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Artigo de método

Um sistema in vitro para medir a eficácia trombolítica da histotripsia e uma droga lítica

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⸱

DOI:

10.3791/62133

⸱

4 de junho de 2021

 ,  , 
1Department of Radiology, University of Chicago, 2Graduate Program in Medical Physics, University of Chicago

Neste artigo

Resumo

A entrega de líticos auxiliados por histotripsy ou a lysotripsy está em desenvolvimento para o tratamento de trombose venosa profunda. Um procedimento in vitro é apresentado aqui para avaliar a eficácia desta terapia combinada. São discutidos protocolos-chave para o modelo de coágulo, orientação de imagem e avaliação da eficácia do tratamento.

Resumo

A trombose venosa profunda (DVT) é uma preocupação global para a saúde. A abordagem primária para alcançar a recanalização do vaso para obstruções críticas é a trombolíticos orientados pelo cateter (CDT). Para mitigar os efeitos colaterais cáusticos e o longo tempo de tratamento associado ao CDT, abordagens adjuvantes e alternativas estão em desenvolvimento. Uma dessas abordagens é a histotripsia, uma ultrassonografia focada para ablate tecido através da nucleação de nuvens de bolhas. Estudos pré-clínicos demonstraram forte sinergia entre histotripsia e trombolíticos para degradação do coágulo. Este relatório descreve um método de bancada para avaliar a eficácia da terapia trombolítico auxiliada em histotripsia, ou lysotripsy.

Coágulos fabricados a partir de sangue venoso humano fresco foram introduzidos em um canal de fluxo cujas dimensões e propriedades acousto-mecânicas imitam uma veia iliofemoral. O canal foi perfundido com plasma e o ativador de plasminogen recombinante lincático. Nuvens de bolha foram geradas no coágulo com uma fonte de ultrassom focada projetada para o tratamento de coágulos venosos femorais. Posicionadores motorizados foram usados para traduzir o foco de origem ao longo do comprimento do coágulo. Em cada local de inssonação, as emissões acústicas da nuvem bolha foram passivamente registradas e antenadas para gerar imagens de cavitação passiva. As métricas para medir a eficácia do tratamento incluíram perda de massa de coágulos (eficácia geral do tratamento), e as concentrações de D-dimer (fibrinolise) e hemoglobina (hemolise) no perfusato. Há limitações para este design in vitro, incluindo a falta de meios para avaliar efeitos colaterais in vivo ou mudanças dinâmicas na taxa de fluxo à medida que o coágulo lise. No geral, a configuração fornece um método eficaz para avaliar a eficácia das estratégias baseadas em histotripsia para tratar DVT.

Introdução

Trombose é a condição de formação de coágulos em um vaso sanguíneo saudável que obstrui a circulação1,2. O tromboembolismo venoso tem um custo anual de saúde de US $ 7-10 bilhões, com 375.000-425.000 casos nos Estados Unidos3. Embolia pulmonar é a obstrução da artéria pulmonar e é a consequência mais grave do tromboembolismo venoso. A principal fonte de obstrução pulmonar é o trombo venoso profundo, principalmente dos segmentos venosos iliofemoral4,5,6. Trombose venosa profunda (DVT) tem sequelas inerentes além de obstruções pulmonares, com complicações de longo prazo que resultam em dor, inchaço, ulcerações nas pernas e amputações de membros7,8,9. Para obstruções críticas, o cateter direcionado trombolítico (CDT) é a abordagem de linha de frente para a recanalização do vaso10. O resultado do CDT depende de uma série de fatores, incluindo idade do trombo, localização, tamanho, composição, etiologia e risco do paciente categoria11. Além disso, o CDT está associado a danos vasculares, infecções, complicações hemorrágicas e longo tempo de tratamento10. Os dispositivos de próxima geração visam combinar tromboctomia mecânica com trombolíticos (ou seja, trombioscaica farmacomecchanical)12,13. O uso desses dispositivos diminui a dosagem lítica levando a complicações hemorrágicos reduzidas, e encurtou o tempo de tratamento12,13,14 em comparação com o CDT. Estes dispositivos ainda mantêm problemas de efeitos colaterais hemorrágicos e remoção incompleta do trombo crônico15. Assim, é necessária uma estratégia adjuvante que pode remover o trombo completamente com complicações de sangramento mais baixos.

