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Artigo de método

Dispositivos de campo elétrico e magnético para estimulação de tecidos biológicos

4.9K vistas

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DOI:

10.3791/62111

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15 de maio de 2021

 ,  ,  , 
1Biomimetics Laboratory, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional de Colombia, 2Numerical Methods and Modeling Research Group (GNUM), Universidad Nacional de Colombia, 3Design, Analysis and Development of Engineering Systems Research group (GIDAD), Fundación Universitaria Los Libertadores, 4School of Health and Sports Sciences, Master Program in Epidemiology, Fundación Universitaria del Área Andina

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve o processo passo a passo para construir estimuladores elétricos e magnéticos usados para estimular tecidos biológicos. O protocolo inclui uma diretriz para simular campos computacionais elétricos e magnéticos e fabricação de dispositivos estimuladores.

Resumo

Campos elétricos (EFs) e campos magnéticos (MFs) têm sido amplamente utilizados pela engenharia de tecidos para melhorar a dinâmica celular, como proliferação, migração, diferenciação, morfologia e síntese molecular. No entanto, variáveis como força de estímulo e tempos de estimulação precisam ser consideradas ao estimular células, tecidos ou andaimes. Dado que os EFs e os FMs variam de acordo com a resposta celular, ainda não está claro como construir dispositivos que gerem estímulos biofísicos adequados para estimular amostras biológicas. Na verdade, faltam evidências sobre o cálculo e distribuição quando são aplicados estímulos biofísicos. Este protocolo é focado no projeto e fabricação de dispositivos para gerar EFs e MFs e implementação de uma metodologia computacional para prever a distribuição de estímulos biofísicos dentro e fora de amostras biológicas. O dispositivo EF era composto por dois eletrodos paralelos de aço inoxidável localizados na parte superior e inferior das culturas biológicas. Os eletrodos foram conectados a um oscilador para gerar tensões (50, 100, 150 e 200 Vp-p) a 60 kHz. O dispositivo MF era composto por uma bobina, que foi energizada com um transformador para gerar uma corrente (1 A) e tensão (6 V) a 60 Hz. Um suporte de metacrilato de polimetila foi construído para localizar as culturas biológicas no meio da bobina. A simulação computacional elucidou a distribuição homogênea de EFs e MFs dentro e fora dos tecidos biológicos. Este modelo computacional é uma ferramenta promissora que pode modificar parâmetros como tensões, frequências, morfologias teciduais, tipos de placas de poço, eletrodos e tamanho da bobina para estimar os EFs e MFs para obter uma resposta celular.

Introdução

EFs e MFs têm sido mostrados para modificar a dinâmica celular, estimulando a proliferação e aumentando a síntese das principais moléculas associadas à matriz extracelular dos tecidos1. Esses estímulos biofísicos podem ser aplicados de diferentes maneiras usando configurações e dispositivos específicos. Em relação aos dispositivos para gerar EFs, os estimuladores de acoplamento direto utilizam eletrodos que estão em contato com amostras biológicas in vitro ou implantados diretamente em tecidos de pacientes e animais in vivo2; no entanto, ainda existem limitações e deficiências que incluem biocompatibilidade insuficiente pelos eletrodos em contato, alterações nos níveis de pH e oxigênio molecular1. Pelo contrário, dispositivos de acoplamento indireto geram EFs entre dois eletrodos, que são colocados em paralelo às amostras biológicas3,permitindo uma técnica alternativa não invasiva para estimular amostras biológicas e evitar o contato direto entre tecidos e eletrodos. Esse tipo de dispositivo pode ser extrapolado para futuras aplicações clínicas para realizar procedimentos com invasão mínima ao paciente. Em relação aos dispositivos que geram MFs, estimuladores de acoplamento indutivo criam uma corrente elétrica que varia o tempo, que flui através de uma bobina que está localizada ao redor das culturas celulares4,5. Finalmente, existem dispositivos combinados, que usam EFs e MFs estáticos para gerar campos eletromagnéticos transitórios1. Dado que existem diferentes configurações para estimular amostras biológicas, é necessário considerar variáveis como tensão e frequência quando são aplicados estímulos biofísicos. A tensão é uma variável importante, pois influencia o comportamento dos tecidos biológicos; por exemplo, foi demonstrado que a migração celular, orientação e expressão genética dependem da amplitude da tensão aplicada3,6,7,8,9,10. A frequência desempenha um papel importante na estimulação biofísica, pois tem sido evidenciado que estes ocorrem naturalmente in vivo. Tem sido demonstrado que frequências altas e baixas têm efeitos benéficos sobre as células; especialmente, nos canais de cálcio fechados pela tensão da membrana celular ou no ânticulo endoplasmático, que desencadeiam diferentes vias de sinalização no nível intracelular1,7,11.

