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Artigo de método

Investigação de neurônios sensoriais olfativos de camundongos ativados por meio de imunocoloração combinada e hibridização in situ

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DOI:

10.3791/62150

⸱

11 de abril de 2021

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

Neste artigo

Resumo

Este protocolo combina hibridização in situ com imunofluorescência para identificar genes de receptores olfatórios e vomeronais expressos em neurônios sensoriais olfatórios após ativação por estímulos químicos no camundongo.

Resumo

Os animais dependem da comunicação química para transmitir e perceber informações ambientais relevantes, desde a avaliação da qualidade dos alimentos até a detecção de parceiros de acasalamento ou ameaças disponíveis. Em camundongos, essa tarefa é executada principalmente pelo sistema olfativo e seus subsistemas subjacentes, incluindo os sistemas olfativos principal e acessório. Ambos têm órgãos periféricos povoados por neurônios sensoriais que expressam receptores acoplados à proteína G capazes de se ligar a pistas químicas que atingem a cavidade nasal. Embora as características moleculares desses receptores sejam bem compreendidas, pouco se sabe sobre seus ligantes específicos cognatos. O método aqui descrito combina a detecção de hibridização in situ de receptores olfatórios ou vomeronais com a imunodetecção da proteína ribossômica fosforilada S6 (pS6) - um marcador de ativação neuronal. Este protocolo foi concebido para identificar neurônios ativados após um único evento de exposição a estímulos químicos purificados ou complexos detectados pelos órgãos olfativos. É importante ressaltar que essa técnica permite a investigação de neurônios acionados em contextos biologicamente relevantes. Idealmente, esse método deve ser usado para sondar a biologia molecular do sistema olfativo e estudar os comportamentos olfativos.

Introdução

A quimiossinalização é a forma mais difundida de comunicação em animais. Em mamíferos, a detecção de pistas químicas é mediada principalmente pelo olfato e é fundamental para encontrar comida, localizar possíveis parceiros de acasalamento e evitar predadores em potencial 1,2,3. O sistema olfativo do camundongo é dividido em diferentes subsistemas, cada um com suas próprias propriedades anatômicas, fisiológicas e moleculares4. Dentre estes, o sistema olfativo principal (MOS) e o sistema olfativo acessório (AOS) são os mais estudados e melhor caracterizados.

O MOS é o principal responsável pela detecção de moléculas químicas voláteis que atingem a cavidade nasal. Isso é realizado por neurônios sensoriais olfativos (OSNs), que povoam a interface sensorial do sistema - o principal epitélio olfatório (MOE). Cada OSN expressa um entre milhares de receptores olfativos (ORs) de forma monogênica e monoalélica5. Além disso, os ORs tendem a ser amplamente ajustados6, e um único odorante pode se ligar a mais de um OR, gerando um código combinatório para odores7.

Por sua vez, o AOS é o principal responsável pela detecção de feromônios e cairomônios. Esses ligantes ativam neuroneurs sensoriais vomeronasalos (VSNs) no órgão vomeronasal (VNO). Os VSNs na zona apical do VNO expressam receptores da família do receptor vomeronasal 1 (V1Rs)8, enquanto os neurônios na zona basal expressam a família do receptor vomeronasal 2 (V2Rs)9. É importante ressaltar que foi demonstrado que alguns VSNs co-expressam mais de um receptor vomeronasal 10,11,12.

