Este protocolo de fracionamento permitirá que os pesquisadores isolem proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriais e de membrana de células de mamíferos. As duas últimas frações subcelulares são ainda purificadas através do gradiente de densidade isopícnico.
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Artigo de método
Fracionamento Celular de Células U937 por Purificação de Gradiente de Densidade Ipopínica
Neste artigo
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Resumo
Resumo
Este protocolo descreve um método para obter frações proteicas subcelulares de células de mamíferos usando uma combinação de detergentes, lise mecânica e centrifugação de gradiente de densidade isopícnica. A principal vantagem deste procedimento é que ele não depende do uso exclusivo de detergentes solubilizantes para obter frações subcelulares. Isso torna possível separar a membrana plasmática de outras organelas ligadas à membrana da célula. Este procedimento facilitará a determinação da localização de proteínas em células com um método reprodutível, escalável e seletivo. Este método tem sido usado com sucesso para isolar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriais e da membrana plasmática da linhagem celular de monócitos humanos, U937. Embora otimizado para esta linhagem celular, este procedimento pode servir como um ponto de partida adequado para o fracionamento subcelular de outras linhagens celulares. Possíveis armadilhas do procedimento e como evitá-las são discutidas, assim como alterações que podem precisar ser consideradas para outras linhagens celulares.
Introdução
O fracionamento subcelular é um procedimento no qual as células são lisadas e separadas em seus componentes constituintes através de vários métodos. Esta técnica pode ser usada por pesquisadores para determinar a localização de proteínas em células de mamíferos ou para o enriquecimento de proteínas de baixa abundância que, de outra forma, seriam indetectáveis. Embora existam atualmente métodos de fracionamento subcelular, assim como os kits comerciais que podem ser adquiridos, eles sofrem de várias limitações que esse procedimento tenta superar. A maioria dos métodos de fracionamento celular é exclusivamente à base de detergente1,2,<....
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Protocolo
1. Prepare tampões e reagentes
- Prepare soluções frescas de fosfatase e inibidores da protease.
- Adicione 17,4 mg de fluoreto de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 mL de etanol a 100% para preparar um estoque de 100 mM.
NOTA: Use equipamento de proteção ao manusear o PMSF, pois é perigoso quando ingerido ou inalado e em contato com a pele ou os olhos. É corrosivo para os olhos e pele. - De acordo com as instruções do fabricante, prepare um coquetel inibidor de protease comercialmente disponível (100x).
- Adicione 91,9 mg de ortovanadato de sódio (SOV) a 1 mL de água deionizada para preparar um estoque de 500 mM.
NOTA: Use equipament....
- Adicione 17,4 mg de fluoreto de fenilmetanosulfonilo (PMSF) a 1 mL de etanol a 100% para preparar um estoque de 100 mM.
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Resultados
Um fluxograma esquemático deste procedimento (Figura 1) resume visualmente as etapas que foram tomadas para fracionar com sucesso as células U9375 cultivadas em suspensão. As frações coletadas do topo do gradiente de densidade isopícnico em volumes iguais (1 mL) mostram a purificação das frações mitocondrial e de membrana (Figura 2). A utilização de um anticorpo contra VDAC, uma proteína localizada na membrana mitocondrial externa
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Discussão
Este método é uma versão modificada de uma abordagem previamente publicada para o fracionamento subcelular sem o uso de centrifugação de alta velocidade11. Este método modificado requer equipamentos mais especializados para alcançar os melhores resultados, mas é mais abrangente e consistentemente reprodutível.
O desenvolvimento do protocolo inicial foi necessário devido à incapacidade de separar amostras mitocondriais e de membrana para a análise da localização proteica.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo NIH R15-HL135675-01 e NIH 2 R15-HL135675-02 para T.J.L.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Liquidificador de Bala Homogeneizador de Tecidos | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonina | Sigma | D141 | |
| rotador de ponta a ponta | ThermoFisher | ||
| Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ácido etilenoglicol-bis(β-aminoetílico)-N,N,N',N'-ácido tetracético (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexilenoglicol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Detergente não iônico e não desnaturante |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Manitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Tubos Polyclear de Topo Aberto, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Gradiente de densidade médio | Sigma | D1556-250ML | |
| fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| , uso geral | Centrífuga | M221-1ML | |
| Rotor de balde oscilante | |||
| Sigma | 436143 | ||
| Desoxicolato de sódio | Sigma | D6750 | |
| ortovanadato de sódio (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicador | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrífuga | ThermoFisher | ||
| Contas de aço inoxidável 3,2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sacarose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | detergente não iônico em tampões de western blotting | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Referências
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K.
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Reimpressões e permissões
Errata
Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 5/31/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
