 1).
      NOTA: Algumas linhas de celular atingem um estado estagnado em mídia de conversão após cerca de 10 dias e a mudança para a mídia NPC pode ajudar no crescimento celular. Além disso, os NPCs têm uma forma mais específica e menor, quando cultivadas em mídia NPC¹⁹. Neste ponto, os iNPCs estão prontos para diferenciação e uso posterior.
9. Continue mudando de mídia (1-2 mL) dos iNPCs diariamente.
   1. Expanda os NPCs em pratos de 10 cm combinando dois ou três poços confluentes de um poço de 6 poços. O volume de mídia para pratos de 10 cm é tipicamente de 12-15 mL.
   2. Na divisão seguinte, expanda ainda mais essas células para três ou quatro pratos de 10 cm (12-15 mL de mídia) para gerações de grande número de estoques celulares. Os pratos de 10 cm geralmente são divididos em 1:3 ou 1:4 a cada 3-4 dias, dependendo da taxa de proliferação.

3. Geração de astrócitos induzidos de NPCs

1. Para fazer astrócitos de iNPCs frescos, as iNPCs de sementes (em placas revestidas de fibronectina de 10 cm) diretamente em meio de astrócito de 10 mL(Tabela 1) para que estejam em torno de 10% de confluência no dia seguinte. Células de cultura a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido de CO₂ de 5%.
   NOTA: A densidade de semeadura recomendada é geralmente de 50 μL da ressuspensão celular de um prato de 10 cm de NPCs, desde que sejam diluídos a um volume final com base em sua razão de divisão (por exemplo, 3 mL para uma divisão de 1:3, 4 mL para uma divisão de 1:4, etc.).
2. Alterar o meio (mídia de astrócito de 10 mL) dos iAs três dias após o revestimento. Mantenha as células diferenciando por 5-7 dias.
   NOTA: as iAs não toleram bem várias passagens, portanto é melhor fazer astrócitos frescos toda vez que você dividir os NPCs.
3. Para a semente para experimentação, divida os astrócitos usando a solução de trippsina ou descolamento celular, conforme descrito nas etapas 2.1-2.7. As densidades de semeadura recomendadas estão incluídas na Tabela 2.

Tipo de placa	Astrócitos por Poço
384-well	2500
96-well	10000
24-well	40000
6-bem	150000

Mesa 2. Densidade de semeadura recomendada de iAs por área de placa. Número típico de iAs semeadas para gerar uma monocamada nas placas de cultura tecidual mais comuns.

4. Preparar e descongelar porções para diferenciação de astrócitos dos estoques de NPC congelados (alternativa ao passo 3)

NOTA: Como alternativa à manutenção de iNPCs na cultura, os astrócitos também podem ser produzidos diretamente a partir de um estoque congelado. Para isso, os iNPCs são congelados em porções menores. A Tabela 3 mostra volumes sugeridos de congelamento e descongelamento para que as porções sejam descongeladas em um prato de 10 cm contendo 10 mL de mídia astrocito.

Tamanho da porção	Suspensão celular (μL)	Mídia de congelamento (μL)	Volume total (μL)	Descongelamentos em
4x	400	400	800	Dois pratos de 10 cm
2x	200	200	400	Um prato de 10 cm

Mesa 3. Instruções sobre como parcelar o iNPC para gerar iAs. Proporção de suspensão do INPC e congelamento de mídia para gerar porções. Observe que a concentração final de DMSO é de 10% quando a suspensão celular é misturada com mídia de congelamento.

1. Para fazer astrócitos a partir de estoques congelados iNPC, remova o frasco de estoque de porção do tanque de armazenamento de nitrogênio líquido e descongele rapidamente a 37 °C. Assim que as células são descongeladas, a solução de células pipetas em um tubo de 15 mL contendo 5 mL de mídia de astrócito.
2. Centrifugar por 4 min a 200 x g e temperatura ambiente. Remova o supernatante e resuspend em 1 mL de meio astrócito fresco.
3. Adicione 9 mL de meio de astrócito fresco a um prato revestido de fibronectina de 10 cm e adicione 1 mL de solução celular. Distribuindo suavemente células em movimento norte-sudeste-oeste. Células de cultura a 37 °C em uma incubadora de cultura de tecido de CO₂ de 5%.

