Method Article

Geração eficiente e escalável de astrócitos do mesencéfalo ventral humano a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

DOI:

10.3791/62095

⸱

October 2nd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um método para geração reprodutível de astrócitos com padrão de mesencéfalo ventral a partir de hiPSCs e protocolos para sua caracterização para avaliar o fenótipo e a função.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na doença de Parkinson, a disfunção progressiva e a degeneração dos neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo ventral causam sintomas que mudam a vida. A degeneração neuronal tem diversas causas no Parkinson, incluindo mecanismos autônomos não celulares mediados por astrócitos. Em todo o SNC, os astrócitos são essenciais para a sobrevivência e função neuronal, pois mantêm a homeostase metabólica no ambiente neural. Os astrócitos interagem com as células imunes do SNC, a microglia, para modular a neuroinflamação, que é observada desde os estágios iniciais do Parkinson, e tem impacto direto na progressão de sua patologia. Em doenças com um elemento neuroinflamatório crônico, incluindo Parkinson, os astrócitos adquirem um fenótipo neurotóxico e, assim, aumentam a neurodegeneração. Consequentemente, os astrócitos são um alvo terapêutico potencial para retardar ou interromper a doença, mas isso exigirá uma compreensão mais profunda de suas propriedades e papéis no Parkinson. Modelos precisos de astrócitos do mesencéfalo ventral humano para estudo in vitro são, portanto, urgentemente necessários.

Desenvolvemos um protocolo para gerar culturas de alta pureza de astrócitos específicos do mesencéfalo ventral (vmAstros) a partir de hiPSCs que podem ser usados para pesquisas de Parkinson. O vmAstros pode ser produzido rotineiramente a partir de várias linhas hiPSC e expressar marcadores astrocíticos e ventrais específicos do mesencéfalo. Este protocolo é escalável e, portanto, adequado para aplicações de alto rendimento, inclusive para triagem de drogas. Crucialmente, os vmAstros derivados de hiPSC demonstram características imunomoduladoras típicas de suas contrapartes in vivo, permitindo estudos mecanicistas de sinalização neuroinflamatória no Parkinson.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A doença de Parkinson afeta 2% a 3% das pessoas com mais de 65 anos de idade, tornando-se o distúrbio neurodegenerativo do movimento mais prevalente1. É causada pela degeneração dos neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo ventral dentro da substância negra, resultando em sintomas motores debilitantes, bem como problemas cognitivos e psiquiátricos frequentes2. A patologia de Parkinson é caracterizada por agregados da proteína α-sinucleína, que são tóxicos para os neurônios e resultam em sua disfunção e morte 1,2,3. Como os neurônios dopaminérgicos são a população degenerada no Parkinson, eles foram historicamente o foco da pesquisa. No entanto, é evidente que outro tipo de célula no cérebro, os astrócitos, também demonstram anormalidades no Parkinson e acredita-se que contribuam para a degeneração em modelos de Parkinson 4,5,6,7.

Os astrócitos são uma população de células heterogêneas que podem se transformar física e funcionalmente conforme necessário. Eles apoiam a função e a saúde neuronal por meio de uma infinidade de mecanismos, incluindo a modulação da sinalização neuronal, modelagem da arquitetura sináptica e suporte trófico de populações neuronais por meio da secreção de fatores específicos 6,8,9,10. No entanto, os astrócitos também têm um papel imunomodulador substancial, essencial para o desenvolvimento e propagação da neuroinflamação10,11. A neuroinflamação é observada no cérebro de pacientes com Parkinson e, recentemente, demonstrou prevenir significativamente o aparecimento dos sintomas de Parkinson 12,13,14,15, ocupando assim o centro do palco na pesquisa de Parkinson.

Em um nível celular, diz-se que os astrócitos se tornam reativos em resposta a lesões, infecções ou doenças, como uma tentativa de facilitar a neuroproteção 9,6,10,16. A reatividade descreve uma mudança no fenótipo dos astrócitos caracterizada por mudanças na expressão gênica, secretoma, morfologia e mecanismos de depuração de detritos celulares e subprodutos tóxicos 9,10,11,17. Essa mudança reativa ocorre em resposta a sinais indutivos da microglia, que são as células imunes do SNC e os primeiros a responder a lesões e doenças9. Tanto os astrócitos quanto a microglia respondem aos sinais inflamatórios moderando sua própria função e podem transduzir sinais inflamatórios e, assim, influenciar diretamente a neuroinflamação 9,10. No entanto, a natureza crônica do Parkinson resulta em uma transição em que os astrócitos reativos se tornam tóxicos para os neurônios e promovem degeneração e patologia da doença 6,9,10,18,19. Significativamente, foi recentemente demonstrado que o bloqueio da transformação de astrócitos no fenótipo neurotóxico reativo impede a progressão do Parkinson em modelos animais11. A reatividade dos astrócitos no paradigma da neuroinflamação tornou-se, portanto, um dos principais focos da pesquisa de Parkinson e, da mesma forma, se relaciona com um amplo espectro de doenças do SNC. Juntos, esses achados constroem um quadro de envolvimento astrocítico significativo na etiologia do Parkinson, enfatizando a necessidade de modelos de pesquisa precisos que recapitulem o fenótipo das populações de astrócitos humanos envolvidos no Parkinson.

