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Artigo de método

Um modelo de rato de infecção cerebral ecohiv

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DOI:

10.3791/62137

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21 de janeiro de 2021

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estabelecer um novo modelo de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV), que é fundamental para melhorar nossa compreensão dos reservatórios virais do HIV-1 no cérebro e oferecer um sistema para estudar distúrbios neurocognitivos associados ao HIV e comorbidades associadas (ou seja, abuso de drogas).

Resumo

Tem sido bem estudado que o modelo de camundongo infectado pelo EcoHIV é de utilidade significativa na investigação de complicações neurológicas associadas ao HIV. O estabelecimento do modelo de ratos infectados pelo EcoHIV para estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos seria benéfico no estudo de distúrbios neurocognitivos associados ao neurocognitivo neurocognitivo neurocognitivo (HAND) neurohiv e HIV-1. No presente estudo, demonstramos a criação bem-sucedida de um modelo de rato de infecção ativa pelo HIV usando HIV quimérico (EcoHIV). Primeiro, a construção lentiviral do EcoHIV foi embalada em células cultivadas de 293 FT por 48 horas. Em seguida, o meio condicional se concentrou e se concentrou. Em seguida, realizamos injeções estereóxicas bilaterais do EcoHIV-EGFP no tecido cerebral de rato F344/N. Uma semana após a infecção, sinais de fluorescência EGFP foram detectados no tecido cerebral infectado, indicando que o EcoHIV induz com sucesso uma infecção ativa pelo HIV em ratos. Além disso, foi realizada a imunostaining para o marcador de células microgliais, Iba1. Os resultados indicaram que a microglia era o tipo de célula predominante que abrigava o EcoHIV. Além disso, os ratos EcoHIV apresentaram alterações no processamento temporal, um potencial mecanismo neuroabportavioral subjacente da MÃO, bem como disfunção sináptica oito semanas após a infecção. Coletivamente, o presente estudo estende o modelo EcoHIV de infecção pelo HIV-1 ao rato oferecendo um valioso sistema biológico para estudar reservatórios virais do HIV-1 no cérebro, bem como comorbidades associadas à MÃO e comorbidades associadas, como o abuso de drogas.

Introdução

Os sistemas biológicos melhoraram nossa compreensão das doenças neurocognitivas associadas ao HIV-1 (HAND) e seus mecanismos neurais subjacentes2. Determinar qual sistema biológico é mais adequado para qualquer estudo, muitas vezes depende da questão do interesse2. A limitação da gama de modelos animais hospedeiros desafia os estudos sobre o desenvolvimento da doença do HIV-1. Para investigar a replicação viral e a patogênese do HIV-1, Potash et al.3 criaram um modelo de camundongo de infecção ativa pelo HIV-1, substituindo a região de codificação da glicoproteína de envelope de superfície do HIV, gp120, por gp 80 MLV ecotropic, que levou à replicação viral bem sucedida em camundongos4. Após injeções de veias na cauda em camundongos quióricos de HIV (EcoHIV), muitas características foram observadas semelhantes às de indivíduos soropositivos HIV-1 (por exemplo, linfócitos e macrófagos infectados, destinados a respostas imunes antivirais, e inflamação3,5,6).

Embora camundongos e ratos sejam ambos membros do Muridae, diferenças fundamentais de espécies podem influenciar sua adequação para questões experimentais específicas7. Portanto, a extensão do modelo de infecção do EcoHIV aos ratos (comumente utilizado em estudos de abuso de drogas e distúrbios neurocognitivos) seria vantajosa no estudo do neuroHIV. Por exemplo, seu tamanho maior torna a implantação do cateter jugular para procedimentos de autoadministração de medicamentos mais práticos8. Técnicas de autoadministração de medicamentos em ratos têm sidoutilizadas para avaliar a motivação no HIV-19 . Além disso, muitas tarefas neurocognitivas/comportamentais foram inicialmente projetadas para ratos10. Aqui, relatamos a utilização de injeções estereotribuíficas de EcoHIV em ratos para ampliar o modelo de infecção do EcoHIV e dar uma oportunidade fundamental para abordar novas questões relacionadas ao neuroHIV e à MÃO.