De acordo com o citado, um dispositivo para geração de EFs consiste em um gerador de tensão conectado a dois capacitores paralelos12. Este dispositivo foi implementado por Armstrong et al. para estimular tanto a taxa de proliferação quanto a síntese molecular dos condrócitos13. Uma adaptação deste dispositivo foi realizada por Brighton et al. que modificaram as placas de cultura celular perfurando suas tampas superior e inferior. Os buracos foram preenchidos por lâminas de cobertura, onde os óculos inferiores eram usados para cultivar tecidos biológicos. Eletrodos foram colocados em cada slide de cobertura para gerar EFs14. Este dispositivo foi utilizado para estimular eletricamente condrócitos, osteoblastos e explantes de cartilagem, mostrando um aumento na proliferação celular14,15,16 e síntese molecular3,17. O dispositivo projetado por Hartig et al. consistia em um gerador de ondas e um amplificador de tensão, que estavam conectados a capacitores paralelos. Os eletrodos eram feitos de aço inoxidável de alta qualidade localizados em uma caixa isolante. O dispositivo foi utilizado para estimular os osteoblastos, mostrando um aumento significativo na proliferação e secreção deproteínas 18. O dispositivo usado por Kim et al. consistia em um chip estimulador de corrente bifásica, que foi construído usando um processo de fabricação de semicondutores complementares de óxido metálico de alta tensão. Um bem-prato de cultura foi projetado para cultivar células sobre uma superfície condutiva com estimulação elétrica. Os eletrodos foram revestidos em ouro sobre placasde silício 19. Este dispositivo foi utilizado para estimular os osteoblastos, mostrando um aumento na proliferação e na síntese do fator de crescimento endotelial vascular19, e estimulando a produção de atividade fosfatase alcalina, deposição de cálcio e proteínas morfogênicasósseas 20. Da mesma forma, este dispositivo foi utilizado para estimular a taxa proliferativa e a expressão do fator de crescimento endotelial vascular das células-tronco mesenquimais da medula óssea humana21. O dispositivo projetado por Nakasuji et al. era composto por um gerador de tensão conectado a placas de platina. Eletrodos foram construídos para medir o potencial elétrico em 24 pontos diferentes. Este dispositivo foi utilizado para estimular condrócitos, mostrando que os EFs não alteraram a morfologia celular e aumentaram a proliferação e a síntese molecular22. O dispositivo utilizado por Au et al. consistia em uma câmara de vidro equipada com duas hastes de carbono conectadas a um estimulador cardíaco com fios de platina. Este estimulador foi utilizado para estimular cardiomiócitos e fibroblastos, melhorando o alongamento celular e o alinhamento do fibroblasto23.

Diferentes dispositivos MF foram fabricados com base em bobinas Helmholtz para estimular vários tipos de amostras biológicas. Por exemplo, as bobinas Helmholtz têm sido usadas para estimular a proliferação e a síntese molecular de conrócitos24,25, melhorar a síntese proteoglicana das explanações de cartilagem articular26,melhorar a regulação genética relacionada à formação óssea de células semelhantes ao osteoblasto27, e aumentar a proliferação e expressão molecular das células endoteliais28. As bobinas helmholtz geram MFs ao longo de duas bobinas localizadas uma na frente da outra. As bobinas devem ser colocadas com uma distância igual ao raio das bobinas para garantir uma MF homogênea. A desvantagem de usar bobinas Helmholtz está nas dimensões da bobina, porque elas precisam ser grandes o suficiente para gerar a intensidade de MF necessária. Além disso, a distância entre as bobinas deve ser adequada para garantir uma distribuição homogênea de FMs ao redor de tecidos biológicos. Para evitar problemas causados pelas bobinas helmholtz, diferentes estudos têm sido focados na fabricação de bobinas solenoides. As bobinas solenoides são baseadas em um tubo, que é ferido com fio de cobre para gerar MFs. As entradas de fio de cobre podem ser conectadas diretamente à tomada ou a uma fonte de alimentação para energizar a bobina e criar MFs no centro do solenoide. Quanto mais giros a bobina tem, maior o MF gerado. A magnitude do MF também depende da tensão e da corrente aplicada para energizar a bobina29. Bobinas solenoides têm sido usadas para estimular células magneticamente diferentes, como HeLa, HEK293 e MCF730 ou células-tronco mesenquimais31.

