Um sistema in vitro para medir a eficácia trombolítica da histotripsia e uma droga lítica

Trombose é a condição de formação de coágulos em um vaso sanguíneo saudável que obstrui a circulação^1,2. O tromboembolismo venoso tem um custo anual de saúde de US $ 7-10 bilhões, com 375.000-425.000 casos nos Estados Unidos³. Embolia pulmonar é a obstrução da artéria pulmonar e é a consequência mais grave do tromboembolismo venoso. A principal fonte de obstrução pulmonar é o trombo venoso profundo, principalmente dos segmentos venosos iliofemoral^4,5,6. Trombose venosa profunda (DVT) tem sequelas inerentes além de obstruções pulmonares, com complicações de longo prazo que resultam em dor, inchaço, ulcerações nas pernas e amputações de membros^7,8,9. Para obstruções críticas, o cateter direcionado trombolítico (CDT) é a abordagem de linha de frente para a recanalização do vaso¹⁰. O resultado do CDT depende de uma série de fatores, incluindo idade do trombo, localização, tamanho, composição, etiologia e risco do paciente categoria¹¹. Além disso, o CDT está associado a danos vasculares, infecções, complicações hemorrágicas e longo tempo de tratamento¹⁰. Os dispositivos de próxima geração visam combinar tromboctomia mecânica com trombolíticos (ou seja, trombioscaica farmacomecchanical)^12,13. O uso desses dispositivos diminui a dosagem lítica levando a complicações hemorrágicos reduzidas, e encurtou o tempo de tratamento^12,13,14 em comparação com o CDT. Estes dispositivos ainda mantêm problemas de efeitos colaterais hemorrágicos e remoção incompleta do trombo crônico¹⁵. Assim, é necessária uma estratégia adjuvante que pode remover o trombo completamente com complicações de sangramento mais baixos.

Uma abordagem potencial é o tratamento trombolítico auxiliado por histotripsy, chamado de lysotripsy. Histotripsy é uma modalidade de tratamento não invasiva que usa ultrassom focalizado para nuclear nuvens de bolhas nos tecidos¹⁶. A atividade bolha é gerada não através de núcleos exógenos, mas pela aplicação de pulsos de ultrassom com tensão suficiente para ativar núcleos intrínsecos aos tecidos, incluindo coágulo^17,18. A oscilação mecânica da nuvem de bolhas transmite tensão ao coágulo, desintegrando a estrutura em detritos acelulares¹⁹. A atividade da bolha histotripsy proporciona uma degradação efetiva de coágulos sanguíneos retraídos e não retraídos tanto in vivo quanto in vitro^20,21,22. Estudos anteriores^{têm 23,24} demonstraram que a combinação de histotripsia e o ativador de plasminogen recombinante lítico (rt-PA) aumenta significativamente a eficácia do tratamento em comparação apenas com a lítico ou histotripsia. Acredita-se que dois mecanismos primários associados à atividade da bolha histotripsia são responsáveis pela melhor eficácia do tratamento: 1) aumento da fibrinolise devido ao aumento da isca e 2) hemólise dos glóbulos vermelhos dentro do coágulo. A maior parte da massa do coágulo é composta por glóbulos vermelhos²⁴, e, portanto, o rastreamento da degradação do eritrócito é um bom substituto para a ablação da amostra. Outros elementos de coágulos formados também são provavelmente desintegrados sob atividade de bolhas histotripsy, mas não são considerados neste protocolo.

Aqui, uma abordagem de bancada para tratar DVT in vitro com lysotripsy é delineada. O protocolo descreve parâmetros operacionais críticos da fonte de histotripsia, avaliação da eficácia do tratamento e orientação de imagem. O protocolo inclui projetar um canal de fluxo para imitar um segmento venoso iliofemoral e fabricar coágulos sanguíneos inteiros humanos. O procedimento experimental descreve o posicionamento da fonte de histotripsia e da matriz de imagens para alcançar a exposição à histotripsia ao longo do coágulo colocado no canal de fluxo. São definidos parâmetros relevantes de insalação para atingir a interrupção do coágulo e minimizar a atividade da bolha fora do alvo. O uso de ultrassom para orientação e avaliação da atividade bolha é ilustrado²⁴. Métricas para quantificar a eficácia do tratamento, como perda de massa de coágulos, D-dimer (fibrinolise) e hemoglobina (hemolise) são delineadas^{23,24,25,26,27}. No geral, o estudo fornece um meio eficaz para executar e avaliar a eficácia da lysotripsy para tratar DVT.