Resultados

Este protocolo permite a geração rápida e fácil de iNPCs diretamente de fibroblastos de pele humana usando retrovírus contendo os fatores Yamanaka. Este método permite contornar o estado das células-tronco e a necessidade de seleção clonal, evitando assim a variação clonal. Passos importantes a serem mantidos em mente enquanto as células estão passando pelo processo de conversão são a densidade de semeadura do fibroblasto, o pH da mídia e manter as células em uma confluência ideal. Exemplos de alterações ideais de confluência e morfologia durante o processo de conversão podem ser encontrados na Figura 1.

Figura 1. Imagens representativas do processo de conversão após a adição da mistura retroviral de fatores Yamanaka. Os fibroblastos foram semeados e transduzidos 24 horas depois com fatores yamanaka. Dois dias após o vírus (DPV), a mídia foi alterada para mídia de conversão. As células foram cultivadas em mídia de conversão até estarem prontas para a passagem (13 DPV). As células foram semeadas após a passagem para atingir 80% de confluência no dia seguinte (14 DPV). As passagens subsequentes mantiveram essa densidade até que as células progenitoras neuronais comecem a se dividir rapidamente. A barra de escala é de 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Após o processo de conversão ser concluído, os NPCs mostrarão expressão fortemente reduzida ou nenhuma expressão de marcadores fibroblastos e morfologia, e expressarão marcadores celulares específicos NPC(Figura 2). Além disso, eles também podem ser usados para gerar diferentes linhas celulares, como iNs, iOs e iAs.

Figura 2. Células que se submetem ao processo de conversão expressam marcadores específicos de células. Os fibroblastos do paciente (A), as células progenitoras neuronais induzidas (iNPCs (B) e as células de Astrocitos (iAs (C) induzidas foram semeadas em tampas de vidro em uma placa tratada de 24 poços de cultura tecidual. As células foram imunos detidas para: marcadores celulares específicos do fibroblasto (A), Vimentin (verde) e TE7 (vermelho), marcador de células específicas do INPC (B), Nestin (vermelho) e marcador de células iAs (C) GFAP (roxo) e marcador iNPC Nestin (verde). A barra de escala é de 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em nossa experiência, as IAs, em particular, são muito valiosas para testes de mecanismos de drogas e doenças, pois podem ser geradas em populações puras (98% ou mais células positivas GFAP²⁹) em grandes números reprodutíveis. IAs podem ser diferenciadas dos iNPCs tomando uma pequena alíquota de células durante a divisão ou uma porção de iNPC previamente congelada e emplacando diretamente em mídia de astrócito. Considerações importantes durante este processo são a manutenção da densidade inicial de semeadura dos iNPCs baixa(Figura 3 e Figura 4),uma vez que uma alta densidade tem sido demonstrada para dificultar o processo de diferenciação (Figura 4) e prestar atenção adicional ao pH de mídia, pois a acidificação pode ativar até mesmo astrócitos saudáveis.

Figura 3. Imagens representativas do processo de geração de iAs a partir de iNPCs. INPCs são semeados em mídia astrocito (Tabela 1) com baixa densidade de semeadura. Uma boa densidade de semeadura é de cerca de 10% no primeiro dia de pós-semeadura (DPS) (esquerda); no entanto, essa densidade pode ser ajustada de acordo com a taxa de crescimento das células. A morfologia típica das iAs pode ser observada após 5 DPS (meio). Em alguns casos, pode-se observar morfologia aberrante aberrante, com extensões longas e espetadas. Esta mudança é indicativa de ativação de astrócitos e pode ser secundária ao estado da doença ou técnicas de cultivo incorretas (à direita). A barra de escala é de 200 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. A densidade de semeadura do iNPC afeta a eficiência de diferenciação das IAs. As linhas de controle do iNPC foram semeadas em baixa (A) e alta densidade (B) na mídia astrócito para demonstrar efeitos da densidade de semeadura na diferenciação. 5 DPS, a linha de baixa densidade expressa marcadores específicos de astrócito, enquanto a linha de alta densidade mostra uma mistura de marcadores iNPC e iAs com uma morfologia marcada como iNPC. A barra de escala é de 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar 1. Números adicionais do processo de conversão após a adição da mistura retroviral de fatores Yamanaka. Imagens do processo de conversão em 12 DPV (1 dia antes da passagem) e 19 DPV (6 dias após a passagem). Note a diferença na morfologia entre as células antes e depois da passagem, em 12 células DPV têm uma morfologia estrutura semelhante à bola. Após uma passagem e vários dias em mídia de conversão (tabela 1) as células começam a exibir uma morfologia semelhante ao NPC. Barra de escala é de 200 μm. Por favor clique aqui para baixar este Arquivo.

