Aqui, descrevemos a preparação de monocamadas epiteliais intestinais derivadas de organoides humanos para estudar a função da barreira intestinal, a permeabilidade e o transporte. Como os organoides representam a resposta original do tecido epitelial a estímulos externos, esses modelos combinam as vantagens da expansão das linhas celulares e a relevância e complexidade do tecido primário.
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Artigo de método
Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal
Neste artigo
Resumo
Resumo
No passado, os sistemas de modelo epitelial intestinal limitavam-se a linhas celulares transformadas e tecido primário. Esses sistemas de modelos têm limitações inerentes, pois os primeiros não representam fielmente a fisiologia do tecido original, e a disponibilidade deste último é limitada. Assim, sua aplicação dificulta pesquisas fundamentais e de desenvolvimento de medicamentos. Organoides adultos à base de células-tronco (a partir de agora referidos como organoides) são miniaturas de tecido epitelial normal ou doente do qual são derivados. Eles podem ser estabelecidos de forma muito eficiente a partir de diferentes regiões gastrointestinais (GI), têm expansão a longo prazo e simulam respostas específicas de tecidos e pacientes para tratamentos in vitro. Aqui, o estabelecimento de monocamadas epiteliais derivadas de organoides intestinais tem sido demonstrado juntamente com métodos para medir a integridade da barreira epitelial, permeabilidade e transporte, secreção de proteína antimicrobiana, bem como histologia. Além disso, as monocamadas derivadas de organoides intestinais podem ser enriquecidas com células de tronco e amplificadores de trânsito, bem como com células epiteliais diferenciadas. Portanto, eles representam um sistema modelo que pode ser adaptado para estudar os efeitos dos compostos nas células alvo e seu modo de ação. Embora as culturas organoides sejam tecnicamente mais exigentes do que as linhas celulares, uma vez estabelecidas, elas podem reduzir falhas nos estágios posteriores do desenvolvimento de medicamentos, pois representam verdadeiramente a complexidade do epitélio vivo e a heterogeneidade interpatente.
Introdução
O epitélio intestinal age como uma barreira física entre o conteúdo luminal dos intestinos e o tecido subjacente. Esta barreira compreende uma única camada epitelial de enterócitos principalmente absortivos que são conectados por junções apertadas, que estabelecem fortes conexões intercelulares entre células adjacentes. Essas células formam um revestimento epitelial polarizado que separa os lados apical (lúmen) e basolateral do intestino, ao mesmo tempo em que regulam o transporte paracelular de nutrientes e metabólitos digeridos. Além dos enterócitos, outras células epiteliais importantes, como cálice, paneto e células enteroendócrinas também contribuem para a homeos....
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Protocolo
1. Preparando reagentes para a cultura
NOTA: Execute todas as etapas dentro de um armário de biossegurança e siga as diretrizes padrão para trabalhar com culturas celulares. A luz ultravioleta é usada por 10 minutos antes de iniciar o armário de biossegurança. Antes e depois do uso, a superfície do armário de biossegurança é limpa com um papel de tecido encharcado em 70% de etanol. Para facilitar a formação de gotas tridimensionais de matriz extracelular (ECM), mantenha um estoque pré-enlatado de placas de 96, 24 e 6 poços prontas na incubadora a 37 °C.
- Preparação média basal
- Prepare o meio basal (BM) em um meio de águia m....
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Resultados
A Figura 1A mostra uma imagem representativa de organoides intestinais depois de descongelá-los de um criovial. É importante descongelar organoides em alta densidade para garantir uma recuperação ideal. Organoides são banhados em placas de 24 ou 6 poços em cúpulas ECM de aproximadamente 10 μL (Figura 1B). A maioria dos organoides intestinais normais tem uma morfologia cística. Após a recuperação do processo de descongelamento, os organoides crescem a um tamanho .......
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Discussão
Este protocolo descreve a manipulação geral e manutenção de organoides intestinais, bem como a preparação e possíveis aplicações de monocamadas epiteliais derivadas desses organoides. Até o momento, as monocamadas foram preparadas com sucesso a partir do duodeno, íleo e diferentes regiões de organoides de cólon derivados do tecido intestinal normal, bem como anteriormente e ativamente inflamado (dados inéditos). A aplicação de monocamadas organoides derivadas do paciente facilita o estudo da função de barreira de forma e.......