Para os resultados aqui apresentados, o sangue humano venoso foi extraído para formar coágulos após aprovação do conselho de revisão interna local (IRB nº 19-1300) e consentimento informado por escrito fornecido pelos doadores voluntários²⁴. Esta seção descreve um protocolo de design para avaliar a eficácia da lysotripsy. O protocolo é baseado em um trabalho anterior de Bollen et al.²⁴.

1. Modelagem de coágulos

NOTA: Prepare os coágulos dentro de 2 semanas, mas mais de 3 dias antes do dia do experimento para garantir a estabilidade do coágulo e maximizar a retração²⁸. Prepare o coágulo após a aprovação do conselho de revisão institucional local.

1. Prepare a pipeta Pasteur borossilicato para armazenar o sangue (consulte Tabela de Materiais para especificações da pipeta). Os tubos de borossilicato são utilizados devido à natureza hidrofílica do material que promove a ativação das plaquetas e a retração do coágulo²⁹. Sele a ponta da pipeta através do aquecimento sobre um queimador Bunsen.
2. Tire sangue venoso humano fresco. Alíquotar o sangue total extraído em incrementos de 2 mL por coágulo desejado. Transfira cada alíquota de 2 mL para uma pipeta Pasteur.
   NOTA: Execute a etapa 1.2 dentro de aproximadamente 3 minutos de coleta de sangue para que o sangue não coagula antes de ser transferido para pipetas. Além disso, certifique-se de que o doador voluntário não está tocendo em nenhum medicamento que possa alterar a cascata de coagulação (por exemplo, anticoagulantes ou inibidores de plaquetas).
3. Incubar as alíquotas de sangue dentro das pipetas (igual ao número de coágulos necessários) em um banho de água por 3h a 37 °C.
4. Armazene as pipetas por uma mínima de 3 dias a 4 °C para permitir a retração dos coágulos²⁸. À medida que os coágulos se retraem, o soro será observado para acumular na parte superior do coágulo dentro da pipeta. A resposta rt-PA dos coágulos permanece estável por 2 semanas após a retração²⁸.

2. Preparação do reservatório de água

1. Encha o reservatório de água com água de osmose reversa. Forre a superfície inferior do tanque com um material absorvente acústico para reduzir o reflexo da terapia ou pulsos de ultrassom por imagem. Use um sistema de manuseio de água para desgas e filtrar a água para minimizar os núcleos de bolhas.
   NOTA: Uma maneira de filtrar a água é usando um filtro inline. As especificações da bolsa utilizada para a geração dos resultados representativos são dadas na Tabela de Materiais.
2. Coloque dois elementos de aquecimento na superfície inferior do tanque. Aqueça a água a 37,3 °C para atingir a atividade enzimática lítica máxima³⁰.
3. Configure um canal de fluxo como mostrado na Figura 1A. O canal de fluxo consiste em tubos, um vaso modelo com material e propriedades geométricas representativas de uma veia iliofemoral, um reservatório para plasma e uma seringa na extremidade mais dística do reservatório (Tabela de Materiais). A seringa é conectada a uma bomba para regular um fluxo através do canal durante o experimento.
4. Submergir manualmente o canal de fluxo na caixa d'água para levar o canal à temperatura fisiológica durante o estágio de desgaseza/filtragem/aquecimento (etapas 2.1 e 2.2).

