Method Article

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abstract

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A somitogênese é uma marca registrada do desenvolvimento embrionário vertebrado. Há anos, pesquisadores vêm estudando esse processo em uma variedade de organismos usando uma ampla gama de técnicas que englobam abordagens ex vivo e in vitro. No entanto, a maioria dos estudos ainda se baseia na análise de dados bidimensionais (2D) de imagem, que limita a avaliação adequada de um processo de desenvolvimento como extensão axial e somitogênese envolvendo interações altamente dinâmicas em um complexo espaço 3D. Aqui descrevemos técnicas que permitem a aquisição de imagens ao vivo do mouse, processamento de conjunto de dados, visualização e análise em 3D e 4D para estudar as células (por exemplo, progenitoras neuromesodérmicas) envolvidas nesses processos de desenvolvimento. Também fornecemos um protocolo passo-a-passo para tomografia de projeção óptica e microscopia de imunofluorescência de montagem total em embriões de camundongos (da preparação da amostra à aquisição de imagens) e mostramos um pipeline que desenvolvemos para processar e visualizar dados de imagem 3D. Estendemos o uso de algumas dessas técnicas e destacamos características específicas de diferentes softwares disponíveis (por exemplo, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que podem ser usados para melhorar nossa compreensão atual da extensão axial e da formação de somite (por exemplo, reconstruções 3D). Ao todo, as técnicas aqui descritas enfatizam a importância da visualização e análise de dados 3D na biologia do desenvolvimento, e podem ajudar outros pesquisadores a abordar melhor os dados de imagem 3D e 4D no contexto de extensão e segmentação axial vertebrados. Por fim, o trabalho também emprega novas ferramentas para facilitar o ensino do desenvolvimento embrionário dos vertebrados.

Introduction

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A formação do eixo do corpo vertebrado é um processo altamente complexo e dinâmico que ocorre durante o desenvolvimento embrionário. No final da gastruição [no camundongo, em torno do dia embrionário (E) 8.0], um grupo de células progenitoras epiblastos conhecidas como progenitores neuromesodérmicos (NMPs) tornam-se um driver chave de extensão axial em uma sequência cabeça a cauda, gerando o tubo neural e tecidos mesodérmicos paraxial durante a formação do pescoço, tronco e cauda 1,2,3,4 . Curiosamente, a posição que esses NMPs ocupam no ep....

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Protocol

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Experimentos envolvendo animais seguiram as legislações portuguesa (Portaria 1005/92) e europeia (Diretiva 2010/63/UE) relativas à habitação, à pecuária e ao bem-estar. O projeto foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Gulbenkian de Ciência e pela Entidade Nacional Portuguesa, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (referência de licença: 014308).

1. Preparação da amostra para imagens 3D e 4D

NOTA: Aqui fornecemos uma descrição detalhada sobre como dissecar e preparar os embriões E8.25 a E10,5 para imagens vivas (1.1), E7.5 a E11,5 embriões para microscopia de imunofluorescência de montagem....

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Results

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Os resultados representativos apresentados neste artigo tanto para a imagem de imunofluorescência ao vivo quanto para a imunofluorescência, foram obtidos utilizando-se um sistema de dois fótons, com um objetivo de água de 20 × 1.0 NA, o laser de excitação sintonizado em 960 nm, e os fotodetetores GaAsP (conforme descrito em Dias et al. (2020)43. A tomografia de projeção óptica foi feita utilizando um scanner OPenT construído sob medida (como descrito em Gualda et al. (2013)28

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Discussion

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Alongamento axial e segmentação são dois dos processos mais complexos e dinâmicos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário vertebrado. O uso de imagens 3D e 4D com rastreamento unicelular tem sido aplicado, há algum tempo, para estudar esses processos tanto em embriões de zebrafish quanto de frango, para os quais as condições de acessibilidade e cultura facilitam imagens complexas 19,44,45,46,47,48,49

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Disclosures

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Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgements

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Gostaríamos de agradecer a Olivier Pourquié e Alexander Aulehla pela estirpe repórter da LuVeLu, o laboratório SunJin para a amostra de teste RapiClear, Hugo Pereira pela ajuda usando o BigStitcher, Nuno Granjeiro para ajudar a montar o aparelho de imagem ao vivo, a instalação animal do IGC e membros passados e presentes do laboratório Mallo para comentários e apoio úteis durante este trabalho.

Agradecemos o apoio técnico do Advanced Imaging Facility da IGC, que é apoiado pelo ref de financiamento português# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, co-financiado pelo Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020),....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Bagose de baixa temperatura de gelificaçãoSigmaA9414Usado para montar embriões (por exemplo, para OPT)
Software AmiraFerramenta de softwareThermofisher-Commerial
Anti-Brachyury (Cabra policlonal)R e D SistemasAF2085 RRID: AB_2200235Para imunofluorescência
Anti-Sox2 (Coelho monoclonal)Abcamab92494 RRID: AB_10585428Para imunofluorescência
Anti-Tbx6 (policlonal de cabra)Sistemas R e DAF4744 RRID:AB_2200834Para imunofluorescência
Anti-Laminina111 (Policlonal de coelho)SigmaL9393 RRID:AB_477163Para imunofluorescência
Anti-cabra 488 (Policlonal de burro)Sondas molecularesA11055 RRID:AB_2534102Para imunofluorescência
Anti-coelho 568 (Policlonal de burro)ThermoFisher   ScientificA10042 RRID:AB_2534017Para imunofluorescência
Álcool Benzílico (99+%)(qualquer)-Usado para limpar embriões (componente de BABB)
Benzoato de Benzila (99+%)(qualquer)-Usado para limpar embriões (componente de BABB)
Albumina de soro bovinoBiowestP6154Para imunofluorescência
Coverglass 20x20 mm #0(qualquer)-100um de espessura
Coverglass 20x20 mm # 1(qualquer)-170um de espessura
Coverglass 20x60 mm # 1.5(qualquer)-Para usar como " slides"
DAPI (4 ', 6-Diamidino-2- Fenilindol Dicloridrato)Life TechnologiesD3571Para imunofluorescência
Software Drishti(código aberto)-Ferramenta de software livre
EDTASigmaED2SSPara desmineralização
Software Fiji / ImageJ(código aberto)-Ferramenta de software livre
GlycineNZYtechMB01401Para imunofluorescência
HuygensScientific Volume Imaging-Commerialdesoftware
HyClone definido soro fetalbovino GE Healthcare#HYCLSH30070.03Para imagens ao vivo
Solução de peróxido de hidrogênio 30%Milipore1085971000Para limpar
o software ImarisBitplane / Oxford instruments-Ferramenta de software comercial
iSpacersSunJin Lab(varia)Use como espaçadores para preparações
L-glutaminaGibco#25030– 024Para meio de imagem ao vivo
Baixa glicose DMEMGibco11054020Para meio de imagem ao vivo
M2 meioSigmaM7167Para dissecar embriões
MetanolVWRVWRC20847.307Para etapas de desidratação e reidratação
Salicilato de metilaSigmaM6752Usado para limpar embriões
ParaformaldeídoSigmaP6148Usado em solução para fixar embriões
Penicilina-estreptomicinaSigma#P0781Para meio de imagem ao vivo
PBS (solução salina tamponada com fosfato)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52Usado para limpar embriões
Câmaras de hibridização Secure-SeaSigmaC5474Use como espaçadores para preparações
software simLabSimLabsoft-Ferramentade software comercial
Slide, depressão vidro côncavo - 75x25 mm(qualquer)-Para montar embriões grossos.
Triton X-100SigmaT8787para imunofluorescência
Software ferramenta

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

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Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

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