Apesar de todas as informações disponíveis sobre as características moleculares de ORs e VRs, o conhecimento sobre seus ligantes cognatos ainda é muito limitado. A identificação de neurônios olfativos específicos responsáveis pela detecção de uma molécula ou estímulo complexo é uma tarefa importante para aqueles que investigam o olfato, comportamentos olfativos e respostas fisiológicas. Várias estratégias foram tentadas para desorfanizar receptores olfativos, incluindo imagem de cálcio7, sequenciamento de RNA de célula única13,14, expressão de receptor heterólogo15 e estratégias baseadas em genes precoces imediatos (IEGs) 16. Mais recentemente, algumas técnicas têm sido empregadas para avaliar os efeitos modulatórios de odores em neurônios sensoriais, usando imagens de cálcio in vivo 17,18 e estratégias de sequenciamento de RNA de célula única marcadas com proteína fluorescente19. A maioria dessas técnicas exige uma configuração artificial ou é realizada em neurônios dissociados, impossibilitando a avaliação simultânea de comportamentos desencadeados pelos odores utilizados.

O protocolo aqui descrito permite a identificação de neurônios sensoriais ativados após um único evento de exposição ao odor, combinando ribofróides que detectam ORs ou VRs específicos com a imunodetecção da proteína ribossômica S6 fosforilada (pS6), um proxy para a ativação neuronal. Este método é uma maneira confiável de investigar a identidade de neurônios sensoriais ativados por diferentes sinais quimiológicos em um contexto biologicamente relevante.

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Protocolo

Os procedimentos em animais foram realizados de acordo com o Protocolo Animal #1883-1, aprovado pela Universidade Estadual de Campinas (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Biologia - Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa), que segue as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA).

