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Artigo de método

Um ensaio rápido de preferência alimentar em Drosophila

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DOI:

10.3791/62051

⸱

11 de fevereiro de 2021

 , 
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Apresentamos um protocolo para um ensaio de alimentação de duas opções para moscas. Este ensaio de alimentação é rápido e fácil de executar e é adequado não apenas para pesquisas de laboratório de pequena escala, mas também para telas comportamentais de alto rendimento em moscas.

Resumo

Para selecionar alimentos com valor nutricional, evitando o consumo de agentes nocivos, os animais precisam de um sistema de paladar sofisticado e robusto para avaliar seu ambiente alimentar. A mosca-das-frutas, Drosophila melanogaster,é um organismo modelo geneticamente tratável que é amplamente utilizado para decifrar os fundamentos moleculares, celulares e neurais da preferência alimentar. Para analisar a preferência alimentar da mosca, é necessário um método de alimentação robusto. Descrito aqui é um ensaio de alimentação de duas opções, que é rigoroso, econômico e rápido. O ensaio é à base de placas de Petri e envolve a adição de dois alimentos diferentes complementados com corante azul ou vermelho às duas metades do prato. Em seguida, ~70 prestarved, moscas de 2-4 dias de idade são colocadas no prato e permitidos para escolher entre alimentos azuis e vermelhos no escuro por cerca de 90 minutos. O exame do abdômen de cada mosca é seguido pelo cálculo do índice de preferência. Em contraste com placas multiwell, cada placa de Petri leva apenas ~20 s para encher e economiza tempo e esforço. Este ensaio alimentar pode ser empregado para determinar rapidamente se as moscas gostam ou não de um determinado alimento.

Introdução

Apesar das diferenças dramáticas na estrutura anatômica dos órgãos de paladar entre moscas e mamíferos, as respostas comportamentais das moscas a muitas substâncias tastant são surpreendentemente semelhantes às dos mamíferos. Por exemplo, as moscas preferem açúcar1,2,3,4,5,6,7,8, aminoácidos9,10, e baixo sal11, que indicam nutrientes, mas rejeitam alimentos amargos12,13,14,15 que são inpalatáveis ou tóxicos. Nas últimas duas décadas, as moscas provaram ser um organismo modelo altamente valioso para avançar na compreensão de muitas questões fundamentais relacionadas à sensação do sabor e ao consumo alimentar, incluindo detecção de sabor, transdução de sabor, plasticidade do sabor e regulação alimentar16,17,18,19,20. Notavelmente, uma série de estudos têm demonstrado que os mecanismos de transdução de sabor e circuito neural subjacentes à percepção do sabor são análogos entre moscas frutíferas e mamíferos. Portanto, a mosca-das-frutas serve como um organismo experimental ideal, permitindo que os pesquisadores descubram conceitos e princípios evolutivamente conservados que regem a detecção e o consumo de alimentos no reino animal.

Para investigar a sensação de sabor em moscas, é fundamental estabelecer um ensaio rápido e rigoroso para medir objetivamente a preferência alimentar. Ao longo dos anos, vários métodos de alimentação, tais como ensaios à base de corante11,12,13,21,22,23, o ensaio de resposta de extensão proboscis mosca24, o alimentador capilar (CAFE) ensaio25,26, o ensaio Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)eoutros métodos combinatórios foram desenvolvidos para medir quantitativamente a preferência alimentar e/ou a ingestão alimentar de moscas de frutas28,29,30,31. Um dos paradigmas populares de alimentação é o ensaio de alimentação de duas opções baseado em corante usando uma placa de microtiter multiwell12,21,32 ou, como descrito aqui, uma pequena placa de Petri11,22 como a câmara de alimentação. Este ensaio é projetado com base na transparência do abdômen da mosca. Durante este ensaio, as moscas são colocadas na câmara de alimentação e apresentadas com duas opções de alimentos misturadas com corante vermelho ou corante azul. Uma vez que o ensaio esteja completo, os abdômens de mosca aparecem vermelhos ou azuis, dependendo de qual alimento eles consumiram.