Discussão

Em resumo, a conversão direta é um método rápido e fácil para gerar células progenitoras neuronais induzidas a partir de fibroblastos de pele do paciente. Este método é vantajoso devido à sua velocidade, bem como ao grande número de células geradas que são fáceis de manter. Além disso, evidências crescentes sugerem que os métodos de reprogramação direta removem menos marcas epigenéticas em comparação com a tecnologia clássica de reprogramação do iPSC, deixando assim o ambiente da doença mais intacto^4,7,8. A diferenciação dos iNPCs aos astrócitos é muito direta e altamente reprodutível mesmo entre múltiplos laboratórios independentes^19,29,33. INPCs podem ser congelados em pequenas porções e descongelados diretamente para fins de diferenciação, o que ajuda a reduzir a variação entre os experimentos, uma vez que os números de passagem podem ser mantidos semelhantes. Os astrócitos desempenham um papel crucial na progressão da doença em muitas doenças neurológicas e, portanto, são um tipo celular interessante para trabalhar. Os astrócitos podem ser usados para estudos mecanicistas, estudos metabólicos ou ensaios de testes de drogas e geralmente são cultivados como monocamadas. Além disso, os astrócitos podem ser combinados em sistemas de co-cultura com neurônios de camundongos ou humanos para avaliar o impacto dos astrócitos na sobrevivência neuronal e na morfologia, ambos bons legões para testes de drogas³⁴.

Para usar com sucesso este protocolo, alguns pontos e possíveis limitações precisam ser mantidos em mente. Os fibroblastos de pele humana, por exemplo, variam muito em sua taxa de divisão celular, bem como resposta a vetores virais. Como estas não são linhas celulares padronizadas, elas são tão variáveis quanto a própria humanidade, cada linha é diferente. Quanto a muitos métodos de reprogramação, é mais fácil reprogramar fibroblastos que têm uma taxa de divisão celular moderada a rápida versus células que mal estão se replicando. A taxa de replicação pode ser impactada pela qualidade da biópsia da pele e pelo próprio processamento, pelo número de passagem dos fibroblastos, bem como pelo manuseio. Ao trabalhar com fibroblastos de pele primários, é importante não deixar que as células fiquem muito densas para evitar a indução da senescência. Se os fibroblastos não crescem bem, é melhor tentar um novo estoque ou uma passagem mais baixa, embora em alguns casos, a doença em si também possa desempenhar um papel. Às vezes, a divisão celular pode ser melhorada usando 15% ou 20% de FBS na mídia do fibroblasto em comparação com o padrão de 10%.

A qualidade da reprogramação dos vetores virais é de grande importância para o sucesso. Em nossas mãos, os vetores retrovirais foram mais eficientes em comparação com vetores lentivirais ou outros vírus não integrados; no entanto, isso pode depender da qualidade e pureza do vetor viral. Kits de vetores retrovirais comerciais geralmente especificam a concentração de vetores virais e, muitas vezes, também uma multiplicidade de infecção para uma determinada linha celular. É importante ter em mente que os fibroblastos primários diferem da linha celular usada pelas empresas para determinar a absorção de vetores virais. Além disso, mesmo ao encomendar o mesmo kit comercial, a variação entre os lotes é comum. Além disso, a absorção de vetores virais também varia entre as linhas celulares do fibroblasto. Algumas linhas poderiam ser mais sensíveis e, portanto, células transduzidas poderiam morrer, enquanto outras linhas celulares poderiam ser mais resistentes à absorção viral. Assim, determinar a eficiência de transdução para uma determinada linha celular pode ser importante especialmente se a linha celular estiver crescendo lentamente ou tentativas de conversão anteriores falharam. Em nossas mãos, a melhor maneira de avaliar quanto de um vetor retroviral específico é necessário para a conversão é realizar uma coloração imunofluorescente com várias diluições do vetor viral. O número de células expressando o transgene para cada vetor pode então ser contado, com o objetivo de uma eficiência de transdução de 70% ou mais. Em nossa experiência, MOIs semelhantes podem ser usados para a maioria das linhas de celular, no entanto, o MOI pode ser ajustado se necessário.

