Artigo de método

Imagem do intestino com "CLAREZA"

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DOI:

10.3791/62143

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11 de junho de 2021

 , 
1Department of Pathology & Laboratory Medicine, Emory University, Atlanta, GA

Neste artigo

Resumo

Descrevemos o protocolo para coloração passiva CLARITY (PACT) do intestino de camundongo para permitir a visualização de tecidos subepiteliais, incluindo neurônios, glia e células enteroendócrinas (EEC) sem seccionamento de tecido. O protocolo envolve a inclusão de hidrogel de tecido fixado em formaldeído e subsequente delipidação usando um detergente aniônico para "limpar" o tecido.

Resumo

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) evoluiu recentemente como uma técnica valiosa envolvendo a incorporação de acrilamida para deslipidar o tecido (sem seccionamento) e para preservar a estrutura do tecido 3-D para imunocoloração. A técnica é altamente relevante na imagem do ambiente intestinal dinâmico, onde diferentes tipos de células interagem durante a homeostase e os estados de doença. Este método otimizado para o intestino de camundongo é descrito aqui, o que ajuda a rastrear tipos de células como epitélios, enteroendócrinos, neurônios, glia e as projeções neuronais no epitélio ou células enteroendócrinas que medeiam a detecção microbiana ou a detecção de quimioterapia de nutrientes, respectivamente. O tecido intestinal (1-1,5 cm) é fixado em paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 °C durante a noite no dia 1. No dia 2, o PFA é descartado e o tecido é lavado três vezes com PBS. O tecido é embebido em hidrogel para preservar sua integridade por incubação em solução de hidrogel (acrilamida) a 4% em PBS (diluído a partir de ProtoGel a 30%) durante a noite a 4 °C. No dia 3, a solução de hidrogel de tecido é incubada a 37  ° C por 1 h para permitir a polimerização do hidrogel. O tecido é então lavado três vezes suavemente com PBS para remover o excesso de hidrogel. A etapa subsequente de delipidação (limpeza) envolve a incubação do tecido em dodecil sulfato de sódio (8% SDS em PBS) a 37 ° C por 2 dias (dias 4 e 5) em um agitador à temperatura ambiente (RT). No dia 6, o tecido limpo é cuidadosamente lavado com PBS para remover SDS. O tecido pode ser imunomarcado por incubação em anticorpos primários (diluídos em 0,5% de soro de burro normal em PBS contendo 0,3% de Triton X-100), durante a noite a 4 ° C e subsequente incubação em anticorpos Alexa Fluor secundários apropriados por 1,5 h em RT e coloração nuclear com DAPI (1: 10000). O tecido é transferido para uma lâmina de vidro limpa e montado usando VectaShield para imagens confocais.

Introdução

O CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) evoluiu recentemente como uma técnica valiosa envolvendo incorporação de acrilamida (hidrogel) e delipidação de tecido para preservar a estrutura do tecido 3-D para imunocoloração (sem seccionamento)1,2. O tecido embebido em hidrogel é opticamente transparente e permeável a macromoléculas, com proteínas e ácidos nucléicos sendo preservados após a remoção de lipídios por detergente. O CLARITY foi reconhecido como um entre dez avanços notáveis em 2013 pela Science3. Embora desenvolvida inicialmente para obter imagens de tecidos cerebrais ricos em lipídios, onde os lipídios afetam a dispersão da luz e a qualidade da imagem, a técnica é atualmente amplamente utilizada para imagens de outros tecidos, como intestino, fígado, rim e coração. A técnica oferece a capacidade de corar e criar imagens de um tecido, eliminando a necessidade de seccionamento, o que, de outra forma, poderia resultar em uma avaliação tendenciosa das interações célula-célula devido à distribuição irregular dos tipos de células. A técnica também oferece a oportunidade de realizar pilhas z confocais e recriar imagens tridimensionais do tecido, o que pode ajudar a determinar as densidades, a microarquitetura e a interação célula-célula entre vários tipos de células de forma mais realista do que em uma seção de tecido. Além disso, a técnica foi modificada para permitir a imunocoloração de tecidos densos como ossos, bem como estudos de hibridização in situ. O tecido 3D incorporado em hidrogel oferece uma plataforma atraente para elucidar as interações entre células epiteliais, enteroendócrinas, gliais e neuronais, que foram recentemente citadas como cruciais para a compreensão da fisiopatologia de doenças como doença de Parkinson, Alzheimer, transtornos do espectro do autismo etc.4.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais descritos foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado de Animais da Universidade Emory. Camundongos C57BL / 6 (machos e fêmeas podem ser usados) com 8-12 semanas de idade tiveram acesso livre à comida e água antes da eutanásia.

