Descrevemos a engenharia de uma nova polimerase T7 RNA com DNA para regular reações de transcrição in vitro. Discutimos os passos para a síntese e caracterização proteica, validamos a regulação transcricional de prova de conceito e discutimos suas aplicações em computação molecular, diagnóstico e processamento de informações moleculares.
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Artigo de método
Dna-Tethered RNA Polymerase para Transcrição In vitro Programável e Computação Molecular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A nanotecnologia de DNA permite a automontagem programável de ácidos nucleicos em formas e dinâmicas prescritas pelo usuário para diversas aplicações. Este trabalho demonstra que conceitos da nanotecnologia de DNA podem ser usados para programar a atividade enzimática da polimerase T7 RNA (RNAP) derivada de phage e construir redes de regulação genética sintética escalável. Primeiro, um T7 RNAP com oligonucleotídeo é projetado através da expressão de um RNAP com marca SNAP n-terminal e posterior acoplamento químico da tag SNAP com um oligonucleotídeo modificado por benziloguanina (BG). Em seguida, o deslocamento da cadeia nucleico-ácido é usado para programar transcrição de polimerase sob demanda. Além disso, conjuntos auxiliares de ácido nucleico podem ser usados como "fatores de transcrição artificial" para regular as interações entre o T7 RNAP programado pelo DNA com seus modelos de DNA. Este mecanismo de regulação de transcrição in vitro pode implementar uma variedade de comportamentos de circuito, como lógica digital, feedback, cascata e multiplexing. A composabilidade dessa arquitetura normativa genética facilita a abstração, padronização e escala do design. Esses recursos permitirão a prototipagem rápida de dispositivos genéticos in vitro para aplicações como biosensação, detecção de doenças e armazenamento de dados.
Introdução
A computação em DNA usa um conjunto de oligonucleotídeos projetados como meio de computação. Esses oligonucleotídeos são programados com sequências para serem montados dinamicamente de acordo com a lógica especificada pelo usuário e responder a entradas específicas de ácido nucleico. Em estudos de prova de conceito, a saída da computação normalmente consiste em um conjunto de oligonucleotídeos fluorescentes rotulados que podem ser detectados através de leitores de eletroforese de gel ou fluorescência. Ao longo dos últimos 30 anos, foram demonstrados circuitos computacionais de DNA cada vez mais complexos, como várias cascatas lógicas digitais, redes de reação química ....
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Protocolo
1. Preparação do buffer
NOTA: A preparação do tampão de purificação de proteínas pode ocorrer em qualquer dia; aqui, foi feito antes de começar os experimentos.
- Prepare o tampão de lise/equilíbrio contendo 50 mM tris (hidroximetil)aminometano (Tris), cloreto de sódio de 300 mM (NaCl), 5% de glicerol e 5 mM β-mercaptoethanol (BME), pH 8. Adicione 1,5 mL de 1M Tris, 1,8 mL de 5M NaCl, 1,5 mL de glicerol, 25,2 mL de água desionizada (ddH2O) em um tubo centrífuga de 50 mL e adicione 10,5 μL de 14,2 M BME pouco antes de usar.
NOTA: Tris pode causar toxicidade aguda; portanto, evite respirar seu pó, e evite a pele e o cont....
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Resultados
Figura 5: Análise SDS-PAGE da expressão SNAP T7 RNAP e ensaio de transcrição in vitro. (A) ANÁLISE DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS SNAP T7 RNAP, PESO molecular SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = fluxo-through da coluna, W1 = frações de eluição de tampão de lavagem contendo impurezas, E1-3 = frações de eluição contendo produto purificado, e DE = 10x dil.......
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Discussão
Este estudo demonstra uma abordagem inspirada em nanotecnologia de DNA para controlar a atividade da polimerase T7 RNA, acoplando um T7 RNAP recombinante com marca DE-T7 com um oligonucleotídeo funcionalizado pela BG, que foi posteriormente usado para programar reações TMDSD. Por design, a tag SNAP foi posicionada no N-terminus da polimerase, já que o C-terminus do tipo selvagem T7 RNAP está enterrado dentro do núcleo da estrutura proteica e faz contatos importantes com o modelo de DNA28. Tentativ.......
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Divulgações
Não há interesses financeiros concorrentes para declarar por nenhum dos autores.
Agradecimentos
L.Y.T.C reconhece o generoso apoio do New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), do Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant e da University of Toronto's Medicine by Design Initiative, que recebe financiamento do Canada First Research Excellence Fund (CFREF).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,5% polissorbato 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0,5M ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM tampão fosfato de sódio (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Comprimidos usados para fazer 10 mM tampão |
| 10% persulfato de amônio (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 Centrífugo Unidade de Filtro | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetona | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% etanol (EtOH) | Marca da casa | 39752-P016-EAAN | |
| 10x tampão de transcrição in vitro (IVT) | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropil β- d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M tampão de bicarbonato de sódio | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(hidroximetil)aminometano (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X Tris-EDTA (TE) tampão | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazol | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoetanol (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M acetato de sódio | Bio Basic | SRB1611 | |
| acrilamida 40% (19: 1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x LDS tampão de carregamento de amostra de proteína | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M cloreto de sódio (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM ditiotreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x corante de carregamento de gel | New England Biolabs | B7024S | |
| agarose B em pó | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competente E. coli Addgene | C2530H | ||
| BLUeye pré-fabricada escada de proteína | FroggaBio | PM007-0500 | |
| azul de bromofenol | Bio Basic | BDB0001 | |
| azul coomassie (SimplyBlue SafeStain) | Corante de | ThermoFisher LC6060 | |
| (corante de gel de ácido nucleico SYBR Gold) | Corante | Fisher Scientific S11494 | |
| (corante de gel de ácido nucleico seguro SYBR | Fisher Scientific | S33102 | |
| dimetilsulfóxido seco (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formamida | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glicerol | Bio Basic | GB0232 | |
| sulfato de canamicina | BioShop | KAN201.5 | |
| caldo de lisogenia | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| malaquita oxalato verde | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetrametiletano-1,2-diamina (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS tampão de corrida (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1,0 mm 12-well | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleotídeo (gaiola antisense) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleotídeo ( cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleotídeo (aptâmero verde malaquita antisense) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleotídeo (malaquita verde aptâmero sense) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleotídeo (Fator de Transcrição A) | IDT | N/A | Agtacaccaactacgagtgag |
| Oligonucleotídeo (Fator de Transcrição B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| oligonucleotídeo com 3' Modificação de amina (amarra) | IDT | N/A | GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce colunas de spin de troca iônica forte | Fisher Scientific | 90008 | |
| plasmídeo que codifica genes de resistência SNAP T7 RNAP e canamicina | Genscript | N/A | de inserção de gene personalizado |
| (coluna de rotação HisPur Ni-NTA) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini coluna de rotação rápida de DNA | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Escada de DNA de alcance ultrabaixo | Fisher Scientific | 10597012 | |
| ureia | BioShop | URE001.1 |
Referências
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 4....
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Reimpressões e permissões
