Summary
Yenidoğan kardiyak makrofaj ayırma ve yetişkin bir fare kalbine transplantasyon için bir protokol sunuyoruz, bu da kalp onarımını teşvik etmenin umut verici bir yolu olabilir.
Abstract
Yaralı bir yenidoğan miyokardında makrofajlar kardiyomiyosit çoğalmasını ve anjiogenezini kolaylaştırır ve kalp yenilenmesini teşvik eder. Bu çalışma, yaralanma ile işe alınan yenidoğan kardiyak makrofajların naklinin, kardiyak fonksiyonun ve kardiyomiyosit çoğalmasının iyileştirilmesi ile miyokard enfarktüsünden sonra yetişkin kalp yenilenmesini desteklediğini ortaya koymaktadır. Sonuçlar, yenidoğan kardiyak makrofaj naklinin kardiyak yaralanma tedavisi için umut verici bir strateji olabileceğini göstermektedir. Burada, apikal rezeksiyonlu yenidoğan fare kalplerinden yenidoğan kardiyak makrofajların izolasyonu, makrofajların miyokard enfarktüslü yetişkin farelere nakli ve makrofaj greftinden sonra kalp yenilenmesinin tahmin edilmesi gibi teknik ayrıntıları sunuyoruz.
Introduction
Kalp yenilenmesi, kardiyak yaralanmadan sonra kardiyak fonksiyonu kurtarmak ve kalp yetmezliğine karşı korumak için umut verici bir stratejidir1,2,3. Miyokard yaralanmasının ardından, makrofajlar yaralı kalbe sızar ve yenidoğan kalp yenilenmesi sırasında anahtar faktörler olarak araştırılmıştır4,5,6. Makrofajlar, nekrotik hücresel kalıntıları temizlemenin ve inflamasyonu indüklemenin yanı sıra, yenidoğan fareleri miyokard enfarktüsünden sonra anjiogenez5 ve kardiyomiyosit çoğalmasını7'yi teşvik eder.
Önceki çalışmamız, yaralı yenidoğan kalbinden izole edilen yenidoğan kardiyak makrofajların naklinin yetişkin kalp yenilenmesini artırdığını göstermektedir7Yenidoğan kardiyak makrofaj naklinin kardiyak yaralanmayı tedavi etmek için umut verici bir strateji olabileceğini göstermektedir. Burada, apikal rezeksiyonlu yaralı yenidoğan fare kalplerinden yenidoğan kardiyak makrofajların izolasyonu, makrofajların miyokard enfarktüslü yetişkin farelere nakli ve makrofaj greftinden sonra kalp yenilenmesinin tahmini de dahil olmak üzere teknik ayrıntıları sunuyoruz (Şekil 1).
Protocol
Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçek yapılmıştır. Tüm hayvan protokolleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Fuwai Hastanesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi tarafından onaylandı. Cerrahi bölgenin kirlenmesini önlemek için işlem boyunca aseptik teknik gereklidir.
1. Yenidoğan 1 günlük Cx3cr1 GFP/+ farede apikal rezeksiyon işlemi(C57BL/6 arka plan)
- Anestezi
- Tüm fare yavrularını kafeslerden çıkar ve temiz bir kuru kutuya koy.
- Her fareyi yaklaşık 2-3 dakika boyunca buza gömün. Donma önlemek için buz ve fare yavrusu arasında lateks veya gazlı bez gibi ince bir bariyer olduğundan emin olun.
- Aşağıdaki belirtiler için gözlemleyerek yeterli anesteziyi tanımlayın: soluk cilt, uzuv hareketi eksikliği ve pedal refleksi eksikliği.
- Torakotomi
- Anestezinin korunmasına yardımcı olmak için bronz çalışma platformunu bir gecede -20 °C'de ön soğutma.
- Uyuşturulmuş fareyi buz kutusundan çıkar ve bronz bir çalışma platformuna koy. Fareyi tıbbi yapışkan bant kullanarak çalışma platformuna destek konumunda tutturun.
- Üzerinde fare olan işletim platformunu stereoskop altına koyun.