Os dispositivos utilizados por diferentes autores não consideraram o tamanho adequado dos eletrodos ou o comprimento correto da bobina para distribuir homogeneamente tanto os EFs quanto os MFs. Além disso, os dispositivos geram tensões e frequências fixas, limitando seu uso para estimular tecidos biológicos específicos. Por essa razão, neste protocolo é realizada uma diretriz de simulação computacional para simular tanto sistemas capacitivos quanto bobinas para garantir a distribuição homogênea de EFs e MFs sobre amostras biológicas, evitando o efeito de borda. Além disso, mostra-se que o desenho dos circuitos eletrônicos gera tensões e frequência entre os eletrodos e a bobina, criando EFs e MFs que superarão limitações causadas pela impedância do bem-estar da cultura celular e do ar. Essas modificações permitirão a criação de bioreatores não invasivos e adaptativos para estimular qualquer tecido biológico.

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Protocolo

1. Simulação de EFs e MFs

NOTA: A simulação de EFs e MFs foi realizada em COMSOL Multifísica.

  1. Selecione uma configuração 2D 2D axisymétrica para representar ambos os domínios elétricos e magnéticos.
  2. Na configuração física, selecione a interface Corrente Elétrica para calcular EFs em eletrodos paralelos ou a interface de campo magnético para calcular MFs em torno de bobinas.
  3. Na configuração do estudo, selecione Domínio de Frequência para calcular a resposta de um modelo linear ou linearizado submetido à excitação harmônica para uma ou várias frequências.
  4. Uma vez dentro da interface para começar a construir o modelo, siga os próximos passos de acordo com o modelo de interesse.
    1. Construindo um modelo para EFs
      1. Criar geometrias. No Construtor de Modelos, selecione Geometria. Em seguida, localize a seção Unidades e escolha mm. Na barra de ferramentas geometria,selecione Retângulo e digite as dimensões de cada componente na caixa Tamanho e Forma das configurações da janela retângulo . A geometria é composta por ar, dois eletrodos paralelos, uma cultura bem-placa, mídia cultural e uma amostra biológica, que neste caso é representada por um andaime de ácido hialurônico - hidrogel de gelatina (ver dimensões de cada elemento na Tabela 1). Uma vez que todas as geometrias são construídas, clique em Construir todos os objetos.
      2. Criar seleções. Na barra de ferramentas definições,clique em Explícito para criar uma seleção para o domínio metálico. Selecione as geometrias que representam os eletrodos. Depois, clique com o botão direito do mouse em Explicit 1 para renomeá-lo. Digite metal no novo campo de texto de rótulo.
        1. Por outro lado, na barra de ferramentas definições,clique em Complemento. Localize a seção Entidades de Entrada na janela Configurações complementares. Em seguida, em Seleções para inverter, clique em Adicionar e selecione Metal nas Seleções para inverter a lista da caixa de diálogo Adicionar. Depois disso, clique com o botão direito do mouse no Complement 1 para renomeá-lo. Digite domínio de modelo no novo campo de texto de rótulo.
      3. Crie limites. Clique em Explicitar na barra de ferramentas de definições. Depois, localize a seção Entidades de Entrada na janela Configurações para Explícita e da lista de nível da entidade geométrica, escolha Limite. Aqui, selecione todos os limites para o eletrodo inferior. Clique com o botão direito do mouse em Explicit 2 para renomeá-lo. Digite limites de terra no novo campo de texto de rótulo. Repita estas etapas, mas selecionando todos os limites para o eletrodo superior. Depois disso, clique com o botão direito do mouse em Explicit 3 para renomeá-lo. Digite limites de terminal no novo campo de texto de rótulo.
      4. Adicione correntes elétricas. Na janela Model Builder, em Componente 1 clique correntes elétricas (ce). Em seguida, localize a seção Seleção de domínio na janela Configurações de correntes elétricas. Na lista Seleção, escolha o domínio Modelo. Na barra de ferramentas física,clique em Limites e escolha O Chão. Depois, localize a seção Seleção de limites na janela Configurações do solo e escolha limites de terra da lista Seleção.
        1. Depois disso, clique em Limites e escolha Terminal na barra de ferramentas físicas. Por fim, localize a seção Seleção de Limites na janela Configurações do Terminal e escolha limites de terminal da lista Seleção; aqui, localize a seção Terminal e escolha Tensão na lista terminal e tipo 100 V.