Uma abordagem potencial é o tratamento trombolítico auxiliado por histotripsy, chamado de lysotripsy. Histotripsy é uma modalidade de tratamento não invasiva que usa ultrassom focalizado para nuclear nuvens de bolhas nos tecidos16. A atividade bolha é gerada não através de núcleos exógenos, mas pela aplicação de pulsos de ultrassom com tensão suficiente para ativar núcleos intrínsecos aos tecidos, incluindo coágulo17,18. A oscilação mecânica da nuvem de bolhas transmite tensão ao coágulo, desintegrando a estrutura em detritos acelulares19. A atividade da bolha histotripsy proporciona uma degradação efetiva de coágulos sanguíneos retraídos e não retraídos tanto in vivo quanto in vitro20,21,22. Estudos anteriorestêm 23,24 demonstraram que a combinação de histotripsia e o ativador de plasminogen recombinante lítico (rt-PA) aumenta significativamente a eficácia do tratamento em comparação apenas com a lítico ou histotripsia. Acredita-se que dois mecanismos primários associados à atividade da bolha histotripsia são responsáveis pela melhor eficácia do tratamento: 1) aumento da fibrinolise devido ao aumento da isca e 2) hemólise dos glóbulos vermelhos dentro do coágulo. A maior parte da massa do coágulo é composta por glóbulos vermelhos24, e, portanto, o rastreamento da degradação do eritrócito é um bom substituto para a ablação da amostra. Outros elementos de coágulos formados também são provavelmente desintegrados sob atividade de bolhas histotripsy, mas não são considerados neste protocolo.

Aqui, uma abordagem de bancada para tratar DVT in vitro com lysotripsy é delineada. O protocolo descreve parâmetros operacionais críticos da fonte de histotripsia, avaliação da eficácia do tratamento e orientação de imagem. O protocolo inclui projetar um canal de fluxo para imitar um segmento venoso iliofemoral e fabricar coágulos sanguíneos inteiros humanos. O procedimento experimental descreve o posicionamento da fonte de histotripsia e da matriz de imagens para alcançar a exposição à histotripsia ao longo do coágulo colocado no canal de fluxo. São definidos parâmetros relevantes de insalação para atingir a interrupção do coágulo e minimizar a atividade da bolha fora do alvo. O uso de ultrassom para orientação e avaliação da atividade bolha é ilustrado24. Métricas para quantificar a eficácia do tratamento, como perda de massa de coágulos, D-dimer (fibrinolise) e hemoglobina (hemolise) são delineadas23,24,25,26,27. No geral, o estudo fornece um meio eficaz para executar e avaliar a eficácia da lysotripsy para tratar DVT.

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Protocolo

Para os resultados aqui apresentados, o sangue humano venoso foi extraído para formar coágulos após aprovação do conselho de revisão interna local (IRB nº 19-1300) e consentimento informado por escrito fornecido pelos doadores voluntários24. Esta seção descreve um protocolo de design para avaliar a eficácia da lysotripsy. O protocolo é baseado em um trabalho anterior de Bollen et al.24.

1. Modelagem de coágulos

NOTA: Prepare os coágulos dentro de 2 semanas, mas mais de 3 dias antes do dia do experimento para garantir a estabilidade do coágulo e maximizar a retração28. Prepare o coágulo após a aprovação do conselho de revisão institucional local.

  1. Prepare a pipeta Pasteur borossilicato para armazenar o sangue (consulte Tabela de Materiais para especificações da pipeta). Os tubos de borossilicato são utilizados devido à natureza hidrofílica do material que promove a ativação das plaquetas e a retração do coágulo29. Sele a ponta da pipeta através do aquecimento sobre um queimador Bunsen.
  2. Tire sangue venoso humano fresco. Alíquotar o sangue total extraído em incrementos de 2 mL por coágulo desejado. Transfira cada alíquota de 2 mL para uma pipeta Pasteur.
    NOTA: Execute a etapa 1.2 dentro de aproximadamente 3 minutos de coleta de sangue para que o sangue não coagula antes de ser transferido para pipetas. Além disso, certifique-se de que o doador voluntário não está tocendo em nenhum medicamento que possa alterar a cascata de coagulação (por exemplo, anticoagulantes ou inibidores de plaquetas).
  3. Incubar as alíquotas de sangue dentro das pipetas (igual ao número de coágulos necessários) em um banho de água por 3h a 37 °C.
  4. Armazene as pipetas por uma mínima de 3 dias a 4 °C para permitir a retração dos coágulos28. À medida que os coágulos se retraem, o soro será observado para acumular na parte superior do coágulo dentro da pipeta. A resposta rt-PA dos coágulos permanece estável por 2 semanas após a retração28.