1. Preparação do material

  1. Prepare 1 L de 3% H2O2 (v/v) em 1x PBS. Diluir 100 mL 10× PBS e 100 mL de 30% H2O2 em 500 mL de água ultrapura. Complete o volume com água ultrapura. Prepare esta solução imediatamente antes de usar.
  2. Prepare uma câmara umidificada contendo pedaços de lenços umedecidos de laboratório sem fiapos com solução SSC 5×.
  3. Prepare soluções de lavagem de hibridização: 5× SSC (a 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) e 0,1× SSC (55 °C e temperatura ambiente). Dissolver os volumes apropriados de solução-mãe de 20× SSC em água ultrapura isenta de RNase. Preparar as soluções diluídas antes do início de cada experiência.
  4. Prepare a solução de bloqueio imuno-histoquímica: 1× PBS / 1% BSA / 0,1% Triton X-100. Para 100 mL, dilua 10 mL de 10× PBS, 10 mL de 10% BSA e 3,33 mL de Triton X-100 a 3% em 70 mL de água ultrapura. Complete o volume com água ultrapura. Preparar as soluções diluídas antes do início de cada experiência.
  5. Prepare a solução PTw: 1× PBS/0,1% Tween-20. Para 100 mL, dilua 1 mL de 10% Tween-20 e 10 mL de 10× PBS em 70 mL de água ultrapura. Complete o volume com água ultrapura. Preparar esta solução de novo antes do início de cada experiência.
  6. Prepare a solução de trietanolamina 0,1 M sem RNase. Para 250 mL, dilua 3,33 mL de trietanolamina de grau reagente em 200 mL de água ultrapura sem RNase sob agitação (use vidraria sem RNase e agitador magnético ao preparar esta solução). Ajuste o pH para 8,0 com HCl. Complete o volume com água ultrapura sem RNase e armazene protegido da luz até o uso. Preparar esta solução de novo antes do início de cada experiência.
  7. Prepare 0,1% H2O2 (v / v) livre de RNase em 1× PBS. Para 1 L, diluir 100 mL de 10× PBS e 3,3 mL de 30% H2O2 em 500 mL de água ultrapura livre de RNase. Complete o volume com água ultrapura sem RNase. Prepare esta solução imediatamente antes de usar.
  8. Preparar soluções livres de RNase do seguinte: HCl 0,2 M; 1 M Tris-HCl pH 8,0; 10 mg/mL de tRNA de levedura; 10% de SDS; 10× PBS; 100× solução de Denhardt; 20× SSC; 50% de sulfato de dextrano; 6 M HCl
  9. Prepare a solução fixadora de paraformaldeído a 4% sem RNase. Para 100 mL, dissolva 4 g de paraformaldeído em 80 mL de PBS 1×. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH 10 M. Complete o volume com 1× PBS. Esta solução deve ser preparada de novo antes do início de cada experiência.
    Cuidado: O paraformaldeído é uma substância perigosa que pode causar danos se inalada. Prepare a solução sob uma hotte e use luvas de proteção, máscara e óculos de segurança.
  10. Prepare a solução de dissecção sem RNase: 30% de sacarose/0,45 M EDTA pH 8,0/1× PBS. Para 100 mL, dissolva 30 g de sacarose em 60 mL de EDTA 0,5 M livre de RNase pH 8,0. Adicione 10 mL de 10× PBS. Complete o volume com EDTA 0,5 M livre de RNase pH 8,0.
  11. Prepare cilindros e copos graduados de vidro ou plástico sem RNase.
  12. Prepare soluções de pré-hibridização e hibridização sem RNase: 50% de formamida deionizada (v/v)/600 mM de NaCl/200 μg/mL de tRNA de levedura/0,25% de SDS (p/v)/10 mM de Tris-HCl pH 8,0/1× solução de Denhardt/1 mM de EDTA pH 8,0/10% de sulfato de dextrano (p/v). Para 10 mL em um cilindro graduado, adicione 5 mL de formamida deionizada, 1,2 mL de NaCl 5 M, 200 μL de tRNA de levedura 10 mg / mL, 250 μL de SDS a 10%, 100 μL de Tris-HCl 1 M pH 8,0, 200 μL de solução de Denhardt 50×, 20 μL de EDTA 500 mM pH 8,0 e 2 mL de sulfato de dextrano a 50% (MW 500.000). Complete o volume com água ultrapura sem RNase. Preparar esta solução de novo antes do início de cada experiência.
    NOTA: O sulfato de dextrano é muito viscoso. É aconselhável preparar 20% extra do volume total de soluções de hibridização/pré-hibridização para contabilizar erros de pipetagem. O tRNA de levedura pode ser omitido da solução de pré-hibridização, se desejado.
  13. Prepare lamínulas de filme de laboratório termoplástico. Corte pedaços de filme de laboratório termoplástico retangular 1-2 mm mais curtos que o comprimento e a largura de uma lâmina de microscópio.
  14. Preparar tampão TN: 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. Para 100 mL, dilua 10 mL de 1 M Tris-HCl pH 7,5 e 3 mL de NaCl 5 M em 70 mL de água ultrapura. Complete o volume com água ultrapura. Preparar esta solução de novo antes do início de cada experiência.
  15. Prepare o tampão de bloqueio TNB: 0,5% do reagente de bloqueio A (p / v) no TN Buffer. Para 200 mL, dissolva 1 g de reagente de bloqueio A em 200 mL de tampão TN (consulte a Tabela de Materiais para fonte comercial de reagente de bloqueio A).
  16. Prepare o tampão TNT: 0,05% Tween-20 no tampão TN. Para 1 L, dilua 5 mL de 10% de Tween-20 em 950 mL de tampão TN. Complete lentamente o volume com tampão TN para evitar a formação de espuma. Preparar esta solução de novo antes do início de cada experiência.
  17. Prepare a solução de trabalho Tyramide-Alexa 488: 1× tampão de amplificação A / 0.0015% H2O2 / 1: 100 tiramida-Alexa 488. Para 100 μL, dilua 1 μL de 0,15% H2O2 e 1 μL de tiramida-Alexa 488 em 98 μL de tampão de amplificação A (consulte a Tabela de Materiais para fontes comerciais de tiramida-Alexa 488 e tampão de amplificação A). Prepare esta solução imediatamente antes de usar.
  18. Prepare a solução de trabalho Tyramide-Alexa 555: 1× tampão de amplificação A / 0.0015% H2O2 / 1: 100 tiramida-Alexa 555. Para 100 μL, dilua 1 μL de 0,15% H2O2 e 1 μL de tiramida-Alexa 555 em 98 μL de tampão de amplificação A (consulte a Tabela de Materiais para fontes comerciais de tiramida-Alexa 555 e tampão de amplificação A). Prepare esta solução imediatamente antes de usar.
  19. Prepare a solução de trabalho de tiramida-biotina: 1× tampão de amplificação B / 0,0015% H2O2/1: 50 tiramida-biotina. Para 100 μL, diluir 1 μL de 0,15% H2O2 e 2 μL de tiramida-biotina em 97 μL de tampão de amplificação B (consulte a Tabela de Materiais para fontes comerciais de tiramida-biotina e tampão de amplificação B). Prepare esta solução imediatamente antes de usar.
  20. Coza os copos a 200 °C durante, pelo menos, 4 h. Trate os plásticos não descartáveis (incluindo porta-lâminas, frascos Coplin e seringas) com 3% de H2O2 por 15-30 min, seguido de lavagem completa em água sem RNase. Trate instrumentos de metal de aço inoxidável, como ferramentas de dissecação, pinças e suportes de amostras de criostato, com 3% de H2O2 por 15 min, seguido de lavagem completa em água sem RNase. Limpe as superfícies da bancada, a placa aquecida e os blocos secos com a solução de limpeza RNase.