      5. Adicione materiais. Clique em Adicionar material na barra de ferramentas domésticas para abrir a janela Adicionar material. Pesquise ar e aço inoxidável e adicione-os à janela Model Builder. Em seguida, clique em Material em Branco na barra de ferramentas domésticas e adicione três novos materiais em branco para mídia de cultura, andaime (hidrogel) e poliestireno (cultura bem-placa).
      6. Selecione um material em branco para atribuir as propriedades dielétricas. Localize a lista Propriedades do Material na janela Configurações do material e selecione a permissão relativa e a condutividade elétrica da lista de opções Propriedades Básicas. As propriedades dielétricas para mídia cultural, hidrogel e cultura bem-prato estão na Tabela 2. Repita este procedimento para todos os materiais em branco.
      7. Atribua cada material às geometrias previamente construídas. Selecione o material de ar que forma a janela Model Builder; em seguida, selecione os domínios que correspondem ao ar a partir da janela Gráfico. Repita esta etapa para todos os materiais criados. Certifique-se de que cada domínio corresponde ao material correto. Para ter certeza de que todos os materiais estão corretamente atribuídos, clique em cada material da janela Model Builder e observe se os domínios estão destacados em azul dentro da janela Gráfico.
      8. Construa malha. Clique com o botão direito do mouse em Malha 1 na janela Model Builder e selecione Triangular Livre. Repita esta etapa selecionando Tamanho. Na janela Configuração de malha selecione Malha controlada pelo usuário da lista Tipo de sequência. Em seguida, expanda as opções Mesh na janela Model Builder e clique em Tamanho.
      9. Localize parâmetros de tamanho do elemento na janela De configuração de tamanho e tipo 1 mm para tamanho máximo do elemento, 0,002 mm para tamanho mínimo do elemento, 1,1 para taxa máxima de crescimento do item, 0,2 para fator de curvatura e 1 para resolução de regiões estreitas. Em seguida, expanda as opções De malha na janela Model Builder e clique em Triangular Livre 1. Aqui, selecione todos os domínios a serem misturados. Por fim, clique em Construir tudo na janela Configuração de malha.
      10. Crie estudo. Clique em Estudar 1 na janela Model Builder. Em seguida, localize a seção Configurações de estudo na janela Configurações de estudo e limpe a caixa de seleção Gerar plots padrão. Expanda o nó Study 1 na janela Model Builder e clique na Etapa 1: Domínio de frequência. Por fim, localize a seção Configurações de estudo na janela Configurações de domínio de frequência e digite 60 kHz no campo de texto Frequências.
      11. Calcule o estudo. Clique em Mostrar solver padrão na barra de ferramentas Study. Em seguida, expanda o nó De Configurações de Solvedor de Estudo 1 na janela Model Builder. Expandir o nó solução 1 (sol1) na janela Model Builder; posteriormente, clique em Soltarr 1 na janela Configurações do Solver Estacionário e localize a seção Geral e o tipo 1e-6 no campo de texto Tolerância Relativa. Por fim, clique em Computação na barra de ferramentas de estudo.
      12. Resultados da trama. Selecione a seção Resultados na barra de ferramentas Home e adicione o Grupo de Parcelas 2D. Em seguida, clique com o botão direito do mouse 2D Plot Group 1 na janela Model Builder e escolha Surface. Em seguida, localize a seção Dados na janela Configurações da superfície e selecione Precursor. Depois, localize a seção Expressão na janela Configurações da superfície; aqui, clique no símbolo mais (+) para abrir uma nova janela e localizar a rota a seguir da lista de seleção (Modelo - Componente 1 - Correntes Elétricas - Elétrica). Aqui, selecione ec.normE - Norma EF. Por fim, clique em Gráfico na janela Configurações da superfície para traçar os resultados.
    2. Construindo um modelo para MFs
      1. Criar geometrias. No Construtor de Modelos, selecione Geometria; em seguida, localize a seção Unidades e escolha mm. Na barra de ferramentas geometria selecione Retângulo e digite as dimensões de cada componente na caixa tamanho e forma das configurações da janela retângulo . A geometria é composta por ar e cooper (ver dimensões de cada elemento na Tabela 1). Uma vez que todas as geometrias são construídas, clique em Construir todos os objetos.