1. Remoção do intestino (Dia 1)

  1. Eutanasiar o camundongo pelo método de asfixia por dióxido de carbono, a uma taxa de fluxo de 1,6 mL de gás dióxido de carbono até que a cessação da respiração seja observada por 2 min).
  2. Coloque o rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação com os membros presos. Esterilize o abdômen com etanol 70%. Usando uma pinça, corte a pele com uma tesoura.
  3. Levante o fígado suavemente e identifique o estômago. Em seguida, segurando o estômago com uma pinça, corte o esôfago logo acima do estômago. Segurando o estômago com uma pinça, corte suavemente os mesentérios e retire o intestino da cavidade abdominal até o reto. Corte o intestino descolado no reto.
  4. Transfira o intestino separado para uma solução gelada de PBS em uma placa de Petri. Agora, corte suavemente o mesentério entre os segmentos ileais e endireite o intestino para que, a partir do estômago, todos os mesentérios sejam cortados, até o cólon.
  5. Corte 1-1,5 cm da região intestinal desejada para a coloração CLARITY em uma nova placa de Petri contendo PBS gelado.
  6. Usando uma seringa de 5 mL presa a uma extremidade cega de uma agulha de 20 G, lave o conteúdo fecal com PBS gelado.
    NOTA: Qualquer região do intestino pode ser usada para coloração CLARITY usando a mesma técnica. O segmento intestinal pode ser aberto ao longo do mesentério ou usado intacto para as etapas subsequentes.

2. Fixação do tecido intestinal (Dia 1)

  1. Fixe o tecido em solução de paraformaldeído (PFA) a 4% em PBS.
  2. Transfira um pedaço de 1-1,5 cm do segmento intestinal de interesse para um tubo cônico de 15 mL cheio de PFA a 4% a 4 ° C durante a noite para fixação.

3. Incorporação de hidrogel (dia 2)

  1. Transfira o segmento intestinal da solução de PFA a 4% com fórceps para um novo tubo cônico de 15 mL com solução de PBS e lave três vezes (5 min cada, em um agitador a 150-200 rpm) para remover qualquer PFA residual.
  2. Preparação de hidrogel a 4%
    1. Use a solução de gel a 30% (ProtoGel) para preparar o hidrogel. Para preparar a solução de hidrogel a 4%, dilua a solução estoque a 30% diluída em PBS. Para preparar 12 mL de hidrogel a 4%, tome 1,6 mL de solução de gel a 30% e adicione 10,4 mL de PBS.
  3. Transfira o tecido fixo da etapa 3.1. à solução de hidrogel a 4% em PBS em um tubo cônico de 15 ml e incubada a 4 ° C durante a noite.
    NOTA: É altamente recomendável que o tecido seja lavado sem PFA usando PBS após a incubação durante a noite. O tecido armazenado por mais tempo no PFA não dá bons resultados com as etapas e colorações subsequentes. O tecido fixado após as lavagens com PBS pode ser armazenado a 4 °C durante uma semana.