No cérebro embrionário, os neurônios aparecem primeiro, com a linhagem astroglial, ou seja, os astrócitos e oligodendrócitos, aparecendo mais tarde no desenvolvimento6. Estudos in vivo e in vitro destacaram uma série de vias de sinalização que parecem controlar a potência das células progenitoras neurais de derivados neuronais a astrogliais. Em particular, a sinalização JAK / STAT, EGF e BMP desempenha papéis na proliferação, diferenciação e maturação da astroglia20,21. Essas vias têm sido foco de protocolos in vitro para a geração de astrócitos a partir de células pluripotentes, incluindo hiPSC 6,22,23. Houve muitos exemplos bem-sucedidos de geração de astrócitos a partir de hiPSCs 6,24,25. No entanto, é evidente que os astrócitos in vivo no SNC possuem identidades regionais específicas, que se relacionam diretamente com sua função, de acordo com os requisitos específicos desses astrócitos em relação aos seus vizinhos neuronais especializados 17,24,25,26. Por exemplo, relacionando-se especificamente com o mesencéfalo ventral, foi demonstrado que os astrócitos nesta região expressam conjuntos específicos de proteínas, incluindo receptores para dopamina que permitem a comunicação com a população local de neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo26. Além disso, os astrócitos do mesencéfalo ventral demonstram propriedades de sinalização únicas26. Portanto, para estudar o papel dos astrócitos do mesencéfalo ventral no Parkinson, precisamos de um modelo in vitro que reflita seu conjunto único de características.

Para resolver isso, desenvolvemos um protocolo para gerar astrócitos do mesencéfalo ventral (vmAstros) a partir de hiPSCs. Os vmAstros resultantes exibem características de suas contrapartes ventrais no mesencéfalo in vivo, como expressão de proteínas específicas, bem como funções imunomoduladoras. Os resultados apresentados são da diferenciação das linhagens NAS2 e AST23 hiPSC, que nos foram derivadas e doadas pelo Dr. Tilo Kunath27. O NAS2 foi gerado a partir de um indivíduo de controle saudável, enquanto o AST23 é derivado de um paciente com Parkinson portador de uma triplicação no locus que codifica a α-sinucleína (SNCA). Essas linhas hiPSC foram previamente caracterizadas e usadas em vários trabalhos de pesquisa publicados, inclusive para a geração de vários tipos de células neurais 27,28,29,30,31.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Descongelamento, manutenção e criopreservação da linha hiPSC humana