3. Preparação de plasma e mistura rt-PA

1. Antes do dia do experimento
   NOTA: Quando armazenado a -80 °C, o plasma é estável por pelo menos 2,5 anos³¹ e o rt-PA é estável por pelo menos 7 anos³². Portanto, execute a etapa 3.1 a qualquer momento dentro desses períodos para garantir a estabilidade dos dois componentes.
   1. Diluir o rt-PA obtido de um fabricante em pó para 1 mg/mL em água estéril.
   2. Alíquota de 100 μL de rt-PA diluído em tubos de centrífugas de 0,5 mL e armazená-los a -80 °C.
   3. Alíquota de 35 mL de plasma humano fresco-congelado tipo O em tubos de centrífugas de 50 mL. Armazene os tubos a -80 °C.
2. No dia do experimento
   1. Recupere alíquotas de plasma do congelador. Recupere tantas alíquotas quanto o número de coágulos a serem testados naquele dia. Mergulhe as alíquotas congeladas em um banho de água a 37 °C para descongelar (~10 min).
   2. Uma vez que o plasma tenha descongelado, despeje-o em um béquer que é lavado triply com água ultrapura. Cubra levemente a boca do béquer com papel alumínio para evitar contaminação e coloque o béquer no banho de água. Deixe que a folha fique solta o suficiente para permitir que o ar entre em contato com o plasma.
   3. Deixe o plasma equilibrar a 37 °C a pressão atmosférica por pelo menos 2 h.
   4. Tire os frascos congelados rt-PA e coloque no gelo até que seja necessário, com um frasco para cada experimento executado.
   5. Faça baixa agarose de gelagem (2%) em um frasco de 50 mL, dissolvendo agarose em água ultrauso. Escolha a quantidade total de solução agarose de tal forma que aproximadamente 2 mL esteja disponível para cada amostra a ser analisada. Aqueça a solução em frasco em um micro-ondas até borbulhar. Fixar o frasco com uma tampa de parafuso impermeável sobre ele. Submergir o frasco no banho de água ao lado do plasma.
      NOTA: Esta etapa garante que a agarose esteja disponível para garantir segmentos de coágulos expostos para análise de histologia após a inssonação da histotripsia.

