Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

Summary

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Abstract

O desenvolvimento adequado do cérebro mamífero depende de um bom equilíbrio de proliferação de células-tronco neurais e diferenciação em diferentes tipos de células neurais. Esse equilíbrio é fortemente controlado pela expressão genética que é ajustada em vários níveis, incluindo transcrição, pós-transcrição e tradução. Nesse sentido, um conjunto crescente de evidências destaca um papel crítico da regulação translacional na coordenação das decisões de destino das células-tronco neurais. O fracionamento polissário é uma ferramenta poderosa para a avaliação do status translacional mRNA em níveis genéticos globais e individuais. Aqui, apresentamos um pipeline de perfil de polimento interno para avaliar a eficiência translacional nas células do córtex cerebral do camundongo em desenvolvimento. Descrevemos os protocolos de preparação de gradiente de sacarose, lise tecidual, ultracentrifugação e análise baseada em fracionamento do status translacional mRNA.

Introduction

Durante o desenvolvimento do cérebro mamífero, as células-tronco neurais proliferam e se diferenciam para gerar neurônios e glia^1,2 . A perturbação desse processo pode levar a alterações na estrutura e função cerebral, como visto em muitos distúrbios neurodesenvolvimentos^3,4. O comportamento adequado das células-tronco neurais requer a expressão orquestrada de genes específicos⁵. Embora o controle epigenético e transcricional desses genes tenha sido intensamente estudado, achados recentes sugerem que a regulação genética em outr....

Protocol

Todo o uso de animais foi supervisionado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Calgary. Os camundongos CD1 usados para o experimento foram comprados de fornecedor comercial.

1. Preparação de soluções

NOTA Para evitar a degradação do RNA, pulverizar bancada e todos os equipamentos com solução de descontaminação RNase. Dicas sem RNase são usadas para o experimento. Todas as soluções são preparadas em água sem RNase.

1. Prepare a solução de estoque de cicloheximida (100 mg/mL) em DMSO e armazene a -20 °C.
2. Prepare a solução de caldo de sacarose de 2,2 M adicionando 75,3 g de sacarose....

Results

Como demonstração, o lysato cortical contendo 75 μg de RNA (agrupado de 8 embriões) foi separado pelo gradiente de sacarose em 12 frações. Picos de absorvância UV a 254 nm identificaram frações contendo a subunidade 40S, subunidade 60S, monossóis 80S e polisomáticos(Figura 4A). Análise de frações por mancha ocidental para a grande subunidade ribossômica, Rpl10 mostrou sua presença na subunidade 60S (fração 3), monossóica (fração 4) e polisomas (frações 5-12)(Figura 4B

Discussion

O perfil polimento é uma técnica comumente usada e poderosa para avaliar o status translacional nos níveis de gene único e genoma¹⁴ . Neste relatório, apresentamos um protocolo de perfil polisome utilizando uma plataforma montada em casa e seu aplicativo para analisar o córtex do mouse em desenvolvimento. Esta plataforma econômica é fácil de montar e gerar gradientes robustos e reprodutíveis de sacarose e perfil polisso com alta sensibilidade.

Vale ressaltar que a prepa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubos livres de RNA de 1,5 mL	Axygen	MCT-150-C
10 cm prato	Greiner-Bio	664160
1M MgCl2	Invitrogen	AM9530G
21-23G agulha	BD	305193
2M KCl	Invitrogen	AM8640G
seringa de 30 mL	BD	302832
Extremidade romba agulha	VWR	20068-781
Breadboard	Thorlabs	MB2530/M
Bromofenol azul	Sigma	115-39-9
Camundongo		Charles River Laboratory
Pinça de ponta curva	Sigma	#Z168785
Cicloheximida	Sigma	66-81-9
dados TracerDAQ	Computação de Medição Conversor
		Computação de Medição	USB-1208LS
Kit de minipreparação de RNA Direct-zol	Zymo	R2070
Ditiotreitol (DTT)	Bio-básico	12-03-3483
DMSO	Bioshop	67-68-5
Dumont No.5 fórceps	Sigma	#F6521
Coletor de frações	Bio-Rad	Modelo 2110
HBSS	Wisent	311-513-CL
Atuador de estágio linear	Rattmmotor	CBX1605-100A
Controle de luciferase RNA	Promega	L4561
Maxima kit de síntese de cDNA de primeira fita	Themo Fisher	M1681
V-clamp miniatura	Thorlabs	VH1/M
	Thorlabs	MSB7515/M
Poste óptico da mini-série	Thorlabs	MS2R/M
Base de suporte de poste de pedestal da mini-série	Thorlabs	MBA1
NaCl	Bio-basic	7647-14-5
Mídia neurobasal	Gibco	21103-049
Ø Poste de alumínio de 12,7 mm	Thorlabs	TRA150/M
Parafilm	Bemis	PM992
PerfeCTa SYBR fastmix verde	Quanta Bio	CA101414-274
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Wisent	311-010-CL
Puromicina	Bioshop	58-58-2
Grampo de ângulo reto	Thorlabs	RA90/M
Ângulo reto e Oslash; 1/2" para Ø Braçadeira de poste de 6 mm	Thorlabs	RA90TR/M
Rnase AWAY	Molecular BioProducts	7002
Pontas livres de RNase	Frogga Bio	FT10, FT200, FT1000
Água livre de RNase	Wisent	809-115-CL
RNasin	Promega	N2111
Suporte de ângulo reto fino	Thorlabs	AB90B/M
V-braçadeira pequena	Thorlabs	VC1 / M
Desoxicolato de sódio	Sigma	302-95-4
Driver do motor de passo	SongHe	TB6600
Sacarose	Bioshop	57501
SW 41 Ti rotor	Beckman Coulter	331362
Bomba de seringa	Harvard Aparelho	70-4500
Bomba de seringa	Harvard Apparatus	70-4500
Triton-X-100	Bio-basic	9002-93-1
Trizol	Thermofisher Scientific	15596018
Perfurador de tubo	Brandel	BR-184
Ultracentrífuga		Beckman Coulter	L8-70M
Tubos de ultracentrífuga	Beckman Coulter	331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7,5	Invitrogen	15567-027
UNO projeto super starter kit	Elegoo	EL-KIT-003
Monitor UV	Bio-Rad	EM-1 Econo
Suporte vertical	Thorlabs	VB01A/M