2. Preparação do reservatório de água

  1. Encha o reservatório de água com água de osmose reversa. Forre a superfície inferior do tanque com um material absorvente acústico para reduzir o reflexo da terapia ou pulsos de ultrassom por imagem. Use um sistema de manuseio de água para desgas e filtrar a água para minimizar os núcleos de bolhas.
    NOTA: Uma maneira de filtrar a água é usando um filtro inline. As especificações da bolsa utilizada para a geração dos resultados representativos são dadas na Tabela de Materiais.
  2. Coloque dois elementos de aquecimento na superfície inferior do tanque. Aqueça a água a 37,3 °C para atingir a atividade enzimática lítica máxima30.
  3. Configure um canal de fluxo como mostrado na Figura 1A. O canal de fluxo consiste em tubos, um vaso modelo com material e propriedades geométricas representativas de uma veia iliofemoral, um reservatório para plasma e uma seringa na extremidade mais dística do reservatório (Tabela de Materiais). A seringa é conectada a uma bomba para regular um fluxo através do canal durante o experimento.
  4. Submergir manualmente o canal de fluxo na caixa d'água para levar o canal à temperatura fisiológica durante o estágio de desgaseza/filtragem/aquecimento (etapas 2.1 e 2.2).

3. Preparação de plasma e mistura rt-PA

  1. Antes do dia do experimento
    NOTA: Quando armazenado a -80 °C, o plasma é estável por pelo menos 2,5 anos31 e o rt-PA é estável por pelo menos 7 anos32. Portanto, execute a etapa 3.1 a qualquer momento dentro desses períodos para garantir a estabilidade dos dois componentes.
    1. Diluir o rt-PA obtido de um fabricante em pó para 1 mg/mL em água estéril.
    2. Alíquota de 100 μL de rt-PA diluído em tubos de centrífugas de 0,5 mL e armazená-los a -80 °C.
    3. Alíquota de 35 mL de plasma humano fresco-congelado tipo O em tubos de centrífugas de 50 mL. Armazene os tubos a -80 °C.
  2. No dia do experimento
    1. Recupere alíquotas de plasma do congelador. Recupere tantas alíquotas quanto o número de coágulos a serem testados naquele dia. Mergulhe as alíquotas congeladas em um banho de água a 37 °C para descongelar (~10 min).
    2. Uma vez que o plasma tenha descongelado, despeje-o em um béquer que é lavado triply com água ultrapura. Cubra levemente a boca do béquer com papel alumínio para evitar contaminação e coloque o béquer no banho de água. Deixe que a folha fique solta o suficiente para permitir que o ar entre em contato com o plasma.
    3. Deixe o plasma equilibrar a 37 °C a pressão atmosférica por pelo menos 2 h.
    4. Tire os frascos congelados rt-PA e coloque no gelo até que seja necessário, com um frasco para cada experimento executado.
    5. Faça baixa agarose de gelagem (2%) em um frasco de 50 mL, dissolvendo agarose em água ultrauso. Escolha a quantidade total de solução agarose de tal forma que aproximadamente 2 mL esteja disponível para cada amostra a ser analisada. Aqueça a solução em frasco em um micro-ondas até borbulhar. Fixar o frasco com uma tampa de parafuso impermeável sobre ele. Submergir o frasco no banho de água ao lado do plasma.
      NOTA: Esta etapa garante que a agarose esteja disponível para garantir segmentos de coágulos expostos para análise de histologia após a inssonação da histotripsia.