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Divulgações
Os autores não declaram conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pelo Topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health~Holland (LSH-TKI) subsídio de parcerias público-privadas (PPP) do setor holandês LSH com o número do Projeto LSHM16021 Organoids como nova ferramenta para modelagem toxicológica para a Tecnologia Organoide Hubrecht (HUB) e financiamento interno hub para modelagem de doenças e departamento de toxicologia. Agradecemos aos laboratórios da Sabine Middendorp (Divisão de Gastroenterologia Pediátrica, Hospital Infantil Wilhelmina, UMC, Utrecht) e Hugo R. de Jonge e Marcel J.C. Bijvelds (Departamento de Gastroenterologia e Hepatologia, Erasmus MC, Roterdã) po....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100% etanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
| 1250, 300 e 20 µ L pontas de filtro de baixa retenção | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
| Tubos cônicos de 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| placas de cultura de células de 24 poços | Greiner bio-one | 662160 | |
| Placa HTS Fluoroblok Transwell de 24 poços (à prova de luz) | Placas Corning | 351156 | |
| HTS Transwell de 24 poços (Tabela 1) | Corning | 3378 | |
| Placa de 24 poços com insertos Transwell | Corning | 3470 | |
| 40 µ filtro de células m | PluriSelect | 43-50040-01 | |
| Tubos cônicos de 50 mL | Greiner bio-one | 227261 | |
| placas de cultura de células de 6 poços | Greiner bio-one | 657160 | |
| Placa preta de 96 poços fundo transparente | Greiner bio-one | 655090 | |
| Placas de ciclagem térmica rápida de 96 poços | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
| Placa de transwell HTS Fluoroblok de 96 poços Placas de transwell | de | ||
| HTS de 96 poços (Tabela 1) | Corning | 7369 | |
| Placa de cultura transparente de 96 poços | Greiner bio-one | 655180 | |
| A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
| Reagente de dissociação de células Accutase | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell reagente de dissociação 2 |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
| suplemento B27 | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
| Microscópio de cultura celular (microscópio óptico / óptico) | Leica | ||
| CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Incubadora CO2 | PHCBI | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
| Depc tratado com H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
| solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco com Ca2+ e Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
| DPBS, pó, sem cálcio, sem magnésio | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
| EnzChek Kit de ensaio de lisozima | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
| Medidor EVOM2 com eletrodo STX | WTI | ||
| Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
| Pipetas de vidro | Volac | ||
| GlutaMAX | Life Technologies Europa BV | 35050038 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Life Technologies Europa BV | 15630056 | |
| Cabeça Humana | Peprotech | 120-10C | |
| Rspo3 | Humana Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
| IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
| Ki67 anticorpo primário | Sanbio | BSH-7302-100 | |
| Ki67 anticorpo secundário | Agilent | K400111-2 | |
| Kova International Glasstic Slide com grades de contagem | Fisher Emergo | 10298483 | |
| capa de fluxo laminar | Thermo scientific | ||
| Lucifer Sal amarelo do dilítio do CH | Sigma-Aldrich | L0259 | |
| Matrigel, fator de crescimento reduzido ( GFR) | Corning | 356231 | matriz extracelular (ECM) |
| MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
| MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
| Tubos de microcentrífuga | Eppendorf | 0030 120 086 | |
| Micropipetas (1000, 200 e 20 µ L) | Gilson | ||
| Microtome | Leica | ||
| MUC2 anticorpo primário | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
| MUC2 anticorpo secundário | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
| Pipeta multicanal (200 µ L) | Gilson | ||
| N-acetilcisteína | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0,5mg | |
| Nicotinamida | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Oligonucleotídeo ALPI1 / Forward | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | ||
| Oligonucleotídeo ALPI1 / Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
| Oligonucleotídeo LGR5 / Forward | Personalizado | ACACGTACCAGAAGCTC | |
| Oligonucleotídeo LGR5 / Reverso | Personalizado | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
| Oligonucleotídeo MUC2 / Forward | Personalizado | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
| Oligonucleotídeo MUC2 / Reverso | Personalizado | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
| Oligonucleotídeo TBP / Forward | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | ||
| Oligonucleotídeo TBP / Reverse | Custom - made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
| Tampas adesivas ópticas | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
| PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
| Penicilina / estreptomicina | Life Technologies Europa BV | 15140122 | |
| agitador de placas | Panasonic | ||
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
| Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | formulação antimicrobiana para células primárias |
| Qubit RNA HS Kit de ensaio | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
| Reservatório de reagente para pipeta multicanal | Amostrador automático Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
| REMS com sonda de 24 ou 96C | WTI | ||
| Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
| Conjunto DNase livre de RNase | Qiagen | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | Pipetas sorológicas S7076 | |
| Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | ||
| Pipetador sorológico (Pipet-Aid) | Lâmina | ||
| GEM Scientific | |||
| Superscript 1º sistema de fio para RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
| Tecan Spark 10M leitor de placas | Tecan | ||
| Solução azul de tripano, 0,4% | Life Technologies Europe | BV 15250-061 | |
| Enzima TrypLE Express (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Reagente de dissociação celular 1 |
| Banho-maria Grant | |||
| Y27632 (inibidor de ROCK) | AbMole | M1817 |
Referências
- Haegebarth, A., Clevers, H. Wnt signaling, lgr5, and stem cells in the intestine and skin. The American Journal of Pathology. 174 (3), 715-721 (2009).
- Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permea....
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Reimpressões e permissões