  1. Para revestir placas de cultura hiPSC, diluir a vitronectina a 5 μg/ml (1:100) em PBS a 1 ml por 10 cm de área de superfície da placa de culturade 2 células. Deixe por 1 h em temperatura ambiente.
  2. Remover a vitronectina e proceder imediatamente à adição de hiPSCs/meio à placa de cultura.
    NOTA Ao remover a vitronectina da placa, é crucial que a superfície da cultura não seque.
  3. Para descongelar os hiPSCs, remova os criogeniais contendo hiPSCs do nitrogênio líquido e coloque em banho-maria a 37 °C até que o conteúdo esteja completamente descongelado.
  4. Prepare 9 mL de meio de cultura celular pré-aquecido (por exemplo, E8 ou E8 Flex) contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell). Adicione 1 mL gota a gota ao conteúdo do criogenial. Coloque os 8 mL restantes em um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione o conteúdo diluído do criogenial.
    CUIDADO: Não triture o conteúdo.
  5. Centrifugue a 150 x g por 3 min. Aspire o líquido sem perturbar o pellet celular e ressuspenda em um volume apropriado de meio de cultura celular (por exemplo, E8 ou E8 Flex) contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell). Por exemplo, 2 mL por poço de uma placa de 6 poços.
  6. Adicione hiPSCs ressuspensos a placas revestidas com vitronectina e coloque em incubadora a 37 ° C / 5% de CO2 .
    NOTA: os hiPSCs devem começar a se ligar aos plásticos revestidos com vitronectina em 30 min-2 h após o descongelamento.
  7. Mantenha hiPSCs em meio de cultura celular (por exemplo, E8 ou E8 Flex). Alimente as células diariamente por troca de meios. Sempre pré-aqueça os meios de cultura por 30 minutos antes de alimentar.
    NOTA Se estiver usando o E8 Flex, os hiPSCs não exigem trocas de mídia a cada 24 h e os incrementos de alimentação podem ser estendidos para 48 h, se necessário. Os meios E8 Flex ou E8 produzem culturas hiPSC de alta qualidade. Os HiPSCs devem ser cultivados por no mínimo 14 dias após o descongelamento e antes de iniciar as etapas de diferenciação. Períodos de cultura inferiores a 14 dias parecem impactar negativamente a sobrevivência das hiPSCs durante o período inicial de diferenciação. HiPSCs de passagem em aproximadamente 80% de confluência (Figura 1A: intervalo de passagem de 3-4 dias).
  8. 1 h antes de começar, adicione 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell) à cultura hiPSC.
  9. Lave os hiPSCs uma vez com PBS (sem cálcio ou magnésio) e adicione 0,5 mM de EDTA (diluído do estoque em PBS sem cálcio ou magnésio).
  10. Incube por 5 min em temperatura ambiente ou até que os hiPSCs comecem a se desprender uns dos outros e adquiram uma aparência mais arredondada, com os limites de cada iPSC parecendo mais brilhantes sob um microscópio de campo claro.
  11. Adicione 200 μL de EDTA a uma área focada dos hiPSCs com uma pipeta. Se eles se desprenderem prontamente, criando um espaço livre na camada de células, estarão prontos para serem colhidos. Se eles não se soltarem facilmente, deixe em EDTA e repita após 1 min.
  12. Quando estiver pronto para prosseguir, remova suavemente o EDTA e, usando uma pipeta, lave suavemente os hiPSCs duas vezes com meio de cultura celular (por exemplo, E8 ou E8 Flex).
    NOTA: Para conseguir isso sem que os hiPSCs se soltem, incline a placa e adicione a mídia gota a gota na lateral da placa de cultura.
  13. Para colher hiPSCs, use 1 mL de meio de cultura de células (por exemplo, E8 ou E8 Flex) contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell). Solte a mídia diretamente na camada hiPSC e as células devem se soltar. Se necessário, repita com outro meio de 1 mL.
  14. Veja os hiPSCs ao microscópio. Idealmente, os hiPSCs devem aparecer em clusters relativamente uniformes, conforme mostrado na Figura 1B. Se os clusters hiPSC forem muito maiores ou muito variáveis em tamanho, use a pipeta para quebrar os clusters hiPSC maiores (Figura 1B).
    NOTA: Não triture demais os hiPSCs. Embora o suplemento aumente a sobrevivência celular global, a trituração excessiva impacta negativamente na sobrevivência da cultura de hiPSC. Recomenda-se 1-4 passagens com uma pipeta.
  15. Usando uma pipeta sorológica, transfira a suspensão hiPSC para uma placa revestida com vitronectina, conforme preparado na etapa 1.1. Retorne a cultura hiPSC para a incubadora 37 °C/5% CO2 .
    NOTA: Criopreserve hiPSCs em aproximadamente 80% de confluência.
  16. 1 h antes de começar, adicione 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell) à cultura hiPSC.
  17. Separe os hiPSCs das placas de cultura usando EDTA 0,5 mM conforme descrito na etapa 1.4, coletando células em meio de cultura celular (por exemplo, E8 ou E8 Flex) contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell). Centrifugue a 150 x g por 3 min.
  18. Ressuspenda hiPSCs peletizados em meios de congelamento de células (consulte Tabela de Materiais). Use 700 μL por 10 cm2 de área de cultura, equivalente a 1 criogenia de células por poço de uma placa de 6 poços.
  19. Transfira criogenials para um recipiente de congelamento de células apropriado (para obter detalhes, consulte a Tabela de Materiais).
  20. Transferir o recipiente de congelação para um congelador a -80 °C durante 24 h. Após 24 h, os criogenianos podem ser transferidos para nitrogênio líquido (-196 °C) para armazenamento de longo prazo.

2. Protocolo de diferenciação vmAstro

NOTA: Um resumo esquemático do protocolo de diferenciação vmAstros é mostrado na Figura 1A. Uma lista detalhada dos reagentes necessários para o protocolo e sua preparação é fornecida na Tabela 1.