4. Configuração da fonte histotripsy e da matriz de imagem

  1. Certifique-se de que os posicionadores motorizados podem ser controlados a partir do ambiente de tempo de execução de uma plataforma de programação, usando instruções e comandos fornecidos pelo fabricante. Verifique se os motores do sistema estão conectados à porta apropriada do computador com o ambiente de tempo de execução.
  2. Monte a fonte histotripsy no sistema de posicionamento motorizado, como mostrado na Figura 1B.
  3. Conecte a fonte histotripsy à sua eletrônica de condução (por exemplo, amplificador de energia e gerador de função) através dos conectores apropriados (por exemplo, cabos BNC) conforme especificado pelo fabricante.
    NOTA: Certifique-se de que a eletrônica de condução da fonte histotripsy pode ser controlada através do ambiente de tempo de execução usado na etapa 4.1.
  4. Cubra a matriz de imagens com uma tampa de sonda e afixe a matriz coaxialmente na abertura da fonte histotripsy, como mostrado na Figura 2. Certifique-se de entender a orientação do plano de imagem em relação à orientação da fonte histotripsy.
  5. Conecte a matriz de imagens a um sistema de varredura de ultrassom. Certifique-se de que este sistema possa controlar a operação e o acionamento do conjunto de imagens e coletar dados de imagem, de acordo com os comandos fornecidos pelo fabricante do scanner.
  6. Submergir a matriz de fonte/imagem histotripsy no tanque enquanto desgaseando como mostrado na Figura 1A. Remova suavemente quaisquer bolhas de ar usando uma seringa da superfície da fonte de histotripsia ou matriz de imagem.
    NOTA: Mergulhe a matriz de fonte e imagem de histotripsy completamente na água antes da operação. Evite tocar na superfície da fonte de histotripsia.
  7. Adquira imagens de modo B a uma taxa de 20 quadros por segundo usando o conjunto de imagens e os comandos incorporados do scanner. Ajuste a janela de imagem para garantir a visualização do foco da fonte histotripsy nessas imagens em tempo real.
    NOTA: Supõe-se que as dimensões da região focal da fonte terapêutica são conhecidas.
  8. Defina os parâmetros operacionais da fonte histotripsy, incluindo frequência fundamental (por exemplo, 1,5 MHz), frequência de repetição de pulso (por exemplo, 20-100 Hz), duração do pulso (por exemplo, 1-20 ciclos por pulso) e número total de pulsos por local (por exemplo, 100-2.000)18,23,24,33. Modifique esses parâmetros se a lise de coágulos suficiente não for alcançada ou se a atividade da bolha se estender além do lúmen do vaso modelo. Para definir esses parâmetros, use o protocolo fornecido pelo fabricante da fonte ou use uma plataforma de programação que possa se comunicar com a fonte (Passo 4.3).
  9. Utilizando o protocolo do fabricante ou a plataforma de programação utilizada na etapa 4.8, execute a fonte de histotripsy apenas nos parâmetros definidos apenas em água desgasejada, sem qualquer obstrução no ambiente circundante. Aumente a tensão aplicada à fonte histotripsy até formar uma nuvem de bolha.
  10. Usando a imagem em tempo real da etapa 4.7, ajuste a posição da matriz de imagem dentro da abertura do transdutor confocal até que a nuvem de bolha esteja localizada aproximadamente no centro da janela da imagem. A nuvem bolha é a região de pixels hiperecóicos no plano de imagem(Figura 3). Aperte os parafusos para segurar firmemente a matriz de imagem na abertura do transdutor.
    NOTA: Se a matriz estiver alinhada corretamente, a posição azimutal da nuvem de bolha deve estar aproximadamente a 0 mm no plano de imagem. O conjunto de imagens pode projetar ligeiramente da superfície interna da fonte da terapia e, portanto, a posição de alcance da nuvem de bolha pode diferir da distância focal da fonte.
  11. Identifique a localização da nuvem de bolha no plano de imagem. Atribuir o foco da fonte histotripsy como o centro da nuvem de bolha(Figura 3).
  12. Regisso local focal detectado (passo 4.11) na janela de imagem(Figura 3). Uma maneira possível de marcar a posição focal é colocar um cursor para observar a localização na janela de imagem, se disponível com a plataforma de imagem.
  13. Descontinuar a inssaração e definir a tensão aplicada na fonte histotripsy em 0 V.