- Fare göğsünü betadin ve% 70 alkolle ıslatılmış bir hazırlık pedi kullanarak veya kurumsal politikaya uygun olarak dezenfekte edin.
- Göğüs boşluğunun dördüncü interkostal bölgesinde 1 cm'lik bir kesikle cildi inklüzyüne edin ve ardından kalbe erişilene kadar mikrocerrahi makas kullanarak interkostal kasları ayırın.
- Alternatif olarak, kalp herhangi bir mekanik hasar olmadan göğüs dışına çıkana kadar iki yabanarı yardımıyla göğsüne ve karnına bastırın.
- Kaburgaları kalbi hareketsiz hale getirmek için doğal bir fiksasyon olarak küçük kesiğin altına ve üstüne ayarlayın.
- Ventrikül apeks rezeksiyonu
- Sol ventrikülün tepesini bulun. Stereoskop altında iridektomi makası kullanarak 1 mm çapında ventriküler apeks doku kesin.
- Sol ventrikül odasının açıkta olduğunu onaylayın ve sızmaya başlayın.
- Pamuklu çubuk kullanarak kalbi yavaşça göğüs boşluğuna geri bastırın.
- 8-0 kullanarak kasları, kaburgaları ve cildi dikin Prolene dikişler.
- İşlemden sonra fareyi iyice temizleyin.
- Ameliyat sonrası bakım
- Operasyondan hemen sonra vücudu ısıtmak için fareyi çalışma platformundan 37 °C ısıtma battaniyesine aktarın.
- Aşağıdaki belirtileri gözlemleyerek farenin anabiyozunu onaylayın: spontan solunum restorasyonu, ten rengi soluktan pembeye ve uzuvların hareketi.
- Ameliyat edilen fareyi iyileştikten sonra annesine geri götürün.
- Ameliyat edilen fareyi gerekirse annesinin yuva malzemeleriyle bir katın.
NOT: Tüm 1 günlük yavruların anneden aynı anda çıkarılması ve tüm yavrular kurtarıldıktan sonra hepsini aynı anda iade etmek önemlidir.
2. Yenidoğan kardiyak makrofaj süspansiyonunun hazırlanması
NOT: Tüm bu deneysel işlemler karanlık bir yerde ve steril koşullarda yapılmalıdır.
- Apical rezeksiyondan 1 gün sonra yenidoğan Cx3cr1GFP/+ farenin kalbini hasat edin
- Apical rezeksiyondan bir gün sonra Cx3cr1GFP/+ faresini ötenazi edin. Fazla miktarda karbondioksit kullanın ve ötanazi uygulamak için farenin kafasını sırayla çekin.
- Kalbi göğüsten alın ve PBS ile 10 cm'lik bir tabağa daldırın.
- Damarları ve kalan bağ dokusunu ventriküllerden uzak kesin. Auriküler apandisiti kesin ve çıkış yolunu kalpten uzaklaştırın.
- Kalp durduktan sonra, mikrocerrahi makas kullanarak PBS tamponunda kalbi1-2 mm 3 parçaya bölün (Şekil 2A).
- Yenidoğan fare kalbi ayrışması
- Hasat edilen kalp dokusunu önceden ısıtılmış 2,5 mL enzim karışımı(Malzeme Tablosu)içeren bir tüpe aktarın ve tüpü sıkıca kapatın.
- Tüpü ters çevirin ve kapağı aşağı olacak şekilde yerleştirin (Şekil 2B).
- Yenidoğan kalp ayrışma programınıçalıştırın( Malzeme Masası ).
- Program tamamlandıktan sonra tüpü ayrıştırıcıdan ayırın.
- Tüpe %10 FBS ile 7,5 mL 1x DMEM ekleyin.
- Süspansiyonu filtreleyin ve 15 mL santrifüj tüpüne aktarın(Şekil 2C). Hücre süspansiyonu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini 1 mL kan hücresi liziz çözeltisinde yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın.
- Süspansiyona 5-10 mL PBS tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyin.
- Hücre peletini %10 FBS ile 1 mL DMEM'de yeniden sunun.
