Imagem do intestino com "CLAREZA"

Resumo

Descrevemos o protocolo para coloração passiva CLARITY (PACT) do intestino de camundongo para permitir a visualização de tecidos subepiteliais, incluindo neurônios, glia e células enteroendócrinas (EEC) sem seccionamento de tecido. O protocolo envolve a inclusão de hidrogel de tecido fixado em formaldeído e subsequente delipidação usando um detergente aniônico para "limpar" o tecido.

Resumo

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) evoluiu recentemente como uma técnica valiosa envolvendo a incorporação de acrilamida para deslipidar o tecido (sem seccionamento) e para preservar a estrutura do tecido 3-D para imunocoloração. A técnica é altamente relevante na imagem do ambiente intestinal dinâmico, onde diferentes tipos de células interagem durante a homeostase e os estados de doença. Este método otimizado para o intestino de camundongo é descrito aqui, o que ajuda a rastrear tipos de células como epitélios, enteroendócrinos, neurônios, glia e as projeções neuronais no epitélio ou células enteroendócrinas que medeiam a detecção microbiana ou a detecção de quimioterapia de nutrientes, respectivamente. O tecido intestinal (1-1,5 cm) é fixado em paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C durante a noite no dia 1. No dia 2, o PFA é descartado e o tecido é lavado três vezes com PBS. O tecido é embebido em hidrogel para preservar sua integridade por incubação em solução de hidrogel (acrilamida) a 4% em PBS (diluído a partir de ProtoGel a 30%) durante a noite a 4 °C. No dia 3, a solução de hidrogel de tecido é incubada a 37  ° C por 1 h para permitir a polimerização do hidrogel. O tecido é então lavado três vezes suavemente com PBS para remover o excesso de hidrogel. A etapa subsequente de delipidação (limpeza) envolve a incubação do tecido em dodecil sulfato de sódio (8% SDS em PBS) a 37 ° C por 2 dias (dias 4 e 5) em um agitador à temperatura ambiente (RT). No dia 6, o tecido limpo é cuidadosamente lavado com PBS para remover SDS. O tecido pode ser imunomarcado por incubação em anticorpos primários (diluídos em 0,5% de soro de burro normal em PBS contendo 0,3% de Triton X-100), durante a noite a 4 ° C e subsequente incubação em anticorpos Alexa Fluor secundários apropriados por 1,5 h em RT e coloração nuclear com DAPI (1: 10000). O tecido é transferido para uma lâmina de vidro limpa e montado usando VectaShield para imagens confocais.

Introdução

O CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) evoluiu recentemente como uma técnica valiosa envolvendo incorporação de acrilamida (hidrogel) e delipidação de tecido para preservar a estrutura do tecido 3-D para imunocoloração (sem seccionamento)^1,2. O tecido embebido em hidrogel é opticamente transparente e permeável a macromoléculas, com proteínas e ácidos nucléicos sendo preservados após a remoção de lipídios por detergente. O CLARITY foi reconhecido como um entre dez avanços notáveis em 2013 pela Science

Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Emory. Camundongos C57BL / 6 (machos e fêmeas podem ser usados) com 8-12 semanas de idade tiveram acesso livre à comida e água antes da eutanásia.

1. Remoção do intestino (Dia 1)

1. Eutanasiar o camundongo pelo método de asfixia por dióxido de carbono, a uma taxa de fluxo de 1,6 mL de gás dióxido de carbono até que a cessação da respiração seja observada por 2 min).
2. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação com os membros presos. Esterilize o abdômen com e....

Resultados

As imagens do tecido intestinal do camundongo limpo pelo CLARITY estão representadas na Figura 1. Uma conclusão bem-sucedida do protocolo produz imagens nítidas e de alta qualidade, onde todos os detalhes celulares podem ser visualizados com clareza. A coloração DAPI para núcleos é um índice muito bom para avaliar a qualidade do protocolo CLARITY e a imunocoloração subsequente, pois pode representar a integridade do tecido. Além disso, a forma da célula também fornece uma pista de como o pro.......

Discussão

O método CLARITY é muito útil para colorir o intestino de camundongos para visualizar vários tipos de células, incluindo epitélios, neurônios e células gliais em 3D, especialmente a rede de projeções neuronais que se estendem pela parede intestinal até o lúmen⁵ e sua inervação para células gliais e EEC. O método aqui apresentado foi modificado de acordo com o estudo original de Yang et al. 2014¹.

As etapas crític.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
4% de paraformaldeído (PFA)  em PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Usado para fixação de tecido
4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	Diluição de 1/10.000
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	Diluição de 1/1000
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	Diluição 1/500
Anti-GFAP (Proteína Fibrilar Glial Acidada)	Abcam	ab7260	Diluição 1/500
Anti-beta III Tubulina (ou Tuj1)	Abcam	ab18207	Diluição 1/1000
Cromogranina A	Abcam	ab15160	Diluição 1/250
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Tóxico, perigoso, manuseie com cuidado- faça a solução a 4% em PBS para uso
Dodecil sulfato de sódio	ThermoFischer Scientific	28364	8% em
PBS Vectashield meio de montagem	Vector	Laboratories H-1000