4. Configuração da fonte histotripsy e da matriz de imagem

1. Certifique-se de que os posicionadores motorizados podem ser controlados a partir do ambiente de tempo de execução de uma plataforma de programação, usando instruções e comandos fornecidos pelo fabricante. Verifique se os motores do sistema estão conectados à porta apropriada do computador com o ambiente de tempo de execução.
2. Monte a fonte histotripsy no sistema de posicionamento motorizado, como mostrado na Figura 1B.
3. Conecte a fonte histotripsy à sua eletrônica de condução (por exemplo, amplificador de energia e gerador de função) através dos conectores apropriados (por exemplo, cabos BNC) conforme especificado pelo fabricante.
   NOTA: Certifique-se de que a eletrônica de condução da fonte histotripsy pode ser controlada através do ambiente de tempo de execução usado na etapa 4.1.
4. Cubra a matriz de imagens com uma tampa de sonda e afixe a matriz coaxialmente na abertura da fonte histotripsy, como mostrado na Figura 2. Certifique-se de entender a orientação do plano de imagem em relação à orientação da fonte histotripsy.
5. Conecte a matriz de imagens a um sistema de varredura de ultrassom. Certifique-se de que este sistema possa controlar a operação e o acionamento do conjunto de imagens e coletar dados de imagem, de acordo com os comandos fornecidos pelo fabricante do scanner.
6. Submergir a matriz de fonte/imagem histotripsy no tanque enquanto desgaseando como mostrado na Figura 1A. Remova suavemente quaisquer bolhas de ar usando uma seringa da superfície da fonte de histotripsia ou matriz de imagem.
   NOTA: Mergulhe a matriz de fonte e imagem de histotripsy completamente na água antes da operação. Evite tocar na superfície da fonte de histotripsia.
7. Adquira imagens de modo B a uma taxa de 20 quadros por segundo usando o conjunto de imagens e os comandos incorporados do scanner. Ajuste a janela de imagem para garantir a visualização do foco da fonte histotripsy nessas imagens em tempo real.
   NOTA: Supõe-se que as dimensões da região focal da fonte terapêutica são conhecidas.
8. Defina os parâmetros operacionais da fonte histotripsy, incluindo frequência fundamental (por exemplo, 1,5 MHz), frequência de repetição de pulso (por exemplo, 20-100 Hz), duração do pulso (por exemplo, 1-20 ciclos por pulso) e número total de pulsos por local (por exemplo, 100-2.000)^18,23,24,33. Modifique esses parâmetros se a lise de coágulos suficiente não for alcançada ou se a atividade da bolha se estender além do lúmen do vaso modelo. Para definir esses parâmetros, use o protocolo fornecido pelo fabricante da fonte ou use uma plataforma de programação que possa se comunicar com a fonte (Passo 4.3).
9. Utilizando o protocolo do fabricante ou a plataforma de programação utilizada na etapa 4.8, execute a fonte de histotripsy apenas nos parâmetros definidos apenas em água desgasejada, sem qualquer obstrução no ambiente circundante. Aumente a tensão aplicada à fonte histotripsy até formar uma nuvem de bolha.
10. Usando a imagem em tempo real da etapa 4.7, ajuste a posição da matriz de imagem dentro da abertura do transdutor confocal até que a nuvem de bolha esteja localizada aproximadamente no centro da janela da imagem. A nuvem bolha é a região de pixels hiperecóicos no plano de imagem(Figura 3). Aperte os parafusos para segurar firmemente a matriz de imagem na abertura do transdutor.
    NOTA: Se a matriz estiver alinhada corretamente, a posição azimutal da nuvem de bolha deve estar aproximadamente a 0 mm no plano de imagem. O conjunto de imagens pode projetar ligeiramente da superfície interna da fonte da terapia e, portanto, a posição de alcance da nuvem de bolha pode diferir da distância focal da fonte.
11. Identifique a localização da nuvem de bolha no plano de imagem. Atribuir o foco da fonte histotripsy como o centro da nuvem de bolha(Figura 3).
12. Regisso local focal detectado (passo 4.11) na janela de imagem(Figura 3). Uma maneira possível de marcar a posição focal é colocar um cursor para observar a localização na janela de imagem, se disponível com a plataforma de imagem.
13. Descontinuar a inssaração e definir a tensão aplicada na fonte histotripsy em 0 V.

5. Preparação do coágulo

1. Remova o coágulo da pipeta cortando a extremidade selada com alicates. Deixe o coágulo deslizar em uma placa de Petri junto com o soro. Se o coágulo não se desalojar, aplique suavemente pressão do outro lado da pipeta através de descarga salina para remover o coágulo.
2. Corte o coágulo para 1 cm de comprimento usando um bisturi, visando uma peça uniforme do centro (ou seja, longe de seções do coágulo formado na parte superior ou inferior da pipeta).
3. Use uma limpeza para borrar a seção de corte do coágulo suavemente para remover o excesso de fluido.
4. Usando pinças, coloque a seção de coágulos suavemente em uma balança de pesagem e regise o peso.
5. Levante manualmente o canal de fluxo para fora do reservatório de água e remova o vaso modelo do canal de fluxo.
6. Coloque o coágulo no vaso modelo usando pinças e conecte o vaso modelo novamente ao canal de fluxo.
   NOTA: Uma haste de nylon pode ser colocada dentro do vaso modelo para evitar que o coágulo se mova rio abaixo devido ao fluxo.
7. Abaixe o canal de vazão para dentro do tanque de tal forma que a extremidade proximal do estágio em relação ao reservatório seja baixa em comparação com o lado distal. A angling do palco desta forma evita a captura de bolhas no vaso modelo quando o plasma é puxado através do canal de fluxo na etapa 6.1.
8. Adicione 30 mL de plasma ao reservatório usando uma pipeta e monitore a temperatura até atingir pelo menos 36 °C.
9. Use uma pipeta para distribuir o rt-PA (80,4 μg em 30 mL de plasma, 2,68 μg/mL) no reservatório de plasma. Mexa o plasma com a pipeta para garantir uma distribuição uniforme de RT-PA dentro do reservatório.