2. Síntese de ribossonda

NOTA: O procedimento a seguir para sintetizar sondas de cRNA marcadas com digoxigenina de 1 kb para hibridização in situ via transcrição in vitro é baseado em protocolos publicados anteriormente 20,21,22,23.

  1. Use pares de primers de oligonucleotídeos apropriados para amplificar um fragmento de DNA de 1 kb do gene de interesse (por exemplo, gene do receptor olfatório). Selecione pares de primers que amplificam uma região presente no mRNA maduro a ser detectado (por exemplo, a sequência de codificação do gene). Uma seleção de primers para diferentes receptores olfativos é fornecida na Tabela de Materiais. Para obter detalhes sobre sondas para detectar outros receptores olfatórios vomeronasal, consulte publicações anteriores16,21.
  2. Execute os produtos de PCR em um gel de agarose a 0,8% e remova a banda desejada de 1 kb.
  3. Purifique o fragmento de DNA usando um kit de purificação de gel adequado à base de mini coluna de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Quantifique o fragmento de DNA purificado e clone-o em um vetor de clonagem de PCR adequado de acordo com o protocolo do fabricante. É aconselhável usar vetores de clonagem contendo promotores de RNA polimerase T7 e SP6 flanqueando o amplicon clonado.
  5. Transforme o plasmídeo recombinante em bactérias competentes livres de recombinação por meio de transformação química ou eletroporação de acordo com o protocolo do fabricante.
  6. Semeie colônias bacterianas transformantes isoladas em meio rico e isole o plasmídeo por meio de mini-preparação de DNA de acordo com o protocolo do fabricante.
  7. Realize a análise de digestão de restrição com enzimas de restrição adequadas e/ou sequenciamento de Sanger para verificar a identidade e orientação do fragmento de DNA inserido de acordo com o protocolo do fabricante.
  8. Efectuar a digestão de restrição para linearizar 10 μg do plasmídeo utilizando uma enzima de restrição adequada. Para produzir uma ribossonda anti-sentido após a transcrição in vitro , use uma enzima de restrição que digere o DNA do plasmídeo na extremidade da inserção oposta ao promotor da RNA polimerase localizado a jusante da sequência codificadora do gene. Para produzir ribofróides sensoriais após a transcrição in vitro , use uma enzima de restrição que digere o DNA do plasmídeo na extremidade da inserção oposta ao promotor da RNA polimerase localizado a montante da sequência codificadora do gene.
  9. Execute uma alíquota do produto da reação de linearização do plasmídeo em um gel de agarose a 0,8% para confirmar a integridade da digestão. Assim que a linearização completa for confirmada, purifique o restante da reação usando um kit de limpeza de PCR baseado em coluna de acordo com o protocolo do fabricante.
  10. Sintetize sondas de cRNA marcadas com digoxigenina por transcrição in vitro usando 1-2 μg do plasmídeo linearizado como modelo, a enzima apropriada (por exemplo, RNA polimerase T7 ou SP6) e um kit de marcação de digoxigenina (DIG) adequado.
  11. Remover o molde de ADN da reacção digerindo com DNase I a 37 °C durante 30 min.
  12. Purifique as sondas de cRNA usando um kit de purificação de RNA baseado em mini coluna ou um kit de purificação baseado em filtragem de gel. Eluir a sonda resultante em 50 μL de água isenta de RNase.
  13. Quantificar a ribossonda resultante, de preferência utilizando métodos fluorométricos. Normalmente, o rendimento esperado é superior a 100 ng/μL.
  14. Execute a ribossonda em um sistema de eletroforese automatizado ou em um gel de agarose a 0,8% sem RNase para verificar a qualidade e a degradação da sonda.
  15. Armazene a sonda sintetizada a -80 °C até que seja necessário.