Tanto a placa de Petri quanto os ensaios de alimentação à base de corante de placas multiwell são altamente robustos e produzem aproximadamente os mesmos resultados. Utilizando esses dois ensaios, inúmeras descobertas importantes e avanços foram feitos para decifrar os receptores e células altamente diversificados responsáveis por detectar os gostos alimentares e a textura dos alimentos11,12,21,22,32,33. No ensaio baseado em corante, um passo experimental que requer tempo e esforço considerável é preparar e carregar alimentos na câmara de alimentação. Para reduzir o tempo de preparação e carregamento dos alimentos, este ensaio foi modificado substituindo a placa de microtiter multiwell por uma pequena placa de Petri, que é dividida em dois compartimentos iguais. No ensaio à base de placa de Petri, dois alimentos diferentes complementados com corante azul ou vermelho são adicionados às duas metades do prato. Em seguida, ~70 prestarved, moscas de 2-4 dias de idade são colocadas no prato e permitidos para escolher entre alimentos azuis e vermelhos no escuro por cerca de 90 minutos. O abdômen de cada mosca é então examinado, e o índice de preferência (PI) é calculado.

Este ensaio de alimentação de duas opções baseado em placa de Petri é acessível, simples e rápido. Uma placa multiwell requer aproximadamente 110 s para encher, enquanto cada placa de Petri leva apenas ~20 s. Além disso, a placa multiwell requer a tubulação de pequenos volumes de alimentos em um grande número de pequenos poços (por exemplo, 60 ou mais poços por placa), o que exige considerável precisão e atenção. Por outro lado, o ensaio baseado em placa de Petri requer apenas duas ações por placa. Como o ensaio de alimentação pode envolver um grande número de réplicas, o ensaio baseado em placa de Petri economiza uma quantidade não trivial de tempo e esforço. Este ensaio dá resultados equivalentes aos do ensaio baseado em multiwell e tem se mostrado bem sucedido em abordar muitas questões fundamentais na sensação do sabor, incluindo a codificação do sabor salgado11,a plasticidade do sabor modificada pela experiência alimentar22, e a base molecular da sensação da textura dos alimentos33. Em resumo, este ensaio de duas opções baseado em placa de Petri é uma ferramenta poderosa para investigar como as moscas percebem o meio de nutrientes externos e internos para obter o comportamento alimentar adequado.

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Protocolo

1. Montagem das câmaras de ensaio

NOTA: Embora este protocolo descreva o uso de uma placa de Petri de 35 mm(Figura 1A),o efeito desejado pode ser alcançado usando qualquer vaso de fundo liso e impermeável que possa ser bisseccionado e coberto.

  1. Primeiro, bissectar uma placa de Petri de 35 mm com tampa fixando um comprimento de plástico (5 mm de largura e 3 mm de altura) pela linha média com adesivo impermeável, formando dois compartimentos impermeáveis. Confirme se o selo está completo para evitar vazamentos que podem levar à mistura dos dois substratos alimentares que estão sendo avaliados.
    NOTA: Após a montagem, reutilize este aparelho enquanto o selo aguentar.

2. Preparando frascos de fome

  1. Preparar um número suficiente de frascos de mosca de plástico vazio; em seguida, livremente compactar um pedaço de papel de tecido na parte inferior. Comprimir o papel de tecido o suficiente para que ele preencha o espaço, mas não tanto que ele forma uma massa densa.
    NOTA: Certifique-se de que não há fendas profundas ou dobras no tecido, pois isso pode levar as moscas a ficarem presas.
  2. Adicione ~3 mL de água pura ao frasco para que o tecido esteja completamente saturado, mas não há água parada. Certifique-se de que não há grandes gotículas de água em excesso na parede do frasco. Alternativamente, o substituto surgiu para o papel encharcado, preparando uma solução de 1% w/v de ágar (sem sacarose) adicionando 5 mL de 1% de agarose a cada frasco vazio e permitindo que a agarose solidifice à temperatura ambiente.

3. Fome úmida de moscas antes do experimento

  1. Inicie a fome 24 horas antes da hora do experimento. Sob anestesia de CO2, grupos de ~70, 2-4 dias de idade voam para os frascos de fome preparados, rotulando cada frasco com o genótipo e tempo de fome.