- Yenidoğan kardiyak makrofaj izolasyonu
- GFP+ yenidoğan kardiyak makrofajları FACS'e göre sıralayın. Sıralanmış makrofajları% 10 FBS ile 500 μL DMEM içeren steril bir tüpe alın.
- GFP+ makrofajları sayın (Şekil 2D). DMEM'deki makrofajı, daha sonra enjeksiyon için 200 μL DMEM başına 1 x10 6 makrofaj konsantrasyonunda% 10 FBS ile yeniden depoleyin.
NOT: Bir yenidoğanda GFP+ makrofaj sayısı azdır (yaklaşık 1 x 105); bu nedenle, her yetişkin fare enjeksiyonu için yeterli makrofaj elde etmek için en az 10 yenidoğan kullanılmalıdır.
3. Yenidoğan kardiyak makrofaj nakli
- Sol ön koroner arter 8'in ligasyonu ile yetişkin (6-8 haftalık) erkek C57BL/6 fareye miyokard enfarktüsü operasyonugerçekleştirin.
- Çalıştırılan fareyi iyileşene kadar 37 °C ısıtmalı battaniyeye koyun.
- Ameliyattan sonra (yaklaşık 6 saat sonra) kuyruk damarı üzerinden enfarktüslü yetişkin fareye 1 x10 6 GFP+ yenidoğan kardiyak makrofajlı 200 μL DMEM enjekte edin.
- Fareyi temiz bir kafese geri gönder.
4. Sonuç değerlendirmesi
- Enjeksiyon verimliliği doğrulaması
- Ameliyat edilen fareyi uyuşturun ve miyokard enfarktüsü operasyonundan 7 gün sonra kalbi hasat edin.
- Kalbi önceden soğutulmuş PBS arabelleğine daldır.
- Kalp dokusunu oda sıcaklığında 72 saat boyunca %4 poliformaldehit ile çalkalayarak sabitlayın.
- Kalp dokusunu dimetilbenzen ve etanolde susuzlaştırın.
- Kalp dokusunu parafin içine katıştırın ve 5 μm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin.
- Standart immünoresans boyama protokolünügerçekleştirin 1. Kardiyomiyositleri işaretlemek için α-actinin kullanın.
- Transplantasyon alan kalpteki GFP+ makrofajları tespit edin.
- Standart immünoresans boyama protokolünügerçekleştirin 1. Sırasıyla kardiyomiyositleri ve hücre çoğalmasını işaretlemek için α-actinin ve pH3 kullanın (Şekil 3A).
- Nakil sonrası kardiyak onarım değerlendirmesi
- Operasyondan bir ay sonra çalıştırılan farede ekokardiyografi kullanın1.
- Sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunu ve fraksiyonel kısalmayı farklı gruplar halinde karşılaştırarak kardiyak fonksiyonu analiz edin (Şekil 3B).
- Ameliyat edilen fareyi uyuşturun ve kalbi hasat edin.
- 4.1.2-4.1.5 adımlarını yineleyin.
- Masson'un boyama protokolünü gerçekleştirin.
- Makrofaj enjeksiyonundan sonra enfarktüs alanını analiz edin (Şekil 3C).
Representative Results
Burada açıklanan protokol bir akış grafiğinde özetlenmiştir (Şekil 1). 1 günlük Cx3cr1GFP/+ farede apikal rezeksiyon işlemi gerçekleştirdik. Şekil 2A'dagösterildiği gibi, yenidoğan Cx3cr1GFP/+ fare anesteziden sonra stereoskop altında çalışma platformuna tutturuldu. Göğsün içinden çıkan kalbi yönlendirmek için bir yol olarak kurulabilen iki forseps yardımıyla fare göğsüne ve karnına dönüşümlü olarak basınç uyguladık. Kalp yenilenmesini etkileyebilecek kalpteki ekstra mekanik hasarlardan kaçınılmalıdır. Kalp çevredeki göğüs dokuları tarafından hareketsiz hale getirildi ve bu da miyokarddaki operasyonu kolaylaştırdı. Sol ventrikül odası sızmaya başladığında, resekte edilen apeks dokusunun 1 mm'den daha az çapının iridektomi makası ile kesilmesinin uygun olduğunu gördük. Makrofaj nakli için apikal rezeksiyon modelinin başarılı indüksiyonugereklidir 8,9.