5. Preparação do coágulo

  1. Remova o coágulo da pipeta cortando a extremidade selada com alicates. Deixe o coágulo deslizar em uma placa de Petri junto com o soro. Se o coágulo não se desalojar, aplique suavemente pressão do outro lado da pipeta através de descarga salina para remover o coágulo.
  2. Corte o coágulo para 1 cm de comprimento usando um bisturi, visando uma peça uniforme do centro (ou seja, longe de seções do coágulo formado na parte superior ou inferior da pipeta).
  3. Use uma limpeza para borrar a seção de corte do coágulo suavemente para remover o excesso de fluido.
  4. Usando pinças, coloque a seção de coágulos suavemente em uma balança de pesagem e regise o peso.
  5. Levante manualmente o canal de fluxo para fora do reservatório de água e remova o vaso modelo do canal de fluxo.
  6. Coloque o coágulo no vaso modelo usando pinças e conecte o vaso modelo novamente ao canal de fluxo.
    NOTA: Uma haste de nylon pode ser colocada dentro do vaso modelo para evitar que o coágulo se mova rio abaixo devido ao fluxo.
  7. Abaixe o canal de vazão para dentro do tanque de tal forma que a extremidade proximal do estágio em relação ao reservatório seja baixa em comparação com o lado distal. A angling do palco desta forma evita a captura de bolhas no vaso modelo quando o plasma é puxado através do canal de fluxo na etapa 6.1.
  8. Adicione 30 mL de plasma ao reservatório usando uma pipeta e monitore a temperatura até atingir pelo menos 36 °C.
  9. Use uma pipeta para distribuir o rt-PA (80,4 μg em 30 mL de plasma, 2,68 μg/mL) no reservatório de plasma. Mexa o plasma com a pipeta para garantir uma distribuição uniforme de RT-PA dentro do reservatório.

6. Priming o canal de fluxo

  1. Desenhe plasma para o canal de fluxo do reservatório através da bomba de seringa até que o plasma encha o vaso modelo.
    NOTA: Se o coágulo não estiver alinhado com a haste de nylon, use desenhos curtos da bomba a 60 mL/min para tentar forçar o plasma rio abaixo do coágulo ou desenhar manualmente através da seringa. Limitar a quantidade de plasma desenhada neste processo ou reabastecer o reservatório usando plasma/rt-PA adicional para garantir 30 mL de solução no canal de fluxo.
  2. Utilizando os posicionadores motorizados, alinhe a matriz de imagem paralelamente ao comprimento do coágulo usando o script de imagem (etapa 4.7). O alinhamento paralelo permite ao usuário garantir visualmente a colocação adequada do coágulo e a ausência de bolhas dentro do vaso modelo.
  3. Nivele o vaso do modelo manual e visualmente para garantir que não haja bolhas de ar usando a janela de imagem (etapa 4.7).

7. Procedimento de experimento

  1. Pré-tratamento
    NOTA: Este passo é planejar um caminho para a matriz de fonte/imagem de histotripsy para exposição uniforme de histotripsia ao longo do comprimento do coágulo.
    1. Alinhe a matriz de imagens usando os posicionadores motorizados de tal forma que o plano de imagem seja paralelo à seção transversal do coágulo (ou seja, perpendicular à orientação descrita na etapa 6.2).
    2. Sob orientação através da janela de imagem (etapa 4.7), mova a fonte de histotripsia para a extremidade proximal do coágulo em relação ao reservatório usando os posicionadores motorizados. Neste ponto, ajuste a posição de fonte de histotripsia de modo que o ponto focal marcado na etapa 4.12 se alinhe com o centro do coágulo.
    3. Determine o caminho de inseção ao longo do comprimento do coágulo. Para definir esse caminho, defina três pontos de passagem ao longo do comprimento do coágulo (ou seja, posições dos motores onde a atividade da bolha histotripsy está contida dentro do coágulo) em incrementos de 5 mm. Alinhar os pontos de passagem de modo que o movimento geral da fonte histotripsy ao longo do caminho é antegrado com o fluxo no sistema (ou seja, o primeiro ponto de passagem está na extremidade mais proximal do coágulo em relação ao reservatório, e o terceiro ponto de passagem está na posição distal em relação ao reservatório).
    4. Antes de finalizar cada ponto de passagem, pulsos de teste de fogo da fonte histotripsy com os mesmos parâmetros de insalação da etapa 4.8, mas reduzem a exposição geral a 10 pulsos totais. Ajuste a posição da fonte histotripsy usando os posicionadores motorizados, se necessário, para conter a atividade da bolha dentro do coágulo.
    5. Em cada ponto de passagem, salve as posições do motor usando os comandos fornecidos pelo fabricante, semelhantes à etapa 4.1.
  2. Tratamento
    NOTA: Esta etapa define o procedimento para tratar o coágulo ao longo de seu comprimento de acordo com o caminho definido na etapa pré-tratamento.
    1. Execute a bomba de seringa a 0,65 mL/min e espere o menisco do plasma se mover. Esta taxa de fluxo imita uma oclusão quase total da vasculatura iliofemoral24,34.
    2. Interpolar o caminho criado na etapa 7.1.3 com passos intermediários entre os pontos de passagem estabelecidos com um tamanho de passo fixo (por exemplo, 0,5 mm). O tamanho da etapa é escolhido para ser menor que metade da largura da região focal medida ao longo do comprimento do coágulo (direção elevatória do conjunto de imagens). Mova a fonte histotripsy usando posicionadores motorizados em cada local de trajeto com parâmetros de inseção definidos na etapa 4.8.
    3. Monitor/atividade de bolha de imagem durante a aplicação do pulso histotripsy em cada local do caminho usando a janela de imagem (passo 4.7). Centralizar a imagem no foco histotripsy com as dimensões da imagem cobrindo 15 mm no azimute e alcance. Antes da aplicação do pulso histotripsy em cada local, adquira uma imagem no modo B para fornecer visualização do coágulo e do vaso modelo, criando um script em uma plataforma de programação. Certifique-se de que o script estabelece a comunicação com o scanner usando os comandos do fabricante.
    4. Durante a aplicação do pulso histotripsy, implemente a aquisição de emissões acústicas no script na etapa 7.2.3 para formar imagens passivas de cavitação pós hoc35. Adquira uma imagem de cavitação passiva após cada 10 pulsos de tratamento. Aplique uma compensação de ganho de tempo fixo de 50 a 8 profundidades incrementais até o final da profundidade de imagem. Escolha um tamanho adequado da janela de aquisição, de tal forma que todo o sinal do coágulo seja capturado com perda mínima de energia devido à janela35.
    5. Se houver nuvens de bolha fora do alvo, ajuste a posição do transdutor in situ com os posicionadores motorizados.
      NOTA: Monitor para gatilhos perdidos da matriz de imagens. Ajuste o número de conjuntos de dados de imagem adquiridos para garantir que o armazenamento de dados seja concluído antes do acionamento subsequente.