Durante o processo de conversão, é fundamental não dividir as células muito cedo. O tempo até que as células estejam prontas para serem divididas depende de múltiplos fatores, incluindo a linha celular primária e suas características, a qualidade do vetor viral utilizado e a qualidade da mídia. É importante ressaltar que a taxa de sucesso da conversão é muito maior quando as células são mantidas em alta densidade. Mesmo que as células comecem a mudar a morfologia, é melhor deixar as células no primeiro bem mais tempo do que dividi-las prematuramente. Se a divisão ocorrer muito cedo, a conversão pode parar em seu progresso e levar as células a se diferenciarem de volta à forma e comportamento semelhantes ao fibroblasto. Além disso, diluí-los muito cedo pode resultar em corpos celulares mais alongados em comparação com os corpos de células pequenas e compactas dos NPCs observados anteriormente. Assim, as primeiras divisões devem ser sempre conservadoras; é melhor manter as células muito densas com uma divisão 1:1 ou 1:2 em comparação com diluí-las demais. Espera-se que alguma morte celular seja esperada após a divisão inicial. Note-se que as células sempre parecem piores (mais planas) no primeiro dia após a separação, o que é normal. Os melhores julgamentos sobre a forma celular devem ser feitos 2-3 dias depois. É importante ressaltar que a qualidade dos fatores de crescimento e componentes da mídia também é crucial. É importante preparar pequenas quantidades de mídia contendo fatores de crescimento para que a mídia totalmente preparada seja usada apenas por 5-7 dias no máximo. Não mantenha a mídia em temperatura ambiente ou 37°C por longos períodos de tempo. Use rapidamente e leve à geladeira assim que a mudança de mídia for realizada. Além disso, manter o volume de mídia baixo em 1 mL em vez de 2 mL pode ajudar especialmente para linhas celulares que são mais resistentes à conversão. Se as células consumirem a mídia rapidamente, o que pode ser observado por uma mudança na forma de cor da mídia de vermelho para amarelo (taxa de acidificação), ajuste o volume da mídia para até 2 mL. O consumo rápido de mídia é um sinal positivo e frequentemente observado em estágios posteriores de conversão, juntamente com o aumento da proliferação.

Os NPCs também são muito sensíveis à presença de accutase na mídia e é muito importante manter o tempo de incubação de accutase curto. Recomendamos um período de incubação de 2-4 minutos, verificar células frequentemente sob o microscópio para ver quando elas se separaram. É essencial centrifugar as células depois de se dividir para remover a mistura de enzimas da mídia. Também é importante manter o número de passagem em mente, pois as linhas celulares podem mudar após a cultura estendida levando à alteração dos perfis de expressão. Assim, é importante congelar muitos estoques de células em passagens iniciais. As células devem ser congeladas em mídia DMSO de 10% e 90% NPC e armazenadas a longo prazo em nitrogênio líquido. Devido à falta de soro nesta mídia, é fundamental garantir um congelamento lento usando câmaras de congelamento e uma vez congelado durante a noite, transferência imediata para nitrogênio líquido. Embora nenhuma seleção clonal seja realizada neste protocolo, é possível que a cultura e a passagem estendidas levem à seleção natural de uma população celular inicial com crescimento e taxa de sobrevivência favoráveis. Portanto, é importante manter o número de passagem e o manuseio em mente ao realizar experimentos. Preferimos usar passagens mais baixas para experimentos, se possível, não excedemos a passagem das linhas celulares por mais de 20 vezes. Uma vez que os NPCs crescem rapidamente, um grande número de estoques pode ser congelado em passagens mais baixas para experimentos. Linhas celulares com taxas de crescimento particularmente elevadas têm maior risco de acidificação da mídia. Assim, à medida que as linhas celulares crescem com velocidade diferente, a quantidade de mídia pode precisar ser ajustada com base na proliferação. Se as células são continuamente deixadas em meios altamente acidificados, pode influenciar a saúde tanto do controle quanto das linhas celulares da doença. Isso faz com que até mesmo astrócitos saudáveis se tornem reativos, afetando seu uso em maiores diferenciações e experimentos.