4. Etapa de polimerização e delipidação (limpeza) do hidrogel (dia 3)

  1. Retirar o tubo cónico que contém o tecido em solução de hidrogel a 4 °C. Transferir para banho-maria a 37 °C e incubar durante 1 h. Esta etapa permite a polimerização do hidrogel.
  2. Após 1 h, retire o tubo cônico contendo o tecido embebido em hidrogel do banho-maria e despeje a solução de acrilamida. Agora enxágue suavemente o tecido com uma única lavagem PBS em temperatura ambiente para remover o excesso de hidrogel.
  3. Etapa de delipidação
    1. Deslipidar incubando o tecido em dodecil sulfato de sódio (8% SDS) em PBS. Transfira o tecido embebido em hidrogel da etapa 4.2 para uma solução SDS a 8% em um tubo cônico de 50 mL. Certifique-se de que o tecido esteja completamente imerso na solução SDS e que o tubo esteja tampado.
    2. Transfira o tubo tampado de 50 mL contendo o tecido em SDS para um agitador de 37 ° C (200 rpm) em temperatura ambiente por 2 dias (dias 4 e 5) para permitir a deslipidação.
      NOTA: Certifique-se de que a solução SDS seja preenchida até pelo menos 20-25 mL no tubo cônico de 50 mL, para compensar qualquer evaporação que possa ocorrer a 37 ° C durante os 2 dias de incubação.
  4. Nos dias 4 e 5, incube o tecido em SDS a 37 ° C agitador (200 rpm) à temperatura ambiente.

5. Lavar o detergente do tecido limpo (Dia 6)

  1. Retire o tecido da solução SDS. O tecido parecerá "claro" ou transparente.
  2. Transfira o tecido para um novo tubo cômico de 50 mL com solução de PBS e lave ao longo do dia em um agitador (150-200 rpm) em temperatura ambiente com várias mudanças de PBS, para garantir que todos os vestígios de SDS sejam removidos. Pelo menos 10 trocas de solução de PBS garantirão que o tecido esteja livre do SDS, e uma boa regra é verificar se a lavagem final do PBS não tem vestígios de espuma/espuma do SDS. Esta é uma etapa crítica, pois o SDS pode interferir nas etapas de coloração subsequentes.
    NOTA: No final do dia, o tecido limpo após várias lavagens em PBS está agora pronto para imunocoloração ou talvez armazenado a 4 ° C por até 3 semanas.
  3. Armazenar tecidos intestinais limpos por mais de um mês em solução de PBS afetará a integridade do tecido e a qualidade da coloração. Use o tecido intestinal limpo imediatamente ou dentro de 1-2 semanas após a limpeza para obter melhores resultados.

6. Coloração imunofluorescente para neurônios, glia e células enteroendócrinas

  1. Transfira o tecido limpo para um tubo de 1,5 ou 2 mL e incube em volume de 500 μL dos respectivos anticorpos primários diluídos em soro de burro normal a 0,5% em PBS contendo 0,3% de Triton X-100) durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos (Ab) utilizados: Tuj1 ou β-3-tubulina (marcador neuronal Pan, 1: 1000), Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP, 1: 500), Cromogranina A (1: 250).
  2. Após a incubação durante a noite, submeta o tecido a 3 lavagens de PBS (5 min cada usando 1-1,5 mL de PBS) para remover o Ab primário não ligado.
  3. Transfira o tecido para um novo tubo e, posteriormente, incube com 500 μL de Alexa Fluor Ab (AF) secundário apropriado por 1,5 h em temperatura ambiente no escuro. Os Ab secundários usados são AF 488 para Tuj1 (1: 1000), AF-555 para GFAP (1: 500) e AF 555 (1: 250) para Cromogranina A.
  4. Após a incubação, lave o tecido três vezes com PBS como na Etapa 6.2.
  5. Para a coloração dos núcleos, incubar o tecido em DAPI (diluição 1: 10000 ou 0,2 μL em 2 mL de PBS) por 5 min à temperatura ambiente.
  6. Por fim, transfira o tecido manchado para uma lâmina de vidro limpa, adicione lamínula na parte superior do tecido e monte usando 100 μL de VectaShield para imagens confocais.
  7. Coloque as lâminas no escuro à temperatura ambiente em um suporte de lâminas por 30 min para secagem, após o que podem ser fotografadas ou armazenadas a -20 °C. A parede do intestino do rato é bastante fina e, uma vez aberta ao longo do mesentério, pode ser montada em lâminas de vidro diretamente com lamínula. Se estiver trabalhando com tecidos maiores como baço, rins, lâminas de câmara (cavidade) ou espaçadores podem ser usados. Para tecidos maiores, uma lâmina de cavidade pode ser usada para montagem.
    NOTA: Deve-se notar que se o segmento intestinal não foi aberto na etapa inicial (consulte a Nota na Etapa 1), é aconselhável abrir o tubo intestinal com uma microtesoura que facilitará as etapas de montagem.