6. Priming o canal de fluxo

1. Desenhe plasma para o canal de fluxo do reservatório através da bomba de seringa até que o plasma encha o vaso modelo.
   NOTA: Se o coágulo não estiver alinhado com a haste de nylon, use desenhos curtos da bomba a 60 mL/min para tentar forçar o plasma rio abaixo do coágulo ou desenhar manualmente através da seringa. Limitar a quantidade de plasma desenhada neste processo ou reabastecer o reservatório usando plasma/rt-PA adicional para garantir 30 mL de solução no canal de fluxo.
2. Utilizando os posicionadores motorizados, alinhe a matriz de imagem paralelamente ao comprimento do coágulo usando o script de imagem (etapa 4.7). O alinhamento paralelo permite ao usuário garantir visualmente a colocação adequada do coágulo e a ausência de bolhas dentro do vaso modelo.
3. Nivele o vaso do modelo manual e visualmente para garantir que não haja bolhas de ar usando a janela de imagem (etapa 4.7).

7. Procedimento de experimento

1. Pré-tratamento
   NOTA: Este passo é planejar um caminho para a matriz de fonte/imagem de histotripsy para exposição uniforme de histotripsia ao longo do comprimento do coágulo.
   1. Alinhe a matriz de imagens usando os posicionadores motorizados de tal forma que o plano de imagem seja paralelo à seção transversal do coágulo (ou seja, perpendicular à orientação descrita na etapa 6.2).
   2. Sob orientação através da janela de imagem (etapa 4.7), mova a fonte de histotripsia para a extremidade proximal do coágulo em relação ao reservatório usando os posicionadores motorizados. Neste ponto, ajuste a posição de fonte de histotripsia de modo que o ponto focal marcado na etapa 4.12 se alinhe com o centro do coágulo.
   3. Determine o caminho de inseção ao longo do comprimento do coágulo. Para definir esse caminho, defina três pontos de passagem ao longo do comprimento do coágulo (ou seja, posições dos motores onde a atividade da bolha histotripsy está contida dentro do coágulo) em incrementos de 5 mm. Alinhar os pontos de passagem de modo que o movimento geral da fonte histotripsy ao longo do caminho é antegrado com o fluxo no sistema (ou seja, o primeiro ponto de passagem está na extremidade mais proximal do coágulo em relação ao reservatório, e o terceiro ponto de passagem está na posição distal em relação ao reservatório).
   4. Antes de finalizar cada ponto de passagem, pulsos de teste de fogo da fonte histotripsy com os mesmos parâmetros de insalação da etapa 4.8, mas reduzem a exposição geral a 10 pulsos totais. Ajuste a posição da fonte histotripsy usando os posicionadores motorizados, se necessário, para conter a atividade da bolha dentro do coágulo.
   5. Em cada ponto de passagem, salve as posições do motor usando os comandos fornecidos pelo fabricante, semelhantes à etapa 4.1.
2. Tratamento
   NOTA: Esta etapa define o procedimento para tratar o coágulo ao longo de seu comprimento de acordo com o caminho definido na etapa pré-tratamento.
   1. Execute a bomba de seringa a 0,65 mL/min e espere o menisco do plasma se mover. Esta taxa de fluxo imita uma oclusão quase total da vasculatura iliofemoral^24,34.
   2. Interpolar o caminho criado na etapa 7.1.3 com passos intermediários entre os pontos de passagem estabelecidos com um tamanho de passo fixo (por exemplo, 0,5 mm). O tamanho da etapa é escolhido para ser menor que metade da largura da região focal medida ao longo do comprimento do coágulo (direção elevatória do conjunto de imagens). Mova a fonte histotripsy usando posicionadores motorizados em cada local de trajeto com parâmetros de inseção definidos na etapa 4.8.
   3. Monitor/atividade de bolha de imagem durante a aplicação do pulso histotripsy em cada local do caminho usando a janela de imagem (passo 4.7). Centralizar a imagem no foco histotripsy com as dimensões da imagem cobrindo 15 mm no azimute e alcance. Antes da aplicação do pulso histotripsy em cada local, adquira uma imagem no modo B para fornecer visualização do coágulo e do vaso modelo, criando um script em uma plataforma de programação. Certifique-se de que o script estabelece a comunicação com o scanner usando os comandos do fabricante.
   4. Durante a aplicação do pulso histotripsy, implemente a aquisição de emissões acústicas no script na etapa 7.2.3 para formar imagens passivas de cavitação pós hoc³⁵. Adquira uma imagem de cavitação passiva após cada 10 pulsos de tratamento. Aplique uma compensação de ganho de tempo fixo de 50 a 8 profundidades incrementais até o final da profundidade de imagem. Escolha um tamanho adequado da janela de aquisição, de tal forma que todo o sinal do coágulo seja capturado com perda mínima de energia devido à janela³⁵.
   5. Se houver nuvens de bolha fora do alvo, ajuste a posição do transdutor in situ com os posicionadores motorizados.
      NOTA: Monitor para gatilhos perdidos da matriz de imagens. Ajuste o número de conjuntos de dados de imagem adquiridos para garantir que o armazenamento de dados seja concluído antes do acionamento subsequente.