      2. Adicione materiais. Clique em Adicionar material na barra de ferramentas domésticas para abrir a janela Adicionar material. Pesquise ar e cobre e adicione-os à janela Model Builder. As propriedades dielétricas para cobre estão na Tabela 2.
      3. Crie limites. Clique no Campo magnético na janela Model Builder. Aqui, localize a lista de equações na janela Configurações de Campos Magnéticos e escolha a equação do Domínio de Frequência da lista Forma de Equação. Na lista de frequência escolha Do solucionador. Depois, localize a Lei de Ampere na lista de campo magnético na janela Construtor de Modelos. No tipo 293.15[K] em Temperatura, 1[atm] em Pressão Absoluta da lista Modelo de Entradas. Em seguida, escolha Sólido na lista de tipos Desreto na janela Configurações de Lei do Ampere. Certifique-se de que a condutividade elétrica, a permeabilidade relativa e a permeabilidade relativa correspondem ao material From da lista.
      4. Localize a simetria axial na lista de campo magnético na janela Model Builder. Certifique-se de que a linha de simetria axial esteja destacada tanto na lista de seleção de limites quanto na janela Gráfico. Em seguida, localize o Isolamento Magnético na lista de campo magnético na janela Model Builder. Certifique-se de que os limites da geometria sejam destacados tanto na lista de seleção de limites quanto na janela Gráfico.
      5. Localize valores iniciais na lista de campo magnético na janela Construtor de modelos. Selecione geometrias previamente construídas e inclua-as na seleção de domínio da janela Configurações de Valores Iniciais.
      6. Introduza os recursos da bobina. Localize a bobina múltipla na lista de campo magnético na janela Construtor de modelos. Aqui, seleciona a geometria que representa a bobina e as inclui na Seleção de Domínio a partir da janela Configurações de Bobina Múltipla.
      7. Localizar a lista de bobinas múltiplas na janela Configuração de bobina múltipla; aqui, localize a lista de excitação da Bobina e selecione Corrente; posteriormente, tipo 1[A] na lista atual da Bobina, 450 no Número de curvas e 6e7[S/m] na condutividade da Bobina.
      8. Localize a área transversal do fio da Bobina e escolha o diâmetro do cabo norte-americano (Brown & Sharpe) da lista e do tipo 18 na opção AWG. Certifique-se de que a permeabilidade relativa e a permeabilidade relativa correspondem ao material da lista.
      9. Construa malha. Na janela Configuração de malha selecione Malha controlada pela física da lista Tipo de sequência. Depois, localize parâmetros de tamanho do elemento na janela Configuração da malha e selecione Extremamente fino. Finalmente, selecione todos os domínios a serem misturados e clique em Construir tudo na janela Configuração de malha.
      10. Crie estudo. Clique em Estudar 1 na janela Model Builder. Em seguida, localize a seção Configurações de estudo na janela Configurações de estudo e limpe a caixa de seleção Gerar plots padrão. Expanda o nó Study 1 na janela Model Builder e clique na Etapa 2: Domínio de Frequência. Por fim, localize a seção Configurações de estudo na janela Configurações de domínio de frequência e digite 60 Hz no campo de texto Frequências.
      11. Calcule o estudo. Clique em Mostrar solver padrão na barra de ferramentas Study. Em seguida, expanda o nó De Configurações de Solvedor de Estudo 1 na janela Model Builder. Expandir o nó solução 1 (sol1) na janela Model Builder; posteriormente, clique em Soltarr 1 na janela Configurações do Solver Estacionário e localize a seção Geral e o tipo 1e-6 no campo de texto de tolerância relativa. Por fim, clique em Computação na barra de ferramentas de estudo.
      12. Resultados da trama. Selecione a seção Resultados na barra de ferramentas Home e adicione o Grupo de Parcelas 2D. Em seguida, clique com o botão direito do mouse 2D Plot Group 1 na janela Model Builder e escolha Surface. Em seguida, localize a seção Dados na janela Configurações da superfície e selecione Precursor.
      13. Localize a seção Expressão na janela Configurações da superfície. Aqui, clique no símbolo mais (+) para abrir uma nova janela e localizar a rota a seguir da lista de seleção (Modelo - Componente 1 - Campo Magnético - Magnético). Aqui, selecione mf.normB - Norma de densidade de fluxo magnético. Por fim, clique em Gráfico na janela Configurações da superfície para traçar os resultados.