  1. Indução de vmNPCs
    NOTA: Este protocolo foi otimizado para começar com um mínimo com 1x poço de uma placa de 6 poços (10 cm2) de hiPSCs 70% -80% de confluência, que é aproximadamente 4-5 x 104 células / cm2 (Figura 1B) 30. O número e a densidade da célula inicial devem ser otimizados para cada linha hiPSC, pois afetam significativamente a sobrevivência e a eficiência de diferenciação.
    1. Remova o meio de cultura celular dos hiPSCs e lave 3x em DMEM/F12 + glutamax. Substitua o meio por 2 mL de meio de indução vmNPC (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre a preparação de meios e reagentes).
    2. Alimente em dias alternados com meia troca de meio após 24 h e uma troca completa de meio em 48 h.
      NOTA: Após 3-4 dias, a cultura vmNPC exigirá passagem. Recomenda-se uma taxa de passagem padrão de 1:3 ou 1:4 - isso precisa ser otimizado para cada linha hiPSC usada.
    3. 1 h antes da passagem, adicione 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell) aos vmNPCs e prepare 1x plástico de cultura de tecidos revestido com matriz de membrana basal (por exemplo, Geltrex) (seção 2.2 Preparando matriz de membrana basal e revestindo plástico de cultura de rissue).
    4. Remova a mídia dos vmNPCs e lave 2x com D-PBS. Adicione 1 mL de solução de descolamento de células pré-aquecida (por exemplo, Accutase) por 10 cmde 2 áreas de cultura (1 mL por alvéolo de uma placa de 6 poços).
    5. Colocar a 37 °C durante 1 min e, em seguida, examinar os vmNPCs utilizando um microscópio de contraste de fase.
      NOTA: Os vmNPCs começarão a arredondar, seus processos se retrairão e lacunas aparecerão na camada de células. Isso pode levar de 1 a 3 minutos, dependendo da densidade celular.
    6. Quando os vmNPCs assumirem essa aparência, adicione 100 μL de solução de descolamento celular (por exemplo, Accutase) à camada de vmNPCs.
      NOTA: Se os vmNPCs estiverem prontos para serem desanexados, um orifício na camada de célula aparecerá. Se isso não acontecer, os vmNPCs exigirão mais incubação com solução de desprendimento de células.
    7. Se os vmNPCs se desconectarem prontamente, remova cuidadosamente a solução de descolamento celular e lave os vmNPCs 2x com meio N2B27. Adicione o meio N2B27 suavemente na lateral do poço ou vaso de cultura e gire suavemente para lavar, garantindo que os vmNPCs não se soltem.
      NOTA: Esta etapa deve ser concluída rapidamente para garantir que os vmNPCs não se reconectem à superfície da célula. Se os vmNPCs começarem a se soltar nas etapas de lavagem, colete por centrifugação a 150 x g por 3 min. Os vmNPCs não são centrifugados como padrão durante a passagem, pois isso pode reduzir sua sobrevivência.
    8. Finalmente, remova os vmNPCs usando uma pipeta, ejetando vigorosamente o meio de indução vmNPC contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell) diretamente na camada celular. Isso deve remover vmNPCs, que podem ser transferidos diretamente para os novos vasos de cultura revestidos com matriz.
      NOTA: Não reutilize mídia que já contenha vmNPCs ressuspensos para remover outras células, pois isso resultará em sua trituração excessiva, o que reduz sua sobrevivência.
    9. Substitua em incubadora de CO37 °C/5% 2. Os vmNPCs devem começar a se fixar na superfície revestida com matriz após 20-30 min. Substitua metade do meio por meio de indução vmNPC fresco (sem suplemento celular) após 24 h e continue o esquema de alimentação como antes.
    10. Continue o regime de alimentação e passagem por 10 dias.
  2. Preparação da matriz da membrana basal e revestimento de plástico de cultura de tecidos
    NOTA: Para manter vmNPCs, 1x matriz de membrana basal (por exemplo, Geltrex) é usada para revestir plásticos. Para manter vmAPCs ou vmAstros, pode-se usar matriz de membrana basal de 0,25x.
    1. Remova o estoque da matriz da membrana do porão de um freezer a -80 ° C e coloque em uma geladeira a 4 ° C durante a noite para descongelar.
    2. Diluir 1:10 com DMEM/F12 gelado + glutamax, alíquota e armazenar a -80 °C como um estoque de 10x.
    3. Ao revestir plásticos, dilua este estoque de 10x para 1x (para vmNPCs) ou 0,25x (para vmAPCs ou vmAstros) com DMEM/F12 gelado + glutamax.
    4. Adicione imediatamente ao plástico de cultura de tecidos a 1 mL por 10 cm2, por exemplo, 1 mL por poço de uma placa de 6 poços.
    5. Colocar a 37 °C durante 1 h. A solução de matriz de membrana basal não deve ser removida do material plástico até que esteja pronta para adicionar mídia/células para garantir que o material plástico revestido não seque. As placas revestidas com matriz não requerem lavagem antes de adicionar células.
  3. Expansão de vmNPCs
    1. No dia 10 do protocolo, substitua o meio de indução por meio de expansão vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + ácido ascórbico. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre a preparação de meios e reagentes).
      NOTA: Os vmNPCs não requerem a adição de mitógenos para induzir a proliferação. BDNF, GDNF e ácido ascórbico suportam a sobrevivência e manutenção de vmNPCs30.
    2. Alimente em dias alternados com meia troca de meio após 24 h e uma troca completa de meio em 48 h.
      NOTA: Após 3-4 dias, a cultura vmNPC exigirá passagem. Para passagem, recomenda-se uma taxa de passagem padrão de 1:3 ou 1:4 (isso precisa ser otimizado para cada linha hiPSC usada. Determine a proporção que fornece a melhor sobrevivência, proliferação e geração de vmNPCs).
    3. 1 h antes da passagem, adicione 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell) aos vmNPCs e prepare 1x placas/frascos revestidos com matriz com antecedência (seção 2.2 Preparando a matriz da membrana basal e revestindo o plástico de cultura de reedição). Pré-aqueça a solução de descolamento celular (por exemplo, Accutase) a 37 °C. Pré-aqueça o meio de expansão vmNPC fresco contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell).