GFP+ makrofajları kesinlikle yenidoğan kalp ayrışma protokolü 1 (Şekil 2)izleyerek sıraladık.
İzolasyondan kısa bir süre sonra miyokard enfarktüslü yetişkin fare kalbine yenidoğan kardiyak makrofajlar enjekte edildi. Makrofaj naklinin verimliliğini doğrulamak için enjeksiyondan 7 gün sonra immünoresans lekeleme işlemi gerçekleştirdik. Sonuçlar, GFP+ makrofajların erişkin miyokard enfarktüslü fare kalbinde bulunabileceğini ve yenidoğan kardiyak makrofajın başarılı bir şekilde naklini gösterdiğini göstermiştir. pH3'ün α-actinin ile birlikte immünostainingini çalıştırdık. Birlikte lokalizasyon kardiyomiyosit çoğalması olarak kabul edildi. Sonuçlar, proliferatif kardiyomiyosit sayısının makrofaj enjekte edilen grupta yukarı yönlü olduğunu ve transplantasyondan sonra erişkin kardiyomiyosit çoğalma yeteneğinin arttırıldığını göstermektedir(Şekil 3).
Erişkin fare kalbi yenilenmesi nakilden 1 ay sonra değerlendirildi. Yetişkin fareye ekokardiyogram yaptık ve makrofaj enjeksiyonu miyokard enfarktüsünden sonra kardiyak fonksiyonu artırabileceğini gördük. Masson lekeleme yapıldı ve sonuçlar yenidoğan kardiyak makrofaj naklinden sonra enfarktüslü bölgenin önemli ölçüde azaldığını gösterdi (Şekil 3). Tüm bu sonuçlar yenidoğan kardiyak makrofaj transplantasyonlarının yetişkin fare kalbi rejenerasyonunu ve kardiyomiyosit çoğalmasını desteklediğini göstermiştir.
Şekil 1: Yenidoğan kardiyak makrofaj naklinin şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: Makrofaj yalıtımı görüntüleri. A)Kalpler küçük parçalara ayrılır. B) Fare kalpleri ayrışmış. C) Süspansiyon süzülür ve 15 mL santrifüj tüpüne aktarılır. D) Yenidoğan kardiyak makrofaj sayısı hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yenidoğan kardiyak makrofaj transplantasyonu erişkin kalp yenilenmesini teşvik eder. A) (Solda) İmmünofluoresans görüntüleri proliferatif kardiyomiyositleri gösterir (ok, pH3 yeşil, α-aktinin kırmızı). (Sağ) İstatistiksel analizler makrofaj naklinden sonra kardiyomiyosit çoğalmasının arttığını göstermektedir. B) (Sol) Ekokardiyogram görüntüleri miyokard enfarktüsünden 1 ay sonra yetişkin farede kardiyak fonksiyonu gösterir. (Sağ) İstatistiksel analizler makrofaj naklinden sonra kardiyak fonksiyonun geliştiğini göstermektedir. C) Masson lekesi, miyokard enfarktüsünden 1 ay sonra yetişkin faredeki enfarktüs bölgesini gösterir. (Sağ) İstatistiksel analizler Mφ, makrofaj naklinden sonra enfarktüslü bölgenin azaldığını göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada, yetişkin fare kalbi yenilenmesini teşvik etmek için yenidoğan kardiyak makrofajları hazırlamak, elde etmek ve nakletmek için etkili bir yaklaşım sağlıyoruz.