8. Procedimento pós-experimento

  1. Levante manualmente o vaso modelo para fora do reservatório de água para drenar o perfusado através da gravidade. Certifique-se de manter o canal de fluxo nivelado para evitar que o coágulo se mova rio abaixo e para fora do vaso modelo durante a drenagem.
  2. Colete todo o perfusato para análise posterior em um pequeno béquer (Figura 4A) desenhando solução de plasma do canal de fluxo através da bomba de seringa a uma taxa de fluxo muito baixa.
  3. Desconecte o vaso modelo e remova o coágulo. Se necessário, injete uma pequena quantidade de soro fisiológico no vaso modelo para desalojar suavemente o coágulo.
  4. Limpe o coágulo semelhante ao passo 1.2.3. Pesar o coágulo na balança de pesagem para avaliar a perda de massa do coágulo.
  5. Para analisar o teor d-dimer, adicione 100 mg de ácido aminocaúnico a um tubo de microcentrífuga seguido de 1 mL de perfusato, e misture bem usando uma pipeta. Realize um ensaio imune-turbimétrico de látex para quantificar o d-dimer dentro da amostra36.
  6. Para avaliar a hemólise, adicione 1 mL de perfusato aos tubos de centrífuga e gire a 610 x g (3.500 rpm) por 10 min. Combine 0,5 mL de supernasciente (concentrado) com 0,5 mL de solução Drabkins e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 15 minutos. Transfira 200 μL para placas de poço, conforme mostrado na Figura 4B. Use um leitor de placas para ler absorvância a 540 nm, Figura 4C (ensaio Drabkins37).
  7. Avaliação de histologia
    1. Corte uma seção do centro do coágulo de cerca de 2-3 mm de comprimento com um bisturi.
    2. Adicione a seção a um. Mantenha a orientação da seção em relação à direção da propagação do pulso histotripsy.
    3. Adicione 2 mL de solução de agarose de gelagem baixa preparada na etapa 3.2.5 no para fixar o coágulo no lugar.
    4. Fixar a amostra em 10% de formalina por 24 h. Coloque a amostra em 70% de álcool após 24 h e realize a coloração padrão de hemotoxylin-eosina38.