8. Procedimento pós-experimento

1. Levante manualmente o vaso modelo para fora do reservatório de água para drenar o perfusado através da gravidade. Certifique-se de manter o canal de fluxo nivelado para evitar que o coágulo se mova rio abaixo e para fora do vaso modelo durante a drenagem.
2. Colete todo o perfusato para análise posterior em um pequeno béquer (Figura 4A) desenhando solução de plasma do canal de fluxo através da bomba de seringa a uma taxa de fluxo muito baixa.
3. Desconecte o vaso modelo e remova o coágulo. Se necessário, injete uma pequena quantidade de soro fisiológico no vaso modelo para desalojar suavemente o coágulo.
4. Limpe o coágulo semelhante ao passo 1.2.3. Pesar o coágulo na balança de pesagem para avaliar a perda de massa do coágulo.
5. Para analisar o teor d-dimer, adicione 100 mg de ácido aminocaúnico a um tubo de microcentrífuga seguido de 1 mL de perfusato, e misture bem usando uma pipeta. Realize um ensaio imune-turbimétrico de látex para quantificar o d-dimer dentro da amostra³⁶.
6. Para avaliar a hemólise, adicione 1 mL de perfusato aos tubos de centrífuga e gire a 610 x g (3.500 rpm) por 10 min. Combine 0,5 mL de supernasciente (concentrado) com 0,5 mL de solução Drabkins e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Transfira 200 μL para placas de poço, conforme mostrado na Figura 4B. Use um leitor de placas para ler absorvância a 540 nm, Figura 4C (ensaio Drabkins³⁷).
7. Avaliação de histologia
   1. Corte uma seção do centro do coágulo de cerca de 2-3 mm de comprimento com um bisturi.
   2. Adicione a seção a um. Mantenha a orientação da seção em relação à direção da propagação do pulso histotripsy.
   3. Adicione 2 mL de solução de agarose de gelagem baixa preparada na etapa 3.2.5 no para fixar o coágulo no lugar.
   4. Fixar a amostra em 10% de formalina por 24 h. Coloque a amostra em 70% de álcool após 24 h e realize a coloração padrão de hemotoxylin-eosina³⁸.

9. Análise passiva da imagem da cavitação

1. Processe os sinais adquiridos da matriz de imagens durante a excitação histotripsy (etapa 7.2.4) usando um algoritmo baseado no robusto feixe Capon³⁹ para criar uma imagem de emissões acústicas geradas pela nuvem de bolha em cada local de tratamento.
   NOTA: Para gerar imagens quantitativas, siga os passos descritos em Haworth et al.³⁵. Caso contrário, cada valor de pixel na imagem deve representar a energia acústica da nuvem de bolha relativa (unidades de V²) em cada local correspondente.
2. Segmentar a imagem do modo B acotodos nas etapas 7.2.3 para distinguir entre os pixels que representam o coágulo e o vaso modelo.
3. Co-registre a imagem de cavitação passiva com a imagem do modo B, conforme mostrado na Figura 5B. Resumindo a energia acústica dentro do coágulo durante o período de exposição³⁵.