4. Configuração do reagente

  1. Preparação de corantes
    NOTA: Antes de realizar quaisquer experimentos, é importante realizar um ensaio de controle preliminar para determinar as concentrações corretas de corantes vermelhos e azuis a serem usados.
    1. Para o ensaio de controle, prepare uma série de diluições para cada corante, e realize o ensaio de alimentação com o mesmo alimento com uma corante diferente. Use os resultados para identificar concentrações de dois corantes (um vermelho, um azul) que produzem um PI de ~0 quando nenhum composto experimental é adicionado (ver seção 7).
      NOTA: Por exemplo, a concentração final de corante azul foi fixada em 50 μM e testada contra uma série de concentrações de corante vermelho. Com base na curva de dosagem de corante vermelho, a concentração ideal de corante vermelho foi de 210 μM, o que deu viés de corante mínimo(Figura 1B). Uma maior concentração de corante vermelho leva as moscas a preferir alimentos vermelhos, enquanto uma menor concentração leva as moscas a preferir comida azul. Refine cuidadosamente as concentrações de corante azul ou vermelho em incrementos de 1 μM, pois diferenças dessa magnitude e maior podem afetar os resultados experimentais.
  2. Preparação de 1% de agarose
    1. Combine 0,5 g de agarose e 50 mL de água pura (ou alguma delas múltipla) em um vaso seguro para micro-ondas. Micro-ondas a solução agarose até dissolver, agitando-a conforme necessário.
  3. Preparação de outros componentes alimentares
    1. Dissolva cada componente alimentar, incluindo sacarose e quaisquer compostos experimentais, em água a uma concentração 100 vezes ou maior da concentração testada final.
      NOTA: O volume total de cada ingrediente alimentício adicionado a 1% de ágar não deve exceder 1 mL por 10 mL de ágar derretido. Caso contrário, a agarose pode ser muito diluída e não se solidificar adequadamente.
  4. Preparação de mídia alimentar
    1. Misture ágar, corante e o composto experimental desejado em tubos cônicos de centrífugas de polipropileno (15 ou 50 mL); usar água em vez do tastant experimental no alimento de controle. Faça isso enquanto o ágar ainda estiver completamente líquido e misture completamente usando uma batedeira de vórtice. Mantenha os tubos em um banho de água de 60 °C enquanto não estiver em uso para evitar que a agarose endureça antes de ser distribuída em pratos.
  5. Preparando pratos para o experimento
    NOTA: Certifique-se de que todos os pratos estão completamente secos antes de começar.
    1. Pipeta 1 mL de meio de alimentação experimental vermelha em um lado do prato de ensaio (Figura 1A); repetir para o número desejado de pratos. Deixe a agarose esfriar até ficar firme (3-5 min), e depois pipeta 1 mL de alimento de controle azul para o outro lado dos pratos(Figura 1A). Repita este processo com o par azul vermelho/experimental de controle.
      NOTA: Certifique-se de que todos os pratos estão totalmente definidos antes de iniciar o experimento. Use os pratos dentro de 30 minutos.

5. Iniciando o ensaio de alimentação bidirem

  1. Paralise temporariamente as linhas de moscas experimentais no gelo até que não sejam observadas atividades motoras óbvias, como voar e escalar. Uma vez que as moscas são imobilizadas, inverta suavemente o frasco, e toque para transferir todas as moscas para a câmara de ensaio.
    NOTA: O choque frio leva ~3-5 min. A exposição prolongada ao frio pode afetar a fisiologia e a saúde da mosca e, portanto, deve ser evitada.
  2. Coloque rapidamente a tampa na câmara e reserve-a. Uma vez que todas as moscas tenham sido transferidas, mova todas as câmaras para um espaço escuro e fechado. Deixe o ensaio funcionar por 90 minutos.
    NOTA: Um ambiente escuro minimiza a influência da via visual da mosca no comportamento alimentar e remove quaisquer pistas ambientais de fora do prato.

6. Terminando o ensaio de alimentação bidirem

  1. Depois de 90 min terem transcorrido, transfira as câmaras para um congelador de -20 °C para sacrificar as moscas. Depois de ~1 h, conte as moscas.
    NOTA: Inverta cada placa de Petri antes de colocar a placa no congelador para garantir que nenhuma mosca será congelada na comida.