7. Imagem Confocal

NOTA: O tecido limpo, corado e montado pode ser visualizado imediatamente ou pode ser armazenado em caixas de lâminas a -20 ° C.

  1. Imagem usando um microscópio confocal (por exemplo, Olympus FV1000).
  2. Pegue pilhas z com 50 μm de espessura do tecido intestinal para visualizar as regiões do lúmen intestinal em direção à camada serosa.
  3. Armazene as imagens da pilha z como arquivos de imagem, .avi arquivos de filme ou converta em imagem 3D com a ajuda do software5.

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Resultados

As imagens do tecido intestinal do camundongo limpo pelo CLARITY estão representadas na Figura 1. Uma conclusão bem-sucedida do protocolo produz imagens nítidas e de alta qualidade, onde todos os detalhes celulares podem ser visualizados com clareza. A coloração DAPI para núcleos é um índice muito bom para avaliar a qualidade do protocolo CLARITY e a imunocoloração subsequente, pois pode representar a integridade do tecido. Além disso, a forma da célula também fornece uma pista de como o pro...

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Discussão

O método CLARITY é muito útil para colorir o intestino de camundongos para visualizar vários tipos de células, incluindo epitélios, neurônios e células gliais em 3D, especialmente a rede de projeções neuronais que se estendem pela parede intestinal até o lúmen5 e sua inervação para células gliais e EEC. O método aqui apresentado foi modificado de acordo com o estudo original de Yang et al. 20141.

As etapas crític...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer o apoio da American Gastroenterology Association (AGA) AGA-Rome Functional GI motility Disorders Pilot Research Award (para BC), AI64462 de concessão dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (ASN) e do Núcleo Integrado de Microscopia de Imagem Celular da Universidade Emory.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
4% de paraformaldeído (PFA)  em PBSThermoFischer ScientificJ19943Usado para fixação de tecido
4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato (DAPI)ThermoFischer ScientificD1306Diluição de 1/10.000
Alexa Fluor-488ThermoFischer ScientificA-11034Diluição de 1/1000
Alexa Fluor-555ThermoFischer ScientificA-21428Diluição 1/500
Anti-GFAP (Proteína Fibrilar Glial Acidada)Abcamab7260Diluição 1/500
Anti-beta III Tubulina (ou Tuj1)Abcamab18207Diluição 1/1000
Cromogranina AAbcamab15160Diluição 1/250
ProtoGel  30%National DiagnosticsEC-890Tóxico, perigoso, manuseie com cuidado- faça a solução a 4% em PBS para uso
Dodecil sulfato de sódioThermoFischer Scientific283648% em
PBS Vectashield meio de montagemVectorLaboratories H-1000

Referências

  1. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  2. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  3. 2013 Runners-Up. CLARITY makes it perfectly clear. Science. 342, 1434-1435 (2013).
  4. Fung, T. C. The microbiota-immune axis as a central mediator of gut-brain communication. Neurobiology of Disease. 136, 104714(2020).
  5. Chandrasekharan, B., et al. Interactions Between Commensal Bacteria and Enteric Neurons, via FPR1 Induction of ROS, Increase Gastrointestinal Motility in Mice. Gastroenterology. , (2019).
  6. Sylwestrak, E. L., Rajasethupathy, P., Wright, M. A., Jaffe, A., Deisseroth, K. Multiplexed Intact-Tissue Transcriptional Analysis at Cellular Resolution. Cell. 164, 792-804 (2016).
  7. Muntifering, M., et al. Clearing for Deep Tissue Imaging. Current Protocols in Cytometry. 86, 38(2018).
  8. Cronan, M. R., et al. CLARITY and PACT-based imaging of adult zebrafish and mouse for whole-animal analysis of infections. Disease Models & Mechanisms. 8, 1643-1650 (2015).
  9. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).
  10. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Science Advances. 5, 8355(2019).
  11. Milgroom, A., Ralston, E. Clearing skeletal muscle with CLARITY for light microscopy imaging. Cell Biology International. 40, 478-483 (2016).
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  13. Chen, Y., et al. Three-dimensional imaging and quantitative analysis in CLARITY processed breast cancer tissues. Scientific Reports. 9, 5624(2019).

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