Apresentamos um método para a aquisição de cursos de tempo de repórter fluorescência de células únicas usando matrizes micropatteradas. O protocolo descreve a preparação de matrizes unicelulares, a configuração e o funcionamento de microscopia de lapso de tempo de varredura de células vivas e uma ferramenta de análise de imagem de código aberto para pré-seleção automatizada, controle visual e rastreamento de cursos de tempo de fluorescência integrados por células por local de adesão.
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Artigo de método
Imagem de células vivas de matrizes unicelulares (LISCA) - uma técnica versátil para quantificar cinética celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A imagem de células vivas de Matrizes Unicelulares (LISCA) é um método versátil para coletar cursos de tempo de sinais de fluorescência de células individuais em alta produtividade. Em geral, a aquisição de cursos de tempo unicelulares de células cultivadas é dificultada pela motilidade celular e diversidade de formas celulares. Micro arrays adesivos padronizam as condições unicelulares e facilitam a análise de imagens. O LISCA combina microarrays unicelulares com microscopia de lapso de tempo de varredura e processamento automatizado de imagens. Aqui, descrevemos os passos experimentais de fazer cursos de tempo de fluorescência unicelulares em um formato LISCA. Transfectamos células aderentes a uma matriz micropatterada usando codificação mRNA para proteína fluorescente verde aprimorada (eGFP) e monitoramos a cinética de expressão eGFP de centenas de células em paralelo através da microscopia de lapso de tempo de varredura. As pilhas de dados de imagem são automaticamente processadas por um software recém-desenvolvido que integra a intensidade da fluorescência sobre contornos celulares selecionados para gerar cursos de tempo de fluorescência unicelulares. Demonstramos que os cursos de tempo de expressão do eGFP após a transfecção do mRNA são bem descritos por um simples modelo de tradução cinética que revela taxas de expressão e degradação do mRNA. Outras aplicações do LISCA para correlações de tempo de evento de múltiplos marcadores no contexto de sinalização da apoptose são discutidas.
Introdução
Nos últimos anos, a importância de experimentos unicelulares tornou-se aparente. Os dados de células únicas permitem a investigação da variabilidade celular-célula, a resolução de correlações de parâmetros intracelulares e a detecção de cinéticas celulares que permanecem escondidas nas medições do conjunto1,2,3. Para investigar cinética celular de milhares de células únicas em paralelo, são necessárias novas abordagens que permitam monitorar as células em condições padronizadas durante um período de várias horas até vários dias seguido de uma análise quantitativa de dados
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Protocolo
Figura 2: Aquisição de dados combinando microarrays unicelulares (A) com microscopia de lapso de tempo de varredura (B). Como preparação do experimento de lapso de tempo, uma matriz unicelular com um micropattern 2D de quadrados de adesão é preparada (1), seguida pela semeadura celular e o alinhamento das células no micropêrnio (2), bem como a conexão de um sistema de perfusão ao slide de seis canais, que permite o manuseio líquido durante a medição do lapso de tempo (3). Um experimento de lapso de tempo....
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Resultados
A abordagem LISCA permite coletar eficientemente cursos de tempo de fluorescência a partir de células únicas. Como exemplo representativo, descrevemos como o método LISCA é aplicado para medir a expressão eGFP unicelular após a transfecção. Os dados do experimento LISCA são utilizados para avaliar cinética de entrega de mRNA, o que é importante para o desenvolvimento de medicamentos mRNA eficientes.
Em particular, demonstramos o impacto diferente de dois sistemas de entrega de mRNA baseados em.......
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Discussão
Aqui descrevemos o LISCA como uma técnica versátil para seguir cinética celular de rótulos fluorescentes intracelulares no nível de célula única. Para realizar um experimento LISCA bem-sucedido, cada uma das etapas descritas da seção de protocolo deve ser estabelecida individualmente e, em seguida, todas as etapas devem ser combinadas. Cada um dos três principais aspectos do LISCA apresentam etapas cruciais.
Fabricação de microarraia unicelular
A qualidade da microarray é crucial, .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação Alemã de Ciência (DFG) ao Centro de Pesquisa Colaborativa (SFB) 1032. Apoio do Ministério Federal alemão da Educação, Pesquisa e Tecnologia (BMBF) no âmbito do projeto cooperativo 05K2018-2017-06716 Medisoft, bem como uma bolsa da Bayerische Forschungsstiftung são reconhecidas com gratidão. Anita Reiser foi apoiada por uma Bolsa DFG através da Escola de Pós-Graduação em Biociências Quantitativas de Munique (QBM).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Microtubulação de PTFE da Adtech Polymer Engineering | Fisher Scientific | 10178071 | |
| de cozimento | Binder | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| Dessecador | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Fêmea Luer para Conector de Tubo | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Soro fetal bovino | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectina | Yo Proteínas | 663 | |
| Conjunto de filtros eGFP | AHF | F46-002 | |
| Marca Fisher Tubo de silicone curado com platina translúcida | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Okolab | OKO-H201 | ||
| incubadora | Binder | 9040-0012 | |
| L-15 sem vermelho de fenol | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | ||
| Luer | fabricado internamente consistindo em teflon | ||
| Luer macho para conector de tubo | MEDNET | MTLS210-6005 | alternativa aos luers macho fabricados internamente |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| válvula sem agulha para conector Luer macho | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Software de imagem Versão 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Adesivo óptico de cura rápida para montagem |
| do sistema de tubos Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Fosfato tamponado salino (PBS) | preparado internamente | ||
| Plasma Cleaner | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| wafer de silício com microestruturas | fabricadas internamente | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Kit de Elastômero | de Silicone Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Mä rzhä usuário | 00-24-626-0000 | |
| ultrapura | in-house preparada | ||
| lamínulas não revestidas | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | com sporn de reposição |
Referências
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
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Reimpressões e permissões