2. Projeto e fabricação dos dispositivos de estimulação elétrica e magnética

  1. O dispositivo estimulador elétrico
    NOTA: É composto por um circuito baseado no Oscilador da Ponte Wien e dois eletrodos paralelos de aço inoxidável. O circuito é um oscilador RC de mudança de fase, que usa um feedback positivo e negativo. O Oscilador da Ponte Wien é composto por uma rede de chumbo-lag, que divide a tensão de entrada pela combinação de dois braços da ponte: um resistor R5 com um capacitor C2 em série, e um resistor R6 com um capacitor C3 em paralelo (Figura 1A). Estes componentes modulam a frequência do oscilador. Para construir o dispositivo estimulador elétrico siga os próximos passos:
    1. Calcule a frequência usando a equação de frequência ressonante (1).
      figure-protocol-1
      Onde R = R5 = R6 são resistores e C = C2 = C3 são capacitores. Tanto R quanto C são colocados nos dois braços da ponte (Figura 1A). Use R5 = R6 = 2,6 kΩ e C2 = C3 = 1 nF para obter uma frequência de 60 kHz. Resistores e capacitores podem ser calculados se for necessária uma frequência diferente.
    2. Projete o circuito de tal forma que o ganho de tensão do amplificador compense automaticamente as mudanças de amplitude do sinal de saída. Na Figura 1A é possível observar o esquema do circuito, enquanto na seção Tabela de Materiais estão listados os componentes eletrônicos para construir o circuito.
    3. Calcule a combinação de resistores para gerar as quatro tensões de saída. Como mostrado na Figura 1A, use uma combinação de resistores R11, R12, R13 e R14 (resistência equivalente de 154 Ω) para gerar uma tensão de 50 Vp-p; resistores R17, R18 e R19 em série (resistência equivalente a 47,3 Ω) para obter uma tensão de 100 Vp-p; resistores R9 e R10 em série (resistência equivalente a 25,3 Ω) para gerar uma tensão de 150 Vp-p; e uma combinação de resistores R15 e R16 (resistência equivalente de 16,8 Ω) para obter uma tensão de 200 Vp-p.
    4. Use um transistor (TIP 31C) e um transformador de núcleo ferrite para implementar um estágio de amplificação de sinal. Um núcleo ferrite toroidal foi usado para enrolar um fio de cobre AWG 24, completando uma relação de 1:200. Utilize dois capacitores (C4 e C5) de 100 nF em paralelo antes do transformador para corrigir o sinal(Figura 1A).
    5. Prepare o PCB usando um serviço de fabricação pcb de terceiros. O diagrama esquemático do circuito é fornecido na Figura 1. Coloque todos os componentes do PCB com pinças antiestáticas. Use solda de lata e ferro de solda para soldar todos os componentes.
    6. Fabricar uma caixa de plástico com conectores de entrada para proteger o circuito. Implemente três conectores de entrada para energizar o circuito (12 V, -12 V e terra). Use dois conectores de entrada para conectar os eletrodos. Inclua três interruptores para alterar a combinação de resistores para obter as quatro tensões de saída. Montar o circuito eletrônico na caixa de plástico(Figura 1B).
    7. Fabricar dois eletrodos de aço inoxidável paralelo (200 x 400 x 2 mm) e conectores de entrada de solda a cada borda. Os eletrodos estão localizados sobre suportes de Teflon ou acrílico para eliminar qualquer contato com a superfície metálica da incubadora(Figura 1C).
    8. Use uma autoclave a 394,15 K (121 °C) durante 30 minutos para esterilizar os eletrodos e use ultravioleta durante a noite para esterilizar os fios que estão em contato com a incubadora.