    4. Remova a mídia dos vmNPCs e lave 2x com D-PBS. Adicione 1 mL de solução de descolamento de células (por exemplo, Accutase) por 10 cm2 de área de cultura (1 mL por alvéolo de uma placa de 6 poços). Colocar a 37 °C durante 1 min e, em seguida, examinar os vmNPCs utilizando um microscópio de contraste de fase.
      NOTA: Os vmNPCs começarão a arredondar, seus processos se retrairão e lacunas aparecerão na camada de células. Isso pode levar de 1 a 3 minutos, dependendo da densidade celular.
    5. Quando os vmNPCs assumirem uma aparência arredondada, adicione 100 μL de solução de descolamento celular (por exemplo, Accutase) à camada de vmNPCs.
      NOTA: Se os vmNPCs estiverem prontos para serem desanexados, um orifício na camada de célula aparecerá. Se isso não acontecer, os vmNPCs exigirão mais incubação com a solução de desprendimento de células.
    6. Se os vmNPCs se desprenderem prontamente, remova cuidadosamente a solução de descolamento celular e lave os vmNPCs 2x com mídia N2B27. Adicione o meio N2B27 suavemente na lateral do poço ou vaso de cultura e gire suavemente para lavar, garantindo que os vmNPCs não se soltem.
      NOTA: Se os vmNPCs começarem a se desprender em grande número nas etapas de lavagem, colete por centrifugação a 150 x g por 3 min. Os vmNPCs não são centrifugados como padrão durante a passagem, pois isso pode reduzir sua sobrevivência. Esta etapa deve ser concluída rapidamente para garantir que os vmNPCs não se reconectem à superfície da célula.
    7. Remova os vmNPCs usando uma pipeta e ejete vigorosamente o meio de expansão vmNPC contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell) diretamente na camada celular. Isso deve remover vmNPCs, que podem então ser transferidos diretamente para as placas/frascos revestidos com matriz pré-preparada (consulte a seção 2.2 'Preparação da matriz da membrana basal e revestimento de plástico de cultura de tecidos').
      NOTA: Não reutilize mídia que já contenha vmNPCs ressuspensos para remover outras células, pois isso resultará em sua trituração excessiva, o que reduz sua sobrevivência.
    8. Substitua em incubadora de CO37 °C/5% 2. Os vmNPCs devem começar a se fixar na superfície revestida da matriz após 20-30 min. Após 24 h, substitua metade do meio de cultura por meio de expansão vmNPC novo (sem suplemento celular) e continue o esquema de alimentação anterior.
    9. Continue este regime de alimentação e passagem por 10 dias. vmNPCs podem ser expandidos até o dia 50.
  4. Diferenciação e expansão de vmAPCs
    NOTA: vmNPCs podem ser usados com sucesso para a geração de vmAPCs/vmAstros em qualquer lugar entre 30 e 50 dias a partir do estágio inicial do hiPSC (Figura 1A).
    1. Pegue uma cultura vmNPC confluente e lave vmNPCs 3x em DMEM/F12 avançado para remover vestígios dos componentes da mídia de expansão vmNPC. Substitua a mídia por mídia de expansão vmAPC (mídia ASTRO +EGF +LIF. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre a preparação de meios e reagentes).
    2. Após 72 h de passagem, a cultura vmNPC está em alta proporção (1:7,5). Por exemplo, supondo que os vmNPCs fossem mantidos em um único poço de uma placa de 6 poços, eles agora deveriam ser passados para um frasco de 75 cm2 revestido com matriz 1x (revestido conforme descrito na seção 2.2 'Preparação da matriz da membrana basal e revestimento do plástico de cultura de tecidos'). Passagem usando solução de desprendimento de células, conforme descrito para vmNPCs na seção 2.3 'Expansão de vmNPCs'.
    3. Ressuspenda os vmNPCs em um volume apropriado de mídia de expansão vmAPC (mídia de 7,5-15 mL por frascode 75 cm 2 . Mudanças completas de mídia a cada 3 dias ou conforme as células exigirem.
      NOTA: Deste ponto em diante, vmNPCs são chamados de vmAPCs e devem ser passados como células únicas em vez de clusters de células. vmAPCs devem ser passados a cada 3-7 dias ou à medida que se tornam confluentes para evitar se tornarem excessivamente confluentes. Deste ponto em diante, a concentração reduzida de matriz 0,25x deve ser usada para revestir artigos plásticos (conforme descrito na seção 2.2 Preparando a matriz da membrana basal e revestindo o plástico de cultura de tecidos).
    4. Expanda os vmAPCs até atingirem o dia 90 (a partir do estágio hiPSC), crioprindo vmAPCs em vários pontos de sua expansão.
  5. Geração de vmAstros maduros a partir de vmAPCs
    NOTA: Nesta fase, os vmAPCs podem ser cultivados em frascos de cultura de tecidos de 175 cm2 . Isso pode ser expandido para a geração de um grande número de vmAstros maduros.
    1. Quando os vmAPCs atingirem 80% de confluência, lave 3x com meio ASTRO e substitua por meio de maturação vmAstros (meio ASTRO +BMP4 +LIF. Consulte a Tabela 1 para obter detalhes sobre a preparação de meios e reagentes).
    2. Realize uma troca completa de mídia a cada 3 dias, ou conforme as células exigirem, por 10 dias.
      NOTA: a) Neste ponto, a caracterização indica que os vmAstros estão maduros, conforme confirmado pela imunocitoquímica (Figura 2G - I) e pela análise da expressão gênica (manuscrito em preparação). b) Os vmAstros usados imediatamente após a maturação devem ser replaqueados em uma superfície revestida com matriz recém-preparada. Manter vmAPCs ou vmAstros na mesma superfície de cultura por mais de 14 dias pode levar a culturas abaixo do ideal, onde as células começam a diminuir de tamanho e até se desprendem. c) Para aplicações que examinam a modulação neuroinflamatória, BMP e LIF são removidos 72 h antes da estimulação neuroinflamatória. Isso evita qualquer interação potencial entre a sinalização BMP/LIF e a sinalização neuroinflamatória induzida.
    3. O vmAstros agora pode ser replaqueado para ensaios experimentais, por exemplo, em lamínulas para imunocitoquímica ou criopreservado para aplicações futuras (seções 3, 4).
      NOTA: A passagem não deve ser necessária nesta fase do protocolo, pois a proliferação só deve ocorrer a uma taxa muito baixa. vmAPCs plaqueados muito densamente nesta fase mantêm níveis mais altos de proliferação. Se for esse o caso, passe e divida as células para atingir uma densidade como mostrado na Figura 1F.

