Um sistema in vitro para medir a eficácia trombolítica da histotripsia e uma droga lítica

Summary

A entrega de líticos auxiliados por histotripsy ou a lysotripsy está em desenvolvimento para o tratamento de trombose venosa profunda. Um procedimento in vitro é apresentado aqui para avaliar a eficácia desta terapia combinada. São discutidos protocolos-chave para o modelo de coágulo, orientação de imagem e avaliação da eficácia do tratamento.

Abstract

A trombose venosa profunda (DVT) é uma preocupação global para a saúde. A abordagem primária para alcançar a recanalização do vaso para obstruções críticas é a trombolíticos orientados pelo cateter (CDT). Para mitigar os efeitos colaterais cáusticos e o longo tempo de tratamento associado ao CDT, abordagens adjuvantes e alternativas estão em desenvolvimento. Uma dessas abordagens é a histotripsia, uma ultrassonografia focada para ablate tecido através da nucleação de nuvens de bolhas. Estudos pré-clínicos demonstraram forte sinergia entre histotripsia e trombolíticos para degradação do coágulo. Este relatório descreve um método de bancada para avaliar a eficácia da terapia trombolítico auxiliada em histotripsia, ou lysotripsy.

Coágulos fabricados a partir de sangue venoso humano fresco foram introduzidos em um canal de fluxo cujas dimensões e propriedades acousto-mecânicas imitam uma veia iliofemoral. O canal foi perfundido com plasma e o ativador de plasminogen recombinante lincático. Nuvens de bolha foram geradas no coágulo com uma fonte de ultrassom focada projetada para o tratamento de coágulos venosos femorais. Posicionadores motorizados foram usados para traduzir o foco de origem ao longo do comprimento do coágulo. Em cada local de inssonação, as emissões acústicas da nuvem bolha foram passivamente registradas e antenadas para gerar imagens de cavitação passiva. As métricas para medir a eficácia do tratamento incluíram perda de massa de coágulos (eficácia geral do tratamento), e as concentrações de D-dimer (fibrinolise) e hemoglobina (hemolise) no perfusato. Há limitações para este design in vitro, incluindo a falta de meios para avaliar efeitos colaterais in vivo ou mudanças dinâmicas na taxa de fluxo à medida que o coágulo lise. No geral, a configuração fornece um método eficaz para avaliar a eficácia das estratégias baseadas em histotripsia para tratar DVT.

Introduction

Trombose é a condição de formação de coágulos em um vaso sanguíneo saudável que obstrui a circulação^1,2. O tromboembolismo venoso tem um custo anual de saúde de US $ 7-10 bilhões, com 375.000-425.000 casos nos Estados Unidos³. Embolia pulmonar é a obstrução da artéria pulmonar e é a consequência mais grave do tromboembolismo venoso. A principal fonte de obstrução pulmonar é o trombo venoso profundo, principalmente dos segmentos venosos iliofemoral^4,5,6. Trombose venosa profunda (DVT) tem sequel....

Protocol

Para os resultados aqui apresentados, o sangue humano venoso foi extraído para formar coágulos após aprovação do conselho de revisão interna local (IRB nº 19-1300) e consentimento informado por escrito fornecido pelos doadores voluntários²⁴. Esta seção descreve um protocolo de design para avaliar a eficácia da lysotripsy. O protocolo é baseado em um trabalho anterior de Bollen et al.²⁴.

1. Modelagem de coágulos

NOTA: Prepare os coágulos dentro de 2 semanas, mas mais de 3 dias antes do dia do experimento para garantir a estabilidade do coágulo e maximizar a retração

Results

O protocolo descrito neste estudo destaca os detalhes da modelagem de coágulos venosos, da linsotripsia para interrupção do coágulo e da ultrassom em uma configuração in vitro de DVT. O procedimento adotado demonstra as etapas necessárias para avaliar a interrupção do coágulo devido aos efeitos combinados da atividade da nuvem de bolhas rt-PA e histotripsy. A configuração do bancada foi projetada para imitar as características de uma veia iliofemoral venosa. A Figura 1A mostra um vaso modelo.......

Discussion

O protocolo proposto apresenta um modelo para quantificar a eficácia do tratamento da lysotripsy. Embora os detalhes-chave tenham sido discutidos, há certos aspectos críticos a serem considerados para o sucesso deste protocolo. A atividade enzimática do RT-PA tem uma dependência de temperatura de Arrhenius³⁰. A temperatura também é um fator contribuinte para a velocidade do som na água e no tecido, e variações de temperatura podem causar pequenas alterações na geometria da zona focal. Assim, a tem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folhas absorventes	Acústica de precisão	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicato Pipetas de Pasteur	Fisher Scientific	1367820A	14,6 cm de comprimento, capacidade de 2 mL
Tubos de centrífuga	Eppendorf	22364111	1,5 mL de capacidade
Ensaio de Drabkin	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Seringa	de traçãoCole-Parmer	EW-07945-43	Capacidade de 60 mL
Sacos de filtro	McMaster-Carr	5162K111	Remova o tamanho das partículas de até 1 mícron
Tubulação de canal de fluxo	McMaster-Carr	5154K25	Tubulação de plástico EVA revestida de polietileno (Diâmetro externo: 3/8", Diâmetro interno: 1/4"
Elementos de aquecimento	Won Brothers	HT 300 Titânio	Hastes de titânio colocadas no fundo do tanque
Matriz de imagem	Verasonics	L11-5v	128 elemento com sensibilidade de -55 a -49 dB
Baixa agarose gelificante	Millipore Sigma	A9414
Embarcação modelo	McMaster-Carr	5234K98	6,6 cm de comprimento, 0,6 cm de diâmetro interno, 1 mm de espessura
Água nanopura	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM tipo I, resistividade de 18 Mohm-cm
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma congelado em 24 horas
Leitor de placas	Biotek	Synergy Neo HST Leitor de placas	Para quantificação de hemoglobina
Tampa da sonda	Civco	610-362
Plataforma de programação	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, EUA)
Ativador de plasminogênio recombinante do tipo tecido (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservatório	Cole-Parmer	EW-07945-43	Capacidade de 60 mL
Bomba de seringa	Cole-Parmer	EW-74900-20	acoplada à seringa para puxar o fluxo no canal de fluxo a uma taxa de alimentação pré-determinada
Transdutor	personalizado		Transdutor de oito elementos, com foco elíptico (eixo maior de 9 cm, eixo menor de 7 cm e distância focal de 6 cm), alimentado por classe D projetada e construída sob medida amplificador e rede correspondente
Sistema de varredura de ultrassom	Verasonics		Vantage Research Sistema de ultrassom
Tanque de água	Acrílicos avançados	C133	14 x 14 x 12, 1/2"