3. Exposição de camundongos a estímulos olfativos

  1. Alojar individualmente cada animal numa gaiola limpa durante pelo menos 24 horas antes da exposição. Remova a grade de alimentos pelo menos 2 h antes da exposição. Todos os animais utilizados neste estudo eram camundongos machos C57BL/6 de 8 a 12 semanas de idade (peso médio: 20 g).
  2. Prepare o estímulo olfativo apropriado. Diferentes estímulos podem ser usados para ativar neurônios olfatórios no MOE (epitélio olfatório principal) ou VNO (órgão vomeronasal). Para uma lista abrangente de estímulos olfativos, consulte outras publicações3, 16, 22,23,24. Estímulos líquidos, como soluções químicas, urina ou solução de proteína recombinante, podem ser depositados em uma gaze médica ou bola de algodão.
  3. Insira o estímulo olfativo na gaiola e deixe o animal intacto por 1 h.
  4. Eutanasiar o sujeito do rato e dissecar rapidamente o MOE ou VNO usando ferramentas de dissecação sem RNase.

4. Dissecção e congelamento de tecidos

  1. Dissecar o MOE ou VNO sob um estereomicroscópio usando solução de dissecção.
    1. Para o VNO, remova os ossos septais espessos, deixando as conchas de cartilagem mais macias ao redor do órgão.
  2. Prepare a amostra para crioseccionamento.
    1. Seque a amostra em um pedaço de papel mata-borrão e coloque-a dentro de um molde plástico histológico contendo meio de incorporação.
    2. Para VNO, organize cada órgão verticalmente e puxe-o para o fundo do molde plástico com a ajuda de uma seringa de 1 mL (Figura 1A).
    3. Para MOE, coloque-o na parte inferior do molde de plástico com a placa cribriforme voltada para baixo.
    4. Remova o excesso de bolhas ao redor da amostra, pois elas podem interferir no seccionamento.
    5. Congele as amostras em gelo seco.
    6. Armazenar o bloco de amostras a -80 °C.
      NOTA: As amostras congeladas podem ser armazenadas por vários meses antes do seccionamento.
  3. Execute o corte criogênico.
    1. Ligue o criostato e ajuste a temperatura para -23 °C pelo menos 4 h antes da utilização.
    2. Remova o bloco congelado do molde de plástico histológico e corte-o com uma lâmina de barbear.
    3. Deixe 5 mm ao redor da amostra, pois isso facilita o manuseio da seção (Figura 1B).
    4. Use o meio de incorporação para prender o bloco ao suporte de amostra do criostato.
    5. Colete seções de 16 μm em lâminas de microscópio carregadas positivamente.
    6. Armazene as lâminas a -80 °C.
      NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a -80 °C por vários meses antes da hibridização in situ .