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Protocolo

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul (número de garantia federal: D16-00028). Seis ratos F344/N machos adultos foram alojados em um ambiente controlado sob uma luz de 12/12: ciclo escuro com acesso ad libitum a alimentos e água. Todos os animais foram atendidos utilizando-se orientações estabelecidas pelos Institutos Nacionais de Saúde no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Embalagem de vírus em células de 293 FT

  1. Cultura as células de 293 FT (5×105/mL) em gelatina revestida 75 cm2 frascos com DMEM mais 10% FBS11. Crescer células a 37 °C para ser 50% confluente na transfecção.
  2. Diluir 22,5 μL de reagente transfecção (por exemplo, Lipofectamina 3000) em 750 μL de médio (por exemplo, Opti-MEM) em um tubo micro-centrífuga de 1,5 mL e vórtice para 3 s.
  3. Diluir 20 μg de DNA plasmídeo EcoHIV em 750 μL de meio em um tubo de microcrédito de 1,5 mL e misturar bem.
  4. Adicione DNA diluído no tubo de reagente de transfecção diluído e misture suavemente. Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente.
  5. Adicione a mistura a 10 mL de mMEM médio pré-armado em frasco de 75 cm2. Incubar células por 2 dias a 37 °C.
  6. Colher e combinar 24 mL de meio condicional dos dois frascos que incluem o lentivírus embalado.
  7. Centrifugar todos os 24 mL de meio condicional a 500 x g por 10 minutos a 4 °C. Transfira o supernante esclarecido para um tubo estéril de 50 mL.
  8. Combine 8 mL de concentrador Lenti-x com 24 mL de supernanato esclarecido (proporção 1:3). Misture por inversão suave. Incubar a mistura a 4 °C durante dois dias.
  9. Mistura centrífuga a 1.500 x g por 45 minutos a 4 °C. Remova cuidadosamente o supernatante.
  10. Suspenda suavemente a pelota com 100 μL de 100 mM PBS.
  11. Concentração do vírus Titer com um kit P24 ELISA.

2. Cirurgias estereóxiis do vírus EcoHIV-EGFP

  1. Anesthetize ratos usando 3% de sevoflurano. Prossiga para a etapa 2.2 quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.
  2. Raspe os cabelos da região cerebral e esterilize a pele duas vezes com 70% de etanol e um esfoliante à base de clorexidina. Fixar o rato em uma posição propensa no aparelho estereotaxico.
  3. Faça uma incisão (5-6 cm) através da pele ao longo da linha média do couro cabeludo.
  4. Marque duas posições de perfuração a 0,8 mm laterais, 1,2 mm rostral para bregma. Faça um orifício (diâmetro 0,4 mm) em cada posição do crânio.
  5. Encha a solução de lentivírus EcoHIV (1,04 × 106 TU/mL) em uma seringa de injeção de 10 μL. Fixar a seringa no aparelho estereotaxico.
  6. Mova a agulha para baixo perto da superfície do furo de perfuração. Meça e mova 2,5 mm de profundidade.
  7. Infundir 1 μL de solução de vírus a uma taxa de 0,2 μL/min. Mantenha a agulha dentro da área de injeção por 5 minutos. Mova lentamente a agulha até que esteja fora do crânio do rato.
  8. Suture a pele com um fio de seda 4-0.
  9. Esterilize a incisão com 70% de etanol uma vez. Injetar butorfenol subcutâneamente (Dorolex, 0,1 mg/kg de peso corporal).
  10. Transfira o rato para uma câmara de recuperação com uma almofada de aquecimento até acordar.

3. Visualização de seções cerebrais

NOTA: Aguarde de uma a oito semanas após a infusão viral do EcoHIV.

