Imagem de Proteínas Podocíticas Nephrin, Actin e Podocina com Microscopia de Expansão

Resumo

O método apresentado permite a visualização de proteínas celulares fluorescentes com microscopia de expansão levando a uma resolução de 70 nm em um microscópio convencional.

Resumo

A interrupção do filtro glomerular composto pelo endotélio glomerular, membrana glomerular do porão e podocitos, resulta em albuminúria. Os processos do pé podocyte contêm feixes de actina que se ligam a proteínas adaptadoras citoesquelletal, como a podocina. Essas proteínas adaptadoras, como a podocina, ligam a espinha dorsal do diafragma de fenda glomerular, como a nefrina, ao citoesqueleto de actina. Estudar a localização e função dessas e outras proteínas podocíticas é essencial para a compreensão do papel do filtro glomerular na saúde e na doença. O protocolo apresentado permite que o usuário visualize actina, podocina e nefrina em células com imagens de super resolução em um microscópio convencional. Primeiro, as células são manchadas com uma técnica convencional de imunofluorescência. Todas as proteínas dentro da amostra são então covalentemente ancoradas a um hidrogel inchado. Através da digestão com proteinase K, as proteínas estruturais são cortadas permitindo o inchaço isotropical do gel na última etapa. A diálise da amostra na água resulta em uma expansão de 4-4,5 vezes da amostra e a amostra pode ser imageda através de um microscópio de fluorescência convencional, tornando uma resolução potencial de 70 nm.

Introdução

Albuminúria é um parâmetro substituto de risco cardiovascular e resulta da interrupção do filtro glomerular¹. O filtro glomerular é composto do endotélio fenestrado, da membrana glomerular do porão e do diafragma cortado formado por podocitos. Processos primários e secundários de pés de podocitos envolvem a parede capilar do glomerulum². A estrutura delicada dos processos dos pés é mantida por feixes de actina cortical que também servem como âncoras para proteínas de diafragma de fenda múltipla e outras proteínas^{adaptadoras 2}. A proteína backbone do diafragma é chamada de nefrina e interage de for....

Protocolo

1. Divisão e semeadura de células

1. Aqueça o Meio de Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco, incluindo soro de bezerro fetal de 10%, soro tamponado fosfato estéril (PBS) e trippsina estéril a 37 °C. Ative o banco limpo.
2. Prepare uma placa de 6 poços adicionando um deslizamento de tampa de vidro estéril (10 mm) a cada poço usando fórceps estéreis.
3. Coloque um prato de cultura celular de 10 cm com células Cos7 sob o banco limpo. Sob o banco limpo, aspire o meio das células usando um dispositivo de vácuo.
4. Segure o prato de cultura celular angulado em uma mão e adicione 10 mL de PBS estéril ao lado do prato de cultura celular para evitar ....

Resultados

O conceito e o tempo deste protocolo proExM são retratados na Figura 1. No dia 5, as células transfeinadas são fixas e manchadas com anticorpos fluorescentes voltados para a proteína de interesse (Figura 1A,B). No dia 6, o tratamento com AcX leva à formação de grupos de amina em todas as proteínas (incluindo fluoroforos) (Figura 1A,B)¹². Após .......

Discussão

O método apresentado permite ao pesquisador visualizar proteínas celulares, por exemplo, podocina, nefrina e componentes citoesqueletal, por exemplo, F-actin. Dentro deste protocolo, as células cos7 transfectadas são usadas como modelo para estudar a interação de proteínas de diafragma cortadas com F-actin. Infelizmente, as linhas celulares podocyte imortalizadas não expressam quantidades endógenas suficientes de proteínas de diafragma cortadas¹⁹.

Com este método, as pr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acrilamida >99%	Sigma-Aldrich	A3553-100G
6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, éster succinimidílico, Acryloyl-X, SE	invitrogen	A-20770	armazenar até 4 meses
APS	Sigma-Aldrich	A3678-25G
Deckglä ser (óculos de cobertura)	Engelbrecht	K12432	24x32mm #1.0
Diamont cortador	VWR	201-0392	para cortar as lamínulas
Guanidine HCl	Sigma-Aldrich	G3272-100G	8M O estoque pode ser mantido na RT
Marten pincel de cabelo	Leon Hardy	3 (770)
"Menzel" Deckglä ser (óculos de cobertura)	Thermo Fischer	15654786	24x24mm #1.5
N,N'-Metilenbisacrilamida	Sigma-Aldrich	M7256-25G
Objektträ ger UniMark	Marienfeld	703010
Proteinase K	New England Biolabs	P8107S
	Sigma-Aldrich	408220	verifique a pureza
Bicarbonato de Sódio	Sigma-Aldrich	S5761
Câmara			produzida na oficina da universidade
TEMED	ROTH	2367.1
Placas de fundo de vidro de 6 poços	Cellvis	P06-1.5H-N
Anticorpos
Actin-ExM 546	chrometra	indisponível	1:40
Anti Podocin produzido em coelho	Sigma	P-0372-200UL	1:200
Burro anti-cobaia CF633	Sigma	SAB4600129-50UL	1:200
Cabra anti coelho 488	Life Technologies	A11034	1:1000
Cobaia anti nefrina	Origene	BP5030	1:100
Software
FIJI
Visiview
microscope
AXIO Observer Z1	Zeiss	não disponível

Acrilato de Sódio de coloração