7. Atribuir um índice de preferência (PI) para determinar a preferência alimentar

  1. Sob um microscópio de dissecção padrão, examine a cor abdominal das moscas em cada prato individual. Conte as moscas como vermelho, azul ou roxo de acordo com a cor de seu abdômen(Figura 2A). Conte a mosca se seu abdômen tiver mais de 50% de cor, indicando alimentação robusta(Figura 2B). Exclua a mosca se seu abdômen contiver apenas um pequeno ponto de alimentação, indicando má alimentação(Figura 2C).
  2. Depois que o número de moscas comendo azul, vermelho ou alimentos azuis e vermelhos tiver sido contado, use a seguinte equação para atribuir a cada placa de Petri um índice de preferência (PI):

PI = (Número de moscas que comem alimentos experimentais) - (Número de moscas que comem alimentos de controle) / (Número de moscas que comem alimentos experimentais) + (Número de moscas que comem alimentos de controle) + (Número de moscas comendo ambas)

Pi > 0 indica preferência pelo composto experimental, PI < 0 indica uma aversão ao composto experimental, e PI = 0 não indica nenhum efeito do composto no comportamento alimentar.

8. Limpeza das câmaras de ensaio

  1. Limpe prontamente as placas de Petri raspando o substrato alimentar e enxaguando-as com água e sabão sem perfumado. Mergulhe as placas de Petri durante a noite em água destilada. Verifique se a vedação divisória em cada prato ainda é impermeável, em seguida, deixe o prato secar.
    NOTA: Depois de garantir que não haja manchas residuais ou de corante, as placas de Petri estão prontas para serem usada novamente.

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Resultados

Neste ensaio, um prato de 35 mm foi dividido em dois compartimentos de alimentação iguais, com cada metade do prato contendo alimentos agarose, juntamente com corante azul ou vermelho(Figura 1A). Para excluir o viés de corante, as concentrações de corante azul e vermelho foram cuidadosamente refinadas para produzir um PI "0" aproximado quando apenas esses dois corantes foram adicionados(Figura 1B). Uma vez que a placa de Petri estava carregada com alimentos test...

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Discussão

Este método envolve várias etapas cruciais onde problemas podem ocorrer. Primeiro, certifique-se de que as moscas ingeram uma quantidade suficiente de alimentos para fornecer dados estáveis. Se as moscas comem mal, certifique-se de que as moscas estão com fome há pelo menos 24 horas, e que a mídia experimental contém pelo menos uma concentração mínima de sacarose (2 mM). Para estimular ainda mais o consumo alimentar, prolongar o período de fome úmida para além das 24 horas, dependendo da condição fisiológica das moscas. ...

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Divulgações

Os autores não declaram conflitos de interesse ou interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Tingwei Mi por ajudá-los a otimizar o ensaio de alimentação de duas opções. Eles também gostariam de agradecer Samuel Chan e Wyatt Koolmees por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, com subsídios R03 DC014787 (Y.V.Z.) e R01 DC018592 (Y.V.Z.) e pela Fundação Ambrose Monell.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de Petri de 35 mmFisher Scientific08-772E
AgaroseThomas ScientificC756P56
Adesivo transparenteFisher ScientificNC9884114
Tubos de centrífuga cônicosFisher Scientific05-527-90
Microscópio de dissecçãoAmscopeSM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant BlueWako Chemical3844-45-9
Fly CO2 configuração de anestesiaGenesee Scientfic59-114/54-104M
Incubadora de moscas com ciclo dia/noite programávelPowers Scientific Inc.IS33SD
para moscas
Prato de vidro (seguro para micro-ondas)
KimwipesFisher Scientific06-666A
Garrafa de armazenamento de mídiaFisher Scientific50-192-9998
Divisor de plástico cortado para caber no prato de uma folha não mais espessa que 5 mm
Frascos de plástico para moscasGenesee Scientific32-116
SacaroseMillipore SigmaS9378
Sulforrodamina BMillipore SigmaS9012
Composto de Tastant de interesse
Misturador de vórticeBenchmark ScientificBV1000
Banho-mariaFisher ScientificFSGPD05
Linhas

Referências

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