  1. Anestesiar o rato com 5% de sevoflurano. Continue a passo 3.2 quando os ratos não respondem a estímulos nocivos e os reflexos estão ausentes.
  2. Conserte o rato em uma posição supina dentro de um capô de fumaça.
  3. Inciso a pele ao longo da linha média torácica. Corte o diafragma e abra a cavidade torácica.
  4. Insira uma agulha de 20 G × 25 mm no ventrículo esquerdo.
  5. Abra imediatamente o átrio direito com uma tesoura.
  6. Perfuse 50 mL de PBS pré-100 mM a uma taxa de 5 mL/min.
  7. Perfuse 100 mL de paraformaldeído frio de 4% a uma taxa de 5 mL/min.
  8. Decapitar o rato, abrir o couro cabeludo e remover o cérebro.
  9. Pós-fixado durante a noite com 4% de paraformaldeído.
  10. Transfira o cérebro para 40 mL de 30% de sacarose em 100 mM PBS em tubo de 50 mL até que o cérebro flutue até o fundo (cerca de 3 dias).
  11. Es clique para congelar o cérebro em metilbutanol por 2 min a - 80 °C.
  12. Fixar o tecido cerebral em uma plataforma metálica dentro de um criostat de -20 °C.
  13. Corte seções coronais de 50 μm de espessura usando o criostat.
  14. Transfira as fatias cerebrais para lâminas de vidro com uma escova fina.
  15. Monte seções em 0,3 mL de meio antifado e cubra com tampas de 22 mm de 50 mm.
  16. Mantenha os deslizamentos de vidro no escuro à temperatura ambiente até secar.
  17. Imagem dos neurônios alvo com um microscópio confocal usando z-stack baseado em limites da região cerebral e características morfológicas dos neurônios.
    NOTA: As configurações do microscópio confocal utilizada foram: ampliação de 60 X (A/1.4, óleo) e um intervalo de plano Z de 0,15 μm (tamanho pinhole 30 μm; raio pinhole projetado para trás 167 nm) usando um comprimento de onda de 488 nm.

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Resultados

O meio condicionado foi coletado a partir de células infectadas pelo EcoHIV-EGFP de 293FT. Em seguida, foi concentrado e titulado, em seguida, estereotaxicamente injetado no cérebro (região cortical) de ratos F344/N. Sete dias após a injeção, os ratos foram sacrificados e as imagens foram tiradas de fatias cerebrais coronais que variavam de bregma de 5,64 mm a bregma -4,68 mm. Na Figura 1A,há sinais ecohiv-egfp significativos em todo o cérebro, especialmente no córtex e no giro dento de hipo...

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Discussão

Neste protocolo, estabelecemos um modelo de infecção por HIV induzida pelo EcoHIV em ratos. Especificamente, descrevemos uma injeção estereotaxa bilateral de EcoHIV no córtex que induziu com sucesso a infecção ativa do HIV no cérebro de rato 7 dias após a injeção. Futhermore, demonstramos que a infecção pelo EcoHIV em ratos pode ser um bom sistema biológico para estudar aspectos-chave da MÃO. Oito semanas após a infecção pelo EcoHIV, os ratos apresentaram prejuízos neurocognitivos significativos, que incluíram as alteraç...

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Divulgações

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelas bolsas NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Células 293FTThermoFisher ScientificR70007
Solução Antibiótica-AntimicóticaCellgro30004CI100X
Corning BioCoatGelatina 75cm² Balão retangular de cultura de células com pescoço inclinado com tampa ventiladaLife Technologies354488
Corning DMEM com L-glutamina, 4,5 g/L de glicose e piruvato de sódioLife Technologies10013CV
Vidro de coberturaVWR637-137
broca
Dumont #5 FórcepsWorld Precision Instruments14095
Fórceps Dumont #7World Precision Instruments14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrífuga Biopur Safe-Lock TubesLife Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus Antibacteriano, 4-0 Polyglactin 910 Sutura, 27in. FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Seringa Hamilton1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 Reagente de TransfecçãoLife TechnologiesL3000015
Iris ForcepsWorld Precision Instruments15914
Iris ScissorsWorld Precision Instruments500216
Kit ELISA p24 associado a lentivírusCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Concentrador Lenti-XTakaraPT4421-2
Opti-MEM I Soro Reduzido MediumLife Technologies11058021
ParaformaldeídoSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldeídoSigmaP6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
SevofluranoMerritt Veterinary Supply347075
aparelho estereotáxicoKopf InstrumentsModelo 900
SuperFrost Plus SlidesFisher Scientific12-550-154%
Vannas ScissorsWorld PrecisionInstruments 500086

Referências

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