5. Protocolo de hibridização in situ passo a passo

  1. Seque as lâminas por 10 min usando um secador de cabelo. Use o jato quente para descongelar as lâminas e, em seguida, mude para o jato em temperatura ambiente até que o meio de incorporação fique opaco.
  2. Adicione 500 μL por lâmina de solução fixadora de paraformaldeído a 4% livre de RNase e incube a 23-26 °C por 15 min para fixar os cortes histológicos.
  3. Lave as lâminas duas vezes em PBS 1× sem RNase por 5 min cada.
  4. Adicione 500 μL por lâmina de HCl 0,2 M livre de RNase e incube a 23-26 °C por 10 min.
  5. Lave as lâminas duas vezes em PBS 1× sem RNase por 5 min cada.
  6. Adicione 500 μL por lâmina de PBS 0,1% H2O2/1× livre de RNase e incube por 30 min a 23-26 ° C. Execute esta etapa no escuro para evitar a degradação do peróxido de hidrogênio induzida pela luz.
  7. Lave as lâminas duas vezes em 1× PBS sem RNase por 5 min cada.
  8. Realizar a acetilação transferindo as lâminas para um frasco contendo 250 ml de trietanolamina 0,1 M pH 8,0 sem RNase e uma barra de agitação magnética, numa hotte. Adicione 625 μL de anidrido acético sob agitação constante. Diminua a velocidade de agitação, adicione mais 625 μL gota a gota nas lâminas, depois desligue a agitação e incube por 10 min.
  9. Lave as lâminas duas vezes em 1× PBS sem RNase por 5 min cada.
  10. Lave as lâminas uma vez em PBS 1× sem RNase a 60 °C durante 5 min.
  11. Realize a pré-hibridização removendo lâminas de 1× PBS, uma de cada vez, e secando cada uma delas usando papel de seda de laboratório sem fiapos. Pipetar 400 μL de solução de pré-hibridização em cada lâmina e colocá-la dentro de uma câmara umidificada pré-aquecida a 60 °C em banho-maria ou forno aquecido. Incubar a 60 °C durante 1 h.
  12. Aqueça solução de hibridização suficiente a 60 °C, alíquota de 200 μL por lâmina em tubos de microcentrífugas e aqueça-os até 85 °C por 10 min.
  13. Adicione a(s) sonda(s) de cRNA apropriada(s) aos tubos da solução de hibridização (1 μg/mL cada sonda) e desnature a 85 °C por 5 min.
  14. Para hibridização, retire uma lâmina de cada vez da câmara umidificada, seque-a e coloque-a em uma placa aquecida a 60 °C. Adicione 200 μL de solução de hibridização contendo ribossonda e cubra a lâmina com uma lamínula de vidro. Incubar durante 12-16 h na câmara humidificada a 60 °C.
    NOTA: Não permita que as lâminas esfriem após a pré-hibridização. A temperatura de hibridização deve ser determinada empiricamente para cada sonda. Sessenta graus Celsius são sugeridos como ponto de partida, uma vez que geralmente funciona bem para sondas de 1 kb.
  15. Aqueça as soluções de lavagem SSC a 55 °C em frascos separados e coloque-os em banho-maria à temperatura adequada.
  16. Após a hibridização, remover a lamínula de cada lâmina com um banho contendo 5× solução de SSC a 55 °C. Segure cada lâmina horizontalmente dentro da solução SSC quente. Quando a lamínula se soltar, incline a lâmina e deixe-a cair até o fundo.
  17. Lavar com 2× SSC a 55 °C durante 30 min num frasco de lâminas.
  18. Lavar com 0,2× SSC a 55 °C durante 20 min num frasco de lâminas.
  19. Lave com 0,1× SSC a 55 °C por 20 min em um frasco de lâminas.
  20. Transfira para 0,1× SSC a 23-26 °C e incube por 3 min em um frasco de lâminas.
  21. Lave em PTw por 10 min em um frasco de lâminas.
  22. Lave duas vezes em TN Buffer, por 5 min cada, em um frasco de lâminas.
  23. Pipetar 600 μL de tampão de bloqueio TNB em cada lâmina e incubar por 3 h a 23-26 °C.
  24. Pipetar 500 μL de solução de anticorpo primário (anticorpo anti-DIG conjugado com peroxidase diluído 1:400 em solução de TNB) em cada lâmina. Sobreponha cuidadosamente um pedaço de filme termoplástico de laboratório em cada lâmina e incube por 12-16 h a 4 °C.
  25. Lave as lâminas 6 vezes com TNT Buffer por 5 min cada, mexendo levemente em uma jarra de lâminas.
  26. Pipetar 100 μL de solução de trabalho de tiramida-biotina em cada lâmina. Cubra com lamínulas de filme de laboratório termoplástico e incube por 12 min a 23-26 °C.
    NOTA: Execute esta etapa de incubação de forma escalonada, com 2 ou 3 lâminas por lote, para permitir um bom controle sobre os tempos de incubação. A duração da incubação da tiramida pode precisar ser otimizada, dependendo da sensibilidade e concentração da sonda de cRNA.
  27. Lave as lâminas 6 vezes com TNT Buffer por 5 min cada, mexendo levemente em uma jarra de lâminas.
  28. Pipetar 200 μL de solução contendo estreptavidina conjugada com peroxidase (SA-HRP, diluída 1:100 em tampão TNB) em cada lâmina e cubra com uma lamínula de filme de laboratório termoplástico. Incubar a 23-26 °C durante 1 h.
  29. Lave as lâminas 6 vezes com TNT Buffer por 5 min cada, mexendo levemente em uma jarra de lâminas.
  30. Pipetar 100 μL de solução de trabalho de tiramida-Alexa 488 em cada lâmina, cobrir com lamínula de filme de laboratório termoplástico e incubar a 23-26 °C por 12 min no escuro.
  31. Lave as lâminas 6 vezes com TNT Buffer por 5 min cada, mexendo levemente em uma jarra de lâminas.
  32. Incubar em 3% H2O2/1× PBS em um frasco deslizante por 1 h, para inativar as peroxidases das etapas anteriores.
  33. Lave as lâminas 6 vezes com TNT Buffer por 5 min cada, mexendo levemente em uma jarra de lâminas.