3. Criopreservação de vmNPCs, vmAPCs e vmAstros

NOTA: Criopreserve vmNPCs/vmAPCs/vmAstros em plena confluência.

  1. 1 h antes de começar, adicione 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell) à cultura. Encha o recipiente de crioarmazenamento (consulte a Tabela de Materiais) com isopropanol à temperatura ambiente.
  2. Separe as células das placas de cultura usando solução de descolamento celular conforme descrito anteriormente, coletando células em meios apropriados (N2B27 ou ASTRO meio) contendo 1x suplemento celular (por exemplo, Revitacell). Centrifugue a 150 x g por 3 min.
  3. Ressuspenda os volumes vmNPCs/vmAPCs/vmAstros peletizados em meios de congelamento de células (consulte a Tabela de Materiais) da seguinte forma (etapas 3.3.1. - 3.3.3.)
    1. Para vmNPCs: use 700 μL por 10 cm2 de área de cultura, em 1 criovial.
    2. Para vmAPCs: usar 700 μL por área de cultura de 60 cm2 , em 1 criovial (aproximadamente 1/3 de um frasco de cultura T175).
    3. Para vmAstros: ressuspenda em 2 mL de mídia e conte o número de vmAstros. Centrifugue novamente e ressuspenda em meios de congelamento de células (consulte Tabela de Materiais) em um número por criovio apropriado para aplicações futuras. Assumindo uma perda celular aproximada de 15% devido ao congelamento e descongelamento, os vmAstros recém-descongelados são contados e revestidos com um número de células excedente de 15% para compensar a morte celular no processo de congelamento e descongelamento. Isso equivale, portanto, a 74.750 vmAstros por cm2. Os vmAstros descongelados são mantidos por 72 h em meio ASTRO antes do ensaio.
  4. Transferir os criogenianos para um recipiente de congelação de células (para mais pormenores, ver Tabela de Materiais) e transferir o recipiente de congelação para um congelador a -80 °C durante 24 h. Após 24 h, os criogenianos podem ser transferidos para nitrogênio líquido (-196 °C) para armazenamento de longo prazo.