Para a diferenciação de astrócitos, é importante manter as células em baixa densidade, pois a alta densidade impedirá que as células se diferenciem e elas continuarão se proliferando a taxas mais altas. Assim, a densidade de semeadura precisa ser ajustada para cada linha celular dependente de sua taxa de proliferação. Recomendamos experimentar diferentes densidades de semeadura e realizar manchas/RT-PCR com marcadores de astrócito para garantir a adequada diferenciação. A qualidade das IAs pode ser avaliada juntamente com controles saudáveis usando ensaios de co-cultura com neurônios. Desde que a patologia da doença não leve a um fenótipo reativo, os neurônios devem permanecer viáveis em contato com as IAs por vários dias. A morfologia astrócito pode variar muito entre as linhas celulares individuais e pode ser impactada pelo fenótipo da doença também. Além disso, em doenças onde os astrócitos são fortemente impactados, eles podem apresentar um fenótipo reativo com extensões grandes e alongadas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Prato de estilo 100mm x 2mm, tratado para cultura de células, não pirogênico	Corning	430167	Cultura de tecidos
Tubos de centrífuga cônicos de 15 ml com tampa de rosca, polipropileno copolímero	USA Scientific	1475-1611	Usado para levantar e centrifugar células
Tubos de centrífuga cônicos de 50mL	USA Scientific	1500-1811	Preparação de mídia
Antibiótico-Antimicótico (100X)	Gibco	15240062	Antibiótico com atividade antifúngica para preparação de meios
B-27  Suplemento (50X), sem soro	Invitrogen	17504044	Para NPC e mídia base
Frascos criogênicos  1.2ML	Corning	CLS430658-500EA	Para congelar estoques de células
DMEM, glicose alta, GlutaMAX  Suplemento, piruvato	Gibco	10569010	Para fibroblastos e meios de astrócitos
DMEM/F-12, suplemento GlutaMAX		Gibco 10565042	Para NPC e meios base
DMSO	Sigma	D2438-50ML	Para congelamento de estoques de células
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Gibco	14190136	Referido no protocolo como PBS. Para diluição de fibronectina e lavagem celular
EZ Retrovirus iPSC Reprogramming Kit	ALSTEM	RF101	Retrovirus contendo os fatores Yamanaka. O vírus também pode ser feito internamente.
Soro Fetal Bovino, certificado	Gibco	16000-036	Referido no protocolo como FBS. Para meios de fibroblastos e astrócitos
Seringas estéreis da marca Fisher para uso único	Fisher	14-955-461	Meio filtrante (50mL)
Sal de sódio de heparina da mucosa intestinal suína	Sigma	H3149-10KU	Referido no protocolo como heparina. Usado em mídia de conversão. Pó diluído em água ultrapura. Concentração de estoque final de 5000X
Proteína Purificada Fibronectina	Plasmática Humana Millipore Sigma	FC010-10MG	Referido no protocolo como Fibronectina, usado em diluição 1:200 para revestimento.
Isopropanol (grau técnico)	Fisher Scientific	S25372A	Para congelar estoques de células
Mr. Frosty	Thermo Fisher	5100-0001	Para congelar estoques de células
N-2 Suplemento (100X)	Gibco	17502048	Para astrócitos, NPC e mídia base
EGF humano recombinante	Preprotech	AF-100-15	Referido no protocolo como EGF, utilizado em meios de conversão. Pó diluído em PBS, concentração final de 1mg/mL, armazenado em pequenas alíquotas congeladas
FGF-básico humano recombinante	Preprotech	100-18B	Referido no protocolo como FGF, utilizado em NPC e meios de conversão. Pó diluído em PBS, concentração final de 1mg/mL, armazenado em pequenas alíquotas congeladas
Reagente de dissociação celular StemPro Accutase	Gibco	A1110501	Referido no protocolo como Accutase. Usado para levantar durante o processo de conversão e NPCs.
Sistema de Filtração a Vácuo Estéril Stericup Quick Release-GP	Millipore Sigma	S2GPU05RE	Placa
cultura de tecidos, 6 poços, Fundo plano com tampa de baixa evaporação	Fisher	08-772-1B	Cultura de tecidos
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Invitrogen	25300062	Levantamento de Fibroblastos e Astrócitos Filtros de
seringa Whatman Puradisc 25, 0,2 μ m, PES estéril	Millipore Sigma	80-2502	Meio filtrante (50mL)