    9. Teste o dispositivo de estimulação elétrica. Ajuste a fonte de alimentação em série para gerar uma tensão de saída de +12 V e -12 V entre o solo e terminais positivos e negativos. Verifique a tensão de saída da fonte de alimentação com um multimetro. Conecte cada saída da fonte de alimentação na entrada correta do estimulador elétrico (+12 V, -12 V e terra). Conecte cada eletrodo no conector de entrada correto do estimulador elétrico. A polaridade não é importante, pois estamos trabalhando na corrente AC. Coloque uma placa de cultura entre os eletrodos e verifique o sinal de saída com um osciloscópio. Ajuste os interruptores do estimulador elétrico para gerar as quatro tensões de saída (50, 100, 150 e 200 Vp-p).
    10. Recomendações de segurança. Para evitar qualquer problema ao transferir ou remover os eletrodos da incubadora, certifique-se de que os cabos não estão emaranhados. Desconecte os cabos do oscilador antes de remover os eletrodos da incubadora. Nunca coloque os eletrodos sem os suportes acrílicos ou teflon.
  2. O dispositivo estimulador magnético
    1. Estime o número de curvas para garantir um MF homogêneo dentro da bobina usando a equação (2), que descreve o MF dentro de uma bobina solenoide.
      figure-protocol-2
      onde μ0 é a permeabilidade magnética do vácuo (4π×10-7), N é o número de voltas do fio de cobre, eu sou a corrente, e h, que deve ser maior que seu diâmetro, é o comprimento da bobina solenoide.
    2. Determine o número de curvas escolhendo um comprimento (h) de 250 mm, corrente de 1 A e um int B = 2mT.
    3. Fabricar a bobina. Construa um tubo de cloreto de polivinil (PVC) com um comprimento de 250 mm e um diâmetro de 84 mm para enrolar um fio de cobre AWG 18 completando 450 voltas(Figura 2A). As dimensões foram escolhidas com base no espaço disponível dentro da incubadora.
    4. Fabricar um suporte de cultura celular bem-placa. Construa um suporte de metacrilato de polimetila (PMMA) para garantir que placas de poço de 35 mm estejam sempre localizadas no meio da bobina onde os MFs são homogêneos(Figura 2A).
    5. Fabricar um transformador para aumentar a corrente do circuito. Construa um transformador com uma saída de 1 A - 6 V AC para atingir um MF máximo de 2 mT. A tensão de entrada do transformador foi de 110 V AC a 60 Hz. Esses parâmetros correspondem à tensão de saída e frequência de uma tomada da América do Sul.
    6. Ligue o circuito. O transformador está conectado diretamente à tomada. Use um resistor variável (reostat) para variar a corrente e gerar MFs de 1 a 2 mT. Conecte um fusível para proteger o circuito(Figura 2B).
    7. Use ultravioleta durante a noite para esterilizar os fios que estão em contato com a incubadora. Enrole a bobina com filme elástico transparente e use etanol para esterilizar a bobina.
    8. Teste o dispositivo MF. Use um teslameter para medir a magnitude do MF dentro da bobina. A sonda teslameter estava localizada no centro da bobina, permitindo a medição de MFs e correntes simultaneamente.
    9. Varie a magnitude mf. Use um reostat para modificar a resistência do circuito (Figura 2B). Um valor de resistência de 0,7 Ω foi utilizado para gerar MFs de 1 mT.
    10. Recomendações de segurança. Para evitar qualquer problema ao transferir ou remover o solenoide da incubadora, certifique-se de que os cabos não estão emaranhados. Desconecte os cabos do transformador antes de remover o solenoide da incubadora. Nunca coloque o solenoide sem o suporte do PMMA. Segure firmemente tanto o suporte pmma da base quanto o solenoide ao transferir ou remover da incubadora.