9. Análise passiva da imagem da cavitação

  1. Processe os sinais adquiridos da matriz de imagens durante a excitação histotripsy (etapa 7.2.4) usando um algoritmo baseado no robusto feixe Capon39 para criar uma imagem de emissões acústicas geradas pela nuvem de bolha em cada local de tratamento.
    NOTA: Para gerar imagens quantitativas, siga os passos descritos em Haworth et al.35. Caso contrário, cada valor de pixel na imagem deve representar a energia acústica da nuvem de bolha relativa (unidades de V2) em cada local correspondente.
  2. Segmentar a imagem do modo B acotodos nas etapas 7.2.3 para distinguir entre os pixels que representam o coágulo e o vaso modelo.
  3. Co-registre a imagem de cavitação passiva com a imagem do modo B, conforme mostrado na Figura 5B. Resumindo a energia acústica dentro do coágulo durante o período de exposição35.

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Resultados

O protocolo descrito neste estudo destaca os detalhes da modelagem de coágulos venosos, da linsotripsia para interrupção do coágulo e da ultrassom em uma configuração in vitro de DVT. O procedimento adotado demonstra as etapas necessárias para avaliar a interrupção do coágulo devido aos efeitos combinados da atividade da nuvem de bolhas rt-PA e histotripsy. A configuração do bancada foi projetada para imitar as características de uma veia iliofemoral venosa. A Figura 1A mostra um vaso modelo...

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Discussão

O protocolo proposto apresenta um modelo para quantificar a eficácia do tratamento da lysotripsy. Embora os detalhes-chave tenham sido discutidos, há certos aspectos críticos a serem considerados para o sucesso deste protocolo. A atividade enzimática do RT-PA tem uma dependência de temperatura de Arrhenius30. A temperatura também é um fator contribuinte para a velocidade do som na água e no tecido, e variações de temperatura podem causar pequenas alterações na geometria da zona focal. Assim, a tem...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Grant R01HL13334. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Kevin Haworth por ajudar com o ensaio de Drabkin e o Dr. Viktor Bollen por seu apoio na concepção do protocolo. Os autores também agradecem ao Dr. Adam Maxwell por sua orientação sobre o projeto da fonte histotripsy.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Folhas absorventesAcústica de precisãoF28-SMALL-M300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicato Pipetas de PasteurFisher Scientific1367820A14,6 cm de comprimento, capacidade de 2 mL
Tubos de centrífugaEppendorf223641111,5 mL de capacidade
Ensaio de DrabkinSigma AldrichD5941-6VL
Seringade traçãoCole-ParmerEW-07945-43Capacidade de 60 mL
Sacos de filtroMcMaster-Carr5162K111Remova o tamanho das partículas de até 1 mícron
Tubulação de canal de fluxoMcMaster-Carr5154K25Tubulação de plástico EVA revestida de polietileno (Diâmetro externo: 3/8", Diâmetro interno: 1/4"
Elementos de aquecimentoWon BrothersHT 300 TitânioHastes de titânio colocadas no fundo do tanque
Matriz de imagemVerasonicsL11-5v128 elemento com sensibilidade de -55 a -49 dB
Baixa agarose gelificanteMillipore SigmaA9414
Embarcação modeloMcMaster-Carr5234K986,6 cm de comprimento, 0,6 cm de diâmetro interno, 1 mm de espessura
Água nanopuraBarnsteadNanopure DiamondASTM tipo I, resistividade de 18 Mohm-cm
PlasmaVitalant4PF000Plasma congelado em 24 horas
Leitor de placasBiotekSynergy Neo HST Leitor de placasPara quantificação de hemoglobina
Tampa da sondaCivco610-362
Plataforma de programaçãoMATLAB (the Mathworks, Natick, MA, EUA)
Ativador de plasminogênio recombinante do tipo tecido (rt-PA)GenentechActivase
ReservatórioCole-ParmerEW-07945-43Capacidade de 60 mL
Bomba de seringaCole-ParmerEW-74900-20acoplada à seringa para puxar o fluxo no canal de fluxo a uma taxa de alimentação pré-determinada
TransdutorpersonalizadoTransdutor de oito elementos, com foco elíptico (eixo maior de 9 cm, eixo menor de 7 cm e distância focal de 6 cm), alimentado por classe D projetada e construída sob medida amplificador e rede correspondente
Sistema de varredura de ultrassomVerasonicsVantage Research Sistema de ultrassom
Tanque de águaAcrílicos avançadosC13314 x 14 x 12, 1/2"
internamente

Referências

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