Este protocolo usa um ensaio de imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5nos corações dissecados de embriões de zebrafish.
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Artigo de método
Usando imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5em corações embrionários de zebrafish
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A exposição de partículas finas ambientes (PM2.5) pode levar à toxicidade do desenvolvimento cardíaco, mas os mecanismos moleculares subjacentes ainda não estão claros. 8-hidroxi-2'desoxygenase (8-OHdG) é um marcador de dano oxidativo de DNA e γH2AX é um marcador sensível para quebras de fios duplos de DNA. Neste estudo, tivemos como objetivo detectar alterações de PM2.5-Induzidas 8-OHdG e γH2AX no coração de embriões de zebrafish usando um ensaio de imunofluorescência. Os embriões de zebrafish foram tratados com questões orgânicas extrativáveis (EOM) a partir de PM2,5 a 5 μg/mL na presença ou ausência de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0,25 μM) a 2 h pós fertilização (hpf). O DMSO foi usado como controle de veículos. Com 72 cv, os corações foram dissecados a partir de embriões usando uma agulha de seringa e fixos e permeabilizados. Após serem bloqueadas, as amostras foram sondadas com anticorpos primários contra 8-OHdG e γH2AX. As amostras foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários. As imagens resultantes foram observadas sob microscopia de fluorescência e quantificadas por ImageJ. Os resultados mostram que os sinais de EOM de PM2.5 aumentaram significativamente os sinais 8-OHdG e γH2AX no coração dos embriões de zebrafish. No entanto, o NAC, agindo como um carniceiro reativa de oxigênio (ROS), contra-ativou parcialmente o dano de DNA induzido pelo EOM. Aqui, apresentamos um protocolo de imunofluorescência para investigar o papel dos danos de DNA em defeitos cardíacos induzidos por PM2,5que podem ser aplicados à detecção de mudanças de expressão de proteínas induzidas por químicos ambientais nos corações dos embriões de zebrafish.
Introdução
A poluição do ar é agora um sério problema ambiental enfrentado pelo mundo. Partículas finas ambientes (PM2.5),que é um dos indicadores mais importantes da qualidade do ar, podem transportar um grande número de substâncias nocivas e entrar no sistema circulatório sanguíneo, causando sérios danos à saúde humana1. Estudos epidemiológicos demonstraram que a exposição à PM2,5 pode levar a um risco aumentado de defeitos cardíacos congênitos (CHDs)2,3. Evidências de experimentos em animais também mostraram que a PM2.5 pode causar desenvolvimento cardíaco anorm....
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Protocolo
Os zebrafish do tipo selvagem (AB) utilizados neste estudo foram obtidos no Centro Nacional de Recursos de Zebrafish em Wuhan, China. Todos os procedimentos de animais aqui descritos foram revisados e aprovados pela Instituição de Cuidados Com Animais do Comitê de Ética da Universidade de Soochow.
1. PM2.5 amostragem e extração de compostos orgânicos
NOTA: PM2.5 foi coletado em uma área urbana em Suzhou, China, 1-7 de agosto de 2015, como descrito anteriormente5.
- Asse filtros de membrana de quartzo de 47 mm em um forno de muffle de 500 °C por 2 h para remove....
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Resultados
Este ensaio de imunofluorescência é um método sensível e específico para medir mudanças de expressão proteica nos corações dos embriões de zebrafish expostos a produtos químicos ambientais.
Nesta análise representativa, foram avaliados embriões expostos à PM2,5 na ausência ou presença do NAC antioxidante para a presença de malformações cardíacas(Figura 1). Como observado, o EOM da PM.......
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Discussão
Embora o zebrafish seja um excelente modelo vertebrado para estudar a toxicidade do desenvolvimento cardíaco de produtos químicos ambientais, devido ao pequeno tamanho do coração embrião, é difícil obter proteína suficiente para análise de manchas ocidentais. Por isso, apresentamos um método sensível de imunofluorescência para quantificar os níveis de expressão proteica dos biomarcadores de dano de DNA nos corações dos embriões de zebrafish expostos à PM2.5.
Durante a dissecação, é .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências da Natureza da China (número de subvenção: 81870239, 81741005, 81972999) e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 8-OHdG Anticorpo | Santa Cruz Biotechnology, EUA | sc-66036 | Anticorpo primário |
| Balança analítica | Sartorius, China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio, Pequim, China | SW3015 | Para bloquear |
| DAPI | Abcam, EUA | ab104139 | Para contracoloração nuclear. |
| DMSO | Solarbio, Pequim, China | D8371 | |
| Microscópio de fluorescência | Olympus, Japão | IX73 | Para sinais de fluorescência de imagem / |
| Cabra Anti-Coelho IgG Cy3 | Carlsbad, EUA | CW0159 | Anticorpo secundário |
| Cabra Anti-Coelho IgG FITC | Carlsbad, EUA | RS0003 | Anticorpo secundário |
| N-Acetil-L-cisteína (NAC) | Adamas-Beta, Xangai, China | 616-91-1 | |
| Agitador orbital | QILINBEIER, China | TS-1 | |
| Paraformaldeído | Sigma, China | P6148 | Faça 4% de paraformaldeído para fixação. |
| HyClone salino tampolado com fosfato | , EUA | SH30256.01 | Prepare 0,1% Tween em PBS para lavagem. |
| Amostrador PM2.5 | TianHong, Wuhan, China | TH-150C | Para amostragem PM2.5 ininterrupta de 24 horas. |
| Recirculação do sistema de aquicultura | HaiSheng, Xangai, China | O peixe-zebra foi mantido nele. | |
| Extrator Soxhlet | ZhengQiao, Xangai, China | BSXT-02 | Para extração de componentes orgânicos. |
| Estereomicroscópio | Nikon, Canadá | SMZ645 | Para dissecção cardíaca de embriões de peixe-zebra. |
| Tricaine metanossulfonato (MS222) | Sigma, China | E10521 | Para anestesiar embriões de peixe-zebra |
| Tween 20 | Sigma, China | P1379 | |
| e gama; Anticorpo H2AX | Abcam, EUA | ab26350 | Anticorpo primário |
Referências
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C.,....
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Reimpressões e permissões