O protocolo descrito neste estudo destaca os detalhes da modelagem de coágulos venosos, da linsotripsia para interrupção do coágulo e da ultrassom em uma configuração in vitro de DVT. O procedimento adotado demonstra as etapas necessárias para avaliar a interrupção do coágulo devido aos efeitos combinados da atividade da nuvem de bolhas rt-PA e histotripsy. A configuração do bancada foi projetada para imitar as características de uma veia iliofemoral venosa. A Figura 1A mostra um vaso modelo que tem as propriedades acústicas, mecânicas e geométricas da veia iliofemoral. O coágulo é colocado dentro do vaso modelo para imitar um trombo parcialmente oclusivo. O coágulo é perfundido com plasma e rt-PA extraído de um reservatório a uma taxa de 0,65 mL/min. Esta taxa é consistente com a taxa de fluxo lenta em um navio altamente ocluído34.

Um transdutor elíptico focado de 1,5 MHz com eixo principal de 9 cm, eixo menor de 7 cm e 6 cm de distância focal(Figura 2A) é montado no sistema de posicionamento, conforme observado na Figura 1B. Uma matriz de imagem coberta com gel de ultrassom e uma tampa de látex (Figuras 2B,C) é montada coaxialmente com o transdutor como mostrado na Figura 1A através de uma abertura no centro da fonte histotripsia. Os posicionadores motorizados foram utilizados para traduzir a matriz de transdutor/imagem terapêutica ao longo do comprimento do coágulo dentro do vaso modelo (Figura 1). Após a aplicação de tensão suficiente à fonte histotripsy, uma nuvem de bolha é gerada na região focal do transdutor e visualizada via ultrassom, conforme mostrado na Figura 3. A posição focal é definida como o centro da nuvem de bolha usando o plano de imagem (passos 4.10-4.11).

A Figura 4A mostra perfusatos coletados para duas condições de tratamento diferentes. O béquer rotulado como controle contém perfusato de um coágulo exposto apenas ao plasma. O segundo béquer rotulado como tratado contém o perfusato do coágulo tratado de lysotripsy. Os perfusados coletados são usados para avaliar o teor de hemoglobina (métrica de hemolise) e D-dimer (métrica de fibrinolise) através de ensaios especificados no protocolo. A diferença de cor dos perfusados denota variabilidade na concentração de hemoglobina, que pode ser quantificada através da absorção óptica. A relação entre o valor da absorvência e a concentração de hemoglobina pode ser determinada através de uma curva de calibração. Soluções com conteúdo conhecido de hemoglobina que variam de 0 (medição em branco) a 180 mg/mL são colocadas na placa do poço e a absorção é determinada em triplicado usando o leitor de placas (Figura 4B,C). O limite superior de absorção do leitor de placas pode variar e pode não ser conhecido a priori para fazer as soluções na placa do poço. Como tal, concentrações de hemoglobina de até 180 mg/mL são feitas na placa do poço, Figura 4B. No entanto, o leitor de placas usado aqui pode ler absorvência para concentrações de até 23 mg/mL apenas, Figura 4C.

A Figura 5A mostra a visualização do coágulo dentro do vaso modelo via imagem do modo B antes da exposição à histotripsia, conforme especificado na etapa 7.2.3. Esta imagem é adquirida para determinar a posição do coágulo para segmentação da imagem de cavitação passiva. A Figura 5B mostra a imagem de cavitação passiva co-registrada com a imagem do modo B adquirida antes da exposição à histotripsia. Esta figura confirma que a energia acústica está contida principalmente dentro do coágulo durante a exposição à histotripsia.

