Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Resumo

O genoma mitocondrial da levedura de Baker codifica oito polipeptídeos. O objetivo do protocolo atual é rotular todos eles e, posteriormente, visualizá-los como bandas separadas.

Resumo

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas capazes de respiração aeróbica. Eles contêm genoma circular e aparelho de expressão genética. Um genoma mitocondrial da levedura do padeiro codifica oito proteínas: três subunidades do citocromome c oxidase (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), três subunidades da ATP synthase (Atp6p, Atp8p e Atp9p), uma subunidade da enzima ubiquinol-citocromo c oxidoreductase, citocromo b (Cytb) e proteína ribossômica mitocondrial Var1p. O objetivo do método descrito aqui é rotular especificamente essas proteínas com methionina ³⁵S, separá-las por eletroforese e visualizar os sinais como bandas discretas na tela. O procedimento envolve várias etapas. Primeiro, as células de levedura são cultivadas em um meio contendo galactose até chegarem ao estágio de crescimento logarítmico tardio. Em seguida, o tratamento de cicloheximida bloqueia a tradução citoplasmática e permite a incorporação de metionina ³⁵S apenas em produtos de tradução mitocondrial. Em seguida, todas as proteínas são extraídas de células de levedura e separadas por eletroforese de gel de poliacrilamida. Finalmente, o gel é seco e incubado com a tela de fósforo de armazenamento. A tela é escaneada em um fosphorimager revelando as bandas. O método pode ser aplicado para comparar a taxa de biossíntese de um único polipeptídeo nas mitocôndrias de uma cepa de levedura mutante versus o tipo selvagem, o que é útil para estudar defeitos de expressão genética mitocondrial. Este protocolo fornece informações valiosas sobre a taxa de tradução de todas as mRNAs mitocondrial de leveduras. No entanto, requer vários controles e experimentos adicionais para tirar conclusões adequadas.

Introdução

Mitocôndrias são as organelas profundamente envolvidas no metabolismo de uma célula eucariótica. Sua cadeia de transferência de elétrons fornece a célula com ATP, a principal moeda energética usada em múltiplas vias bioquímicas. Além disso, estão envolvidos em apoptose, ácido graxo e síntese de heme, entre outros processos. A disfunção das mitocôndrias é uma fonte bem conhecida da doença humana¹. Pode resultar de mutações em genes nucleares ou mitocondriais codificando componentes estruturais ou regulatórios das organelas². O saccharomyces cerevisiae de baker é um excelente organismo modelo para estudar a expres....

Protocolo

1. Preparação da cultura da levedura

1. Leveduras de listras das culturas de estoque congelado em placas frescas com o meio apropriado. Coloque as placas em uma incubadora de cultura a 30 °C para 24-48 h.
   NOTA: Deixe os mutantes sensíveis à temperatura crescerem na temperatura permissiva.
2. Culturas de levedura inoculada em 2 mL de meio YPGal (2% peptone, 1% extrato de levedura, 2% galactose) da raia fresca em tubos de 15 mL e incubar-as durante a noite agitando a 200 rpm a 30 °C.
3. Meça a densidade óptica da cultura em um comprimento de onda de 600 nm (OD₆₀₀).
4. Pegue o volume correspondente a 0,2 unidades de absorção em t....

Resultados

Seguindo o protocolo descrito acima, atribuímos produtos de tradução mitocondrial de duas cepas de S. cerevisiae: o tipo selvagem(WT) e uma exclusão de rolamento mutante do gene AIM23 (AIM23Δ),codificando o fator de iniciação da tradução mitocondrial 3(Tabela 1)⁸. Os produtos de tradução mitocondrial foram rotulados radioativamente e separados em SDS-PAAG9. As amostras foram coletadas a cada 2,5 minutos antes da saturação para a construção de um.......

Discussão

Investigações de expressão genética ocupam uma parte central nas ciências da vida moderna. Inúmeros métodos que fornecem insights sobre esse processo complexo foram desenvolvidos. Aqui, descrevemos o método que permite acessar a biossíntese proteica na levedura s. cerevisiae mitocôndrias. Geralmente é aplicado para comparar a eficiência de tradução dos mRNAs em mitocôndrias de levedura mutante versus tipo selvagem para acessar as consequências da mutação estudada. Este é um dos experimentos básicos que os pesqui.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Acrilamida	Sigma-Aldrich	A9099
Persulfato de amônio	Sigma-Aldrich	A3678
Ágar bacteriológico	Sigma-Aldrich	A5306
Medidor de Densidade Celular Biowave CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
Marca cubetas descartáveis padrão	Sigma-Aldrich	Z330361
clorofórmio	Sigma-Aldrich	288306
cicloheximida	Sigma-Aldrich	C1988;
D-(+)-Galactose	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glicose	Sigma-Aldrich	G7021
aquecedor de bloco digital	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Metionina, 500µ Ci (18.5MBq), Solução Aquosa Estabilizada	Eppendorf NEG709A500UC		Perkin Elmer
5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-metionina	Sigma-Aldrich	M9625
metanol	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetrametiletilenodiamina	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Metilenobisacrilamida	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Incubadora Shaker	Brunswick Scientific
Peptona de carne, bacteriológica	Millipore	91249
Fluoreto de fenilmetanossulfonil	Sigma-Aldrich	P7626
Kit de Ensaio de Proteína Pierce 660nm	Fonte de Alimentação Básica Thermo Scientific	22662
PowerPac	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Dicloridrato de Puromicina de Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 gerador de imagens de fósforo	Base Trizma da GE Healthcare
	Sigma-Aldrich	93352
Secador de Gel Aquecido a Vácuo	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Extrato de Levedura	Sigma-Aldrich	Y1625

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