6. Imunomarcação de pS6

  1. Pipetar 500 μL de solução de paraformaldeído a 4% / 1× PBS em cada lâmina e incubar a 23-26 ° C por 15 min para fixar as seções.
  2. Pipetar 500 μL de 1× PBS/0,1% Triton X-100 em cada lâmina e incubar por 5 min para permeabilizar as seções.
  3. Lave duas vezes com 1× PBS em uma jarra de lâminas.
  4. Pipetar 2-3 gotas por seção da solução B de bloqueio de amplificação de sinal de tiramida disponível comercialmente (Tabela de Materiais) e incubar a 23-26 ° C por 1 h.
  5. Pipetar 400 μL de solução de bloqueio imuno-histoquímico em cada lâmina e incubar a 23-26 ° C por 30 min para bloquear as seções.
  6. Pipetar 200 μL de solução de anticorpo primário anti-pS6 de coelho (diluído a 1:200 em solução de bloqueio imuno-histoquímico; concentração final: 1 μg/mL) em cada lâmina, cobrir com lamínula de filme termoplástico de laboratório e incubar a 4 °C por 12-16 h.
  7. Lave 3 vezes com 1× PBS / 0,1% Triton X-100, por 5 min cada em um frasco de lâminas.
  8. Pipetar 2-3 gotas por lâmina de solução de anticorpo secundário de coelho conjugada com peroxidase comercialmente disponível (Tabela de Materiais) e incubar a 23-26 ° C por 1,5 h.
  9. Lave 3 vezes com 1× PBS / 0,1% Triton X-100, por 5 min cada em um frasco de lâminas.
  10. Seque as lâminas e pipete 100 a 200 μL de solução de trabalho de tiramida-Alexa 555 em cada lâmina, cubra com um pedaço de lamínula de filme de laboratório termoplástico e incube por 7 min no escuro.
  11. Lave duas vezes com 1× PBS por 5 min cada em um frasco de lâminas.
  12. Pipetar 500 μL de coloração nuclear diluída (em 1× PBS) em cada lâmina e incubar a 23-26 °C por 30 min.
  13. Lave duas vezes com 1× PBS a 23-26 °C por 5 min cada em um frasco de lâminas.
  14. Monte as corrediças com o meio de montagem anti-desbotamento e deixe o meio de montagem curar por 24h no escuro.
  15. Armazene as lâminas na temperatura apropriada até a geração de imagens, para evitar o desbotamento da fluorescência.