Apikal rezeksiyon, kalp yenilenmesini teşvik etmek için basit ve etkili bir operasyondur. Operasyonda yer alan hayvanların maksimum hayatta kalma oranını sağlamak için apikal rezeksiyonun ayrıntılarını optimize ettik10. Anestezi süresi 3 dakikadan uzun olmamalıdır, bu da hipotermi kaynaklı ölüme yol açar veya ameliyat sırasında aşırı kanamaya neden olacak 2 dakikadan kısa olmalıdır. Standart apikal rezeksiyonun apeks dokusunun yaklaşık 1,5 mm çapında kesilmesi gerekiyordu. Ancak buradaki operasyonun amacı kalp yenilenme sürecinde bol miktarda makrofaj infiltrasyonunu teşvik etmekti. Maksimum hayatta kalma oranını ve aynı zamanda etkili makrofaj alımını garanti edebileceğinden, 1,5 mm'den daha az çapta rezeksiyon kabul edilebilirdi. Sadece operatörün becerikliliği hayatta kalma oranını etkiledi ve çalıştırılan fareler uzun çalışma süresinden kurtulamadı. Operatör tüm prosedürü 5 dakika içinde tamamlamalıdır.
Eski çalışmamızda akut iltihabın yenidoğan kalp yenilenmesini teşvik ettiğini bulduk. İmmünojenik zymosan A parçacıklarının yenidoğan fare kalbine intramiyokardiyal mikroenjeksiyonu kardiyomiyosit çoğalmasını teşvik edebilir6. Son zamanlarda, Molkentin ve ark. zymosan A'nın intra kardiyak enjeksiyonu, hücre kalıntıları ve dondurarak / çözdüğü hücrelerin dondurulması / çözülmesi ile uyarılan makrofaj infiltrasyonunun kardiyak onarımı teşvik edebileceğini iddia etti, akut inflamasyon ve makrofajların kardiyomiyositlere farklılaşan kök hücreler yerine kalp onarımında gerekli olduğunu doğruladı11. Sadek ve ark.5, makrofajların anjiogenez yoluyla yenidoğan kalp yenilenmesini teşvik edebileceğini bildirdi. Son çalışmamız yenidoğan kardiyak makrofaj enjeksiyonunun yetişkin kalp yenilenmesini teşvik edebileceğini ve yetişkin kardiyomiyosit çoğalmasının yeteneğini artırabileceğini ortaya koydu1,7. Yenidoğan kardiyak makrofaj nakli, yetişkin fare kalbi yenilenmesini teşvik etmek için umut verici bir strateji olabilir. Burada, rejeneratif uygulama geliştirme ve kalp yenilenme mekanizmalarının keşfedilmesinde daha fazla araştırmacıya yardımcı olacak protokolleri sunuyoruz.
Disclosures
Çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Tıp Bilimleri Akademisi Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (CIFMS, 2016-I2M-1-015), Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Projesi (2019YFA0801500), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NSFC: 81970243, 81770308), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7172183, 7182140) tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse alpha actinin | Abcam | Ab9465 | |
| Anti-phospho-Histone H3 | Millipore | 06-570 | |
| Anti-rabbit Aurora B | Abcam | Ab239837 | |
| Anti-rabbit Ki67 | Abcam | Ab15580 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | N/A | |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-21137 | |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Bio Tech, Teterow, Germany | 130-098-373 |
References
- Li, Y., et al. gp130 Controls Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration. Circulation. 142 (10), 967-982 (2020).
- Pei, J., et al. Hydrogen Sulfide Promotes Cardiomyocyte Proliferation and Heart Regeneration via ROS Scavenging. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 1412696 (2020).
- Wang, Y., et al. Mydgf promotes Cardiomyocyte proliferation and Neonatal Heart regeneration. Theranostics. 10 (20), 9100-9112 (2020).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
- Han, C., et al. Acute inflammation stimulates a regenerative response in the neonatal mouse heart. Cell Research. 25 (10), 1137-1151 (2015).
- Li, Y., et al. Transplantation of murine neonatal cardiac macrophage improves adult cardiac repair. Cellular & Molecular Immunology. , (2020).
- Yue, Z., et al. PDGFR-β Signaling Regulates Cardiomyocyte Proliferation and Myocardial Regeneration. Cell Reports. 28 (4), 966-978 (2019).
- Wang, J., et al. A long noncoding RNA NR_045363 controls cardiomyocyte proliferation and cardiac repair. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 105-114 (2019).
- Li, Y., et al. Achieving stable myocardial regeneration after apical resection in neonatal mice. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (11), 6500-6504 (2020).
- Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577 (7790), 405-409 (2020).