4. Caracterização do fenótipo vmAstro

  1. Imunocitoquímica
    1. Coloque 100-200 lamínulas de vidro de 13 mm em placas de Petri de vidro sobre uma camada de papel de filtro e esterilize-as em uma autoclave seca.
    2. Transfira as lamínulas para poços de placas de 4 ou 24 poços usando uma pinça estéril. Adicione 1x solução de matriz (por exemplo, Geltrex) nas lamínulas como gotículas de 50 μL e incube a 37 ° C por 1 h.
    3. Passe ou descongele vmAstros, ressuspenda em mídia ASTRO e faça uma contagem. Placa vmAstros a 25-100.000 células por lamínula em uma gota de 50 μL.
    4. Remova a matriz da lamínula e adicione imediatamente vmAstros em uma gota de mídia. Coloque a 37 °C por 30 min e, em seguida, inunde os poços com um meio ASTRO adicional de 250 μL.
      NOTA: Se estiver realizando imunocitoquímica para simplesmente verificar a expressão de marcadores de astrócitos e mesencéfalos, o vmAstros pode ser corrigido 24 h após o plaqueamento.
    5. Prepare a solução de formaldeído a 4% diluindo a solução de formaldeído a 36% 1:9 em D-PBS.
    6. Lave vmAstros 1x com D-PBS. Adicione imediatamente 4% de formaldeído aos poços e deixe em temperatura ambiente por 10 min.
    7. Remova o formaldeído e substitua por D-PBS. Armazene a 4 °C ou prossiga para a imunocitoquímica.
    8. Lave as lamínulas nos poços 3x com D-PBS. Permeabilize e bloqueie em soro de cabra a 10%, BSA a 1% em PBTx a 0,1% (D-PBS + Triton-X 1:1000) por 1 h em temperatura ambiente.
    9. Adicione anticorpos primários (Tabela de Materiais) em soro de cabra a 1%, BSA a 0,1% em PBTx a 0,1% (D-PBS + Triton-X 1:1000) e incube durante a noite a 4 °C em um balancim.
    10. No dia seguinte, remova os anticorpos primários e lave as lamínulas 3x com D-PBS.
    11. Adicione anticorpos secundários apropriados (Tabela de Materiais) em soro de cabra a 1%, BSA a 0,1% em PBTx a 0,1% e incube por 1-2 h em temperatura ambiente e proteja-o da luz em um balancim. Lave as lamínulas 3x com D-PBS.
    12. Adicione a solução de DAPI (0,1 μg/mL de DAPI em D-PBS) e incube à temperatura ambiente durante 10 min. Lave as lamínulas 3x com D-PBS.
    13. Para montar a lamínula, adicione uma gota de 5 μL de mídia de montagem Mowiol / DABCO [12% Mowiol (p / v), 12% de glicerol (p / v) dissolvido durante a noite agitando em 0.2 M Tris (pH 8.5) com 25 mg / mL 1,4-diazabicilo [2.2.2] octano (DABCO)] a uma lâmina de microscópio de vidro. Usando uma pinça, remova cuidadosamente a lamínula do poço; Passe a borda da lamínula no tecido para remover o excesso de líquido e coloque o lado vmAstros voltado para baixo na gota Mowiol/DABCO.
    14. Repetir para cada lamínula e deixar secar durante 8 h antes do exame microscópico.
  2. Medição ELISA da secreção de IL-6 de vmAstros em resposta ao tratamento com citocinas
    NOTA: Após a maturação de 10 dias com BMP4 e LIF, os vmAstros devem ser passados, contados e plaqueados em material plástico de cultura de tecidos revestido com matriz 0,25x (conforme detalhado em Seção 2.2Preparação da matriz da membrana basal e revestimento de plástico de cultura de tecidos), a uma densidade de 65.000 vmAstros por cm2 na mídia ASTRO. BMP4 e LIF devem ser removidos do vmAstros 72 h antes do tratamento com citocinas, pois a sinalização ativa desses fatores pode interferir na eficácia do tratamento com citocinas. Alternativamente, vmAstros criopreservados podem ser descongelados e usados para ensaios.
    1. No dia do ensaio, lavar suavemente vmAstros 3x em meio não redox (DMEM/F-12 + glutamax + N2).
    2. Use um controle não tratado e bem tratado com citocinas para comparação. Adicione a citocina escolhida na concentração otimizada. Os dados da Figura 2J - L foram gerados usando IL-1α a 3 ng/mL9 em meio não redox a 1 mL por 10 cm2 de área de cultura de células.
    3. Substitua vmAstros em incubadora de 37 °C/5% CO2 por 24 h. Após 24 h, recolher os meios de cultura para tubos de microcentrífugas estéreis.
    4. Se o ELISA não for realizado imediatamente, encaixe as amostras de mídia congelada submergindo tubos de microcentrífuga em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C para análise futura.
      NOTA: O protocolo a seguir é otimizado especificamente para uso com o kit IL-6 ELISA detalhado na Tabela de Materiais. Anticorpos e padrões fornecidos como pó liofilizado em um novo kit ELISA devem ser reconstituídos antes do primeiro uso e aliquotados para uso futuro. A ficha técnica fornecida com o kit detalha os reagentes e volumes necessários para a reconstituição. O anticorpo de captura deve ser reconstituído em PBS (sem proteína transportadora).
    5. Realize o ELISA em formato de placa de 96 poços e calcule os volumes de reagentes de acordo com os poços utilizados. No dia do ELISA, prepare o anticorpo de captura diluindo o estoque 1:120 em PBS. Cubra a placa carregando 50 μL de anticorpo de captura por alvéolo. Cubra a placa com uma fita adesiva e incube em temperatura ambiente durante a noite.
    6. No dia seguinte, lave a placa 3x com D-PBS-Tween (D-PBS com 0,05% Tween-20), 100 μL por poço. Seque.
    7. Bloqueie a placa carregando 150 μL D-PBS/1% BSA por poço. Incubar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 1 h. Lave a placa conforme descrito.
    8. Descongele as amostras no gelo (isso pode levar de 1 a 2 horas). Dilua as amostras 1:5 carregando 10 μL de amostra e 40 μL DE D-PBS/1% de BSA. Vórtice cada amostra antes do carregamento.
      NOTA: É necessário diluir as amostras ao realizar um ELISA de IL-6, as diluições devem ser otimizadas.
    9. Prepare o padrão superior (1.000 ρg/mL) diluindo o estoque 1:180 em D-PBS/1% BSA. Prepare 7 padrões realizando uma diluição em série do padrão superior. Vórtice entre cada diluição.
    10. Adicione 50 μL de padrões/amostras aos poços. Use D-PBS/1% BSA como o espaço em branco. Incubar à temperatura ambiente durante 2 h num agitador orbital para misturar adequadamente as amostras diluídas. Lave a placa conforme descrito.