A interrupção típica do coágulo devido à histotripsia e à lítico são indicadas na Figura 6. Figura 6A, B mostram as imagens de coágulos tratados não tratados e lysotripsy, respectivamente. Para amostras expostas à histotripsia, a interrupção é restrita principalmente ao centro do coágulo, consistente com os locais observados de atividade de bolhas rastreados com imagem de cavitação passiva(Figura 5B). No entanto, com a adição de lítico, a perda de massa também ocorre em regiões mais próximas da periferia do coágulo. É hipótese de que essa perda de massa adicional se deve à maior mistura de fluidos do lítico sob atividade de bolha. A mistura de fluidos aumenta a profundidade de distribuição e penetração do lítico no coágulo. Como o lítico é responsável pela fibrinolise40,a perda de massa aumenta. A fibrinólise pode ser quantificada medindo o teor de D-dimer no perfusado41.

Figura 1: Configuração experimental para lisotripsia de coágulo sanguíneo humano. (A) Os componentes da configuração são (1) fonte de histotripsia focada com geometria elíptica, (2) matriz de imagem coberta de látex, (3) vaso modelo ligado ao canal de fluxo, (4) canal de fluxo, (5) reservatório, (6) material absorvente acústico, (7) elemento de aquecimento e (8) tanque de água cheio de água desgaseada e aquecida de osmose reversa. A dimensão azimuth do plano de imagem é perpendicular às dimensões elevacionais e de alcance (na página). (B) A fonte de histotripsia montada no sistema de posicionamento motorizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fonte de ultrassom e componentes de imagem. Imagens individuais ampliadas de (A) concentraram a fonte de histotripsia, (B) matriz de imagem, e (C) matriz de imagem com gel de ultrassom e tampa de látex. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Nuvem de bolha histotripsy visualizada usando matriz de imagem. Uma nuvem de bolha é gerada na zona focal da fonte histotripsy e imagem usando uma matriz de imagem. O foco designado, mostrado como uma cruz, é guardado para o planejamento do tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Quantificação da hemoglobina liberada devido à lise coagulação. (A) Amostras de perfusato coletadas após estudo de controle com plasma sozinho (sem histotripsia ou lítico), e braço de tratamento, histotripsia (por exemplo, pressão máxima de 35 MPa, duração do pulso de 5 ciclo, frequência fundamental de 1,5 MHz) e 2,68 μg/mL de exposição ótica. (B) Placa de poço contendo diluições de concentrações conhecidas de hemoglobina variando de 180 mg/mL (linha superior, canto esquerdo) a 0 mg/mL (linha inferior, canto mais à direita). A ponta da flecha aponta para a diminuição da concentração de hemoglobina. (C) Estas amostras são usadas para criar uma curva padrão para quantificar a hemoglobina produzida devido à exposição à histotripsia através da espectrofotometria. A curva de absorvimento para concentrações de hemoglobina variando de 0 a 23 mg/mL é obtida devido à limitação do leitor de placas na análise de concentrações mais elevadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens do coágulo durante o tratamento. (A) Imagem do modo B adquirida antes do início do pulso do tratamento mostrando a posição do coágulo dentro do vaso modelo. (B) Visualização pós-hoc de emissão de energia análoga calculada a partir de imagens de cavitação passiva mostradas em colormap quente co-registrado com imagem de modo B do coágulo adquirido antes da aplicação do pulso histotripsy. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Histologia do coágulo ablado em diferentes condições de tratamento. (A) Controladora do coágulo sem tratamento. (B) Coágulo tratado com lisotripsia (por exemplo, pressão negativa de pico de 35 MPa, duração do pulso de ciclo único, frequência fundamental de 1,5 MHz). O pulso histotripsy se propagava de cima para baixo nesta imagem. O caminho para a fonte histotripsy ao longo do comprimento do coágulo (ou seja, perpendicular ao plano da imagem mostrada aqui) é definido na etapa 7.2.3. A escala dos micrografos é de 2 mm. Observe que o grau de interrupção do coágulo alcançado aqui seria reduzido em comparação com esquemas de inssonação com maior duração de pulso24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.