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Resultados

Simulação computacional
As distribuições de EFs e MFs são mostradas na Figura 3. Por um lado, foi possível observar a distribuição homogênea de EFs no sistema capacitivo (Figura 3A). A EF foi traçada para observar detalhadamente a magnitude do campo dentro da amostra biológica(Figura 3B). Esta simulação foi útil para parametrizar o tamanho dos eletrodos e fabricá-los para evitar o efeito de borda. Por outro lado,...

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Discussão

Os tratamentos utilizados para curar diferentes patologias que afetam os tecidos humanos são as terapias farmacológicas32 ou intervenções cirúrgicas33,que buscam aliviar a dor localmente ou substituir os tecidos afetados por explantas ou transplantes. Recentemente, a terapia celular autóloga foi proposta como uma terapia alternativa para tratar tecidos feridos, onde as células são isoladas do paciente e expandidas, através de técnicas in vitro, para serem implantadas no loc...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio financeiro prestado pelo "Fondo Nacional de Financiamiento para la Ciencia, la Tecnología, y la Innovación -Fondo Francisco José de Caldas- Minciencias" e Pela Universidad Nacional de Colombia através da bolsa nº 80740-290-2020 e do apoio recebido pela Valteam Tech - Research and Innovation para fornecer o equipamento e suporte técnico na edição do vídeo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Estimulador elétrico
Amplificador operacionalMotorolaLF-353N----
Quantidade: 1
Resistores--------22kΩ
Quantidade: 1
Resistores--------10 kΩ
Quantidade: 3
Resistores--------2.6 kΩ
Quantidade: 2
Resistores--------2.2 kΩ
Quantidade: 1
Resistores--------1 kΩ
Quantidade: 1
resistores--------220 e ômega;
Quantidade: 2
resistores--------22 e ômega;
Quantidade: 5
resistores--------10 e ômega;
Quantidade: 1
resistores--------6,8 e ômega;
Quantidade: 1
resistores--------3.3 e ômega;
Quantidade: 2
Capacitores de poliéster--------1 nF
Quantidade: 2
capacitores de poliéster--------100 nF
Quantidade: 1
Amplificador de banda VHF Transistor JFETToshiba2SK161----
Quantidade: 1
Transistor de potência BJT NPNMospecTIP 31C----
Quantidade: 1
Diodo ZenerMicrosemi1N4148----
Quantidade: 1
InterruptorToogle SwitchSPDT - T13----
Quantidade: 3
Núcleo de ferrite toroidalCaracol----T*22*14*8
Quantidade: 1
fio CooperGreenshine----AWG – 24
Quantidade: 1
Cabeçote Relimate com carcaça femininaADAFRUIT----Conectores de 8 pinos
Quantidade: 1
Conector Relimate com carcaça fêmeaADAFRUIT2 conectores de pinos
Quantidade: 1
Conector de terminal de plugue fêmeaJIALUN4mm Lantern Plugs (Plug + Socket) 15 A
Quantidade: 1
Dissipador de Calor de AlumínioAWIND----Para transistor TIP 31C
Quantidade: 1
LedCHANZON5 mm vermelho
Quantidade: 1
Conector de soquete de circuito integradoTe Electronics Co., Ltd.----Fila dupla de 8 pinos DIP
Quantidade: 1
conjunto de conectores de 3 pinosSTAR----JST PH 2.0
Quantidade: 3
conectores de parafuso de 2 pinosSTAR----Para PCB
Quantidade: 1
Conectores de parafuso de 3 pinosSTAR----Para PCB
Quantidade: 1
Cabo de teste do conector bananaJIALUNP1041 - 4 mm - 15 A
Quantidade: 7
conectores de bala para cabo de carga de plugue bananaAdaptadores macho-macho/fêmea-fêmea JIALUN----4 mm - 15 A
Quantidade: 1
Caixa--------ABS
Quantidade: 1
Eletrodos--------Aço inoxidável – aço
Quantidade: 2
Suporte de eletrodo--------Teflon
Quantidade: 2
PlacaQuantidade: 1
Estimulador magnético
Fio CooperGreenshine----AWG – 18
Quantidade: 1
plugues de alimentação AC--------120 V AC – 60 Hz
Quantidade: 1
Conector fêmea banana cabo de testeJIALUN----1Set Injeção Dupla - 4 mm – 15 A
Quantidade: 2
Conector macho banana cabo de testeJIALUN1Set Injeção Dupla - 4 mm 15 A
Quantidade: 1
Suporte de placa de poço de cultura de células--------PMMA
Quantidade: 1
FusívelBussmann2A----
Quantidade: 1
Transformador--------1A - 6 V AC
Quantidade: 1
tubo--------PVC
Quantidade: 1
reostato variávelMCPBXS15010 Ω
Quantidade: 1
Equipamento geral
Fonte dupla digital PeakTechDG 1022Z2 x 0 - 30 V / 0 - 5 A CC / 5 V / 3 A fijo
Quantidade: 1
Osciloscópio DigitalRigolDS1104Z Plus100 MHz, largura de banda, 4 canais
Quantidade: 1
Multímetro digitalFlukeF179Voltage CC - CA (1000 V). CC atual - CA 10 A. Frequência 100 kHz
Quantidade: 1
---------------- de circuito impresso ----

Referências

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