    11. Preparar o anticorpo de detecção diluindo o estoque 1:60 em D-PBS/1% BSA. Carregue 50 μL de anticorpo de detecção por poço. Cubra a placa e incube em RT por 2 h. Lave a placa conforme descrito.
    12. Prepare estreptavidina conjugada à peroxidase de rábano (Strep-HRP) diluindo o estoque 1:40 em D-PBS / 1% BSA. Carregue 50 μL de Strep-HRP por poço e incube em temperatura ambiente por 20 min no escuro. Lave a placa conforme descrito.
    13. Inicie a reação de cor carregando 50 μL de solução de substrato TMB por poço. Incube em temperatura ambiente no escuro por 20 min (ou até que os padrões e amostras desenvolvam uma cor azul).
      NOTA: O TMB é armazenado a 4 °C, mas deve ser usado em temperatura ambiente.
    14. Pare a reação adicionando 25 μL de solução de parada (1 M, H,2, SO,4) por poço e observe a mudança de cor de azul para amarelo.
    15. Ler a placa a 450 nm de absorbância utilizando um leitor de microplacas. Defina a correção de comprimento de onda para absorbância de 540 nm para maximizar a precisão. Calcular as concentrações de proteínas nas amostras a partir da curva-padrão produzida.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia de diferenciação e progressão
Aqui apresentamos os detalhes de ambos os métodos empregados para a geração de vmAstros e os protocolos utilizados para sua posterior caracterização fenotípica. O método de geração de vmAstros é composto por vários estágios distintos de diferenciação, que podem ser monitorados por microscopia e identificar características morfológicas distintas (Figura 1A-F). Uma cultura de hiPSC livre de alimenta...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este método para a geração de vmAstros a partir de hiPSCs é altamente eficiente, gerando culturas puras de vmAstros, e sendo reprodutível para a geração de vmAstros a partir de diferentes linhagens de hiPSC. Este protocolo foi desenvolvido em torno da recapitulação dos eventos de desenvolvimento necessários no embrião para padronizar corretamente o mesencéfalo em desenvolvimento e gerar astrócitos e compreende três estágios definidos: 1) indução do mesencéfalo ventral neural para gerar v...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado por uma bolsa de projeto do Parkinson's UK (G-1402) e bolsa de estudos. Os autores agradecem ao Wolfson Bioimaging Facility por seu apoio e assistência neste trabalho.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagentes
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)n/an/aFeito de base Tris e mais HCl
0.5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 em D-PBS para 0,5 mM final 
1,4-diazabicylo[2.2.2]octano (DABCO)SigmaD27802-  25 mg/mL em solução de montagem Mowiol
lamínulas de 13 mmVWR631-0149
2-Mercaptoetanol (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010Tem 1x NEAA mas adicionamos à concentração final de 2x (0,2 mM)
Ácido ascórbicoSigmaA5960Estoque de 200 mM, 1:1000 a 200 µ Suplemento M final
B27ThermoFisher17504-04450x estoque
BSASigma5470
Mídia de congelamento de célulasSigmaC2874Cryostor CS10
Vaso de congelamento de célulasNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem1386Estoque de 0,8 mM, diluição de 1:1000 para 0,8 µ M final
Cryovials  SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL, 1:10.000 a 100ng/mL final (em PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS sem Mg ou Ca)ThermoFisher14190144pH 7,2
E8 Flex kit médioThermoFisherA2858501
Formaldeído (solução a 36%)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 ou 1:400 em DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher35050038estoque de 2 mM (1:200 em N2B27, 1:100 em meio ASTRO para 20 µ M final) 
GlicerolSigmaG5516
BDNF Humano Peprotech450-0220 µ estoque de g/mL, 1:1000 a 20 ng/mL final
BMP4 humanoPeprotech120-0520 µ estoque de g/mL, 1:1000 a 20 ng/mL final
EGF HumanoPeprotechAF-100-1520 µ g/mL estoque, 1:1000 a 20 ng/mL final
GDNF HumanoPeprotech450-1020 µ g/mL estoque, 1:1000 a 20 ng/mL solução final
insulina humanaSigma I927810 mg/mL estoque, 1:2000 a 5 µ g/mL final
HumanoLIF Peprotech300-0520 µ g/mL estoque, 1:1000 a 20 ng/mL kit
final IL-6 ELISABiotechneDY206
IsopropanolSigma  I9516-4LPara encher o recipiente de crioarmazenamento Mr Frosty
LDN193189SigmaSML0559100 µ Estoque M, diluição 1:10.000 para 10 nM final
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 SuplementoThermoFisher17502048estoque 100x
NEAAThermoFisher11140035estoque 10 mM, 1:100 a 0,1 mM final 
Mídia neurobasalThermoFisher21103049
Soro de cabra normalVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501estoque de 100x, 1:100 a 1x
SB431542Tocris1614estoque de 10 mM, diluição de 1:1000 a 10 µ M final
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 µ estoque de g/mL, 1:1000 a 200 ng/mL final
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20Sigma P7949
VitronectinaThermoFisherA147001:50 em D-PBS
Anticorpos para imunocitoquímica  <strong>CompanyNúmero de catálogo<strong>Espécie hospedeira
Anticorpo contra S100bSigmaSAB4200671Mouse; 1:200
Anticorpo contra FOXA2SCBTNB600501Mouse; 1:50
Anticorpo contra LMX1AProSci7087Rabbit; 1:300
Anticorpo contra LMX1AMilliporeAB10533Coelho; 1:2000
Anticorpo contra LMX1BProteintech18278-1-APCoelho; 1:300
Anticorpo contra GLASTProteintech20785-1-APCoelho; 1:300
Anticorpo contra GFAPDakoZ0334Coelho; 1:400
Anticorpo contra CD49fProteintech27189-1-APCoelho; 1:100
Anticorpo contra MSI1Abcamab52865Coelho; 1:400
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-Coelho ThermoFisherA32731Cabra; 1:500
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-RatoThermoFisherA32723Cabra; 1:500
Alexa Fluor 568 Cabra Anti-CoelhoThermoFisherA11036Cabra; 1:500
Alexa Fluor 488 Cabra Anti-RatoThermoFisherA11031Cabra; 1:500
gelado de final

References

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