7. Imagem microscópica

  1. As lâminas de imagem utilizam um microscópio de epifluorescência ou confocal equipado com filtros adequados para os fluoróforos utilizados.

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Resultados

O protocolo atual visa a obtenção de imagens de microscopia nas quais o gene de interesse do experimentador e o marcador de atividade neuronal pS6 são marcados com fluorescência. O método descrito envolve amplificação de sinal de tiramida, que produz uma rotulagem clara e forte com pouco ou nenhum fundo. A imunocoloração pS6 aparece como sinal fluorescente citoplasmático que geralmente preenche todo o corpo celular neuronal, enquanto o sinal de hibridização in situ para neurônios receptores olfatórios aparece co...

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Discussão

O protocolo descrito aqui identifica de forma confiável os neurônios sensoriais ativados por pistas químicas no sistema olfativo por meio de uma combinação de detecção in situ de receptores OR ou VR com imunodetecção de pS6, um marcador indireto da atividade neuronal. O experimentador deve tomar cuidado extra para manter a integridade histológica e realizar todas as etapas antes da hibridização em condições livres de RNase. Não fazer isso pode causar degradação do mRNA e comprom...

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Divulgações

Os autores declaram não ter interesses conflitantes de qualquer tipo.

Agradecimentos

Agradecemos a GAG Pereira e JA Yunes pelos recursos, APF Ferreira e WO Bragança pela ajuda administrativa e técnica, e à equipe do Life Sciences Core Facility (LaCTAD-UNICAMP) pela ajuda com a microscopia confocal. Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; processos 2009/00473-0 e 2015/50371-0 para F.P.), pela PRP/UNICAMP (processos 2969/16, 725/15, 348/14 e 315/12 para F.P.), por bolsas FAPESP para V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1) e pela bolsa da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) para T.S.N.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
10x solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x diluente de amplificação (tampão de reação de  Kit Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923 ou  B40922referido como Tampão de Amplificação A em soluções de trabalho para amplificação de sinal tiramida-Alexa 488 ou tiramida-Alexa 555
20x SSC Merck(Calbiochem)8310-OPn / a
30% Albumina de soro bovino (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n / a
30% de peróxido de hidrogênio (H2< / sub>O2< / sub>)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n / a
Anidrido acéticoMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgaroseMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Diluente de amplificação (do kit TSA Biotina)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAreferido como Tampão de Amplificação B em solução de trabalho para amplificação de sinal de tiramida-biotina
Anti-pS6 (Ser 244/247) anticorpo policlonal de coelhoThermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Buffer de bloqueio 1x (do kit Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923 ou  B40922referido como solução de bloqueio B na etapa de desenvolvimento do sinal de tiramida
Reagente de bloqueio (do kit de biotina TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAreferido como reagente de bloqueio A na formulação para tampão
TNB DAPI corante nuclearThermo Fisher ScientificD1306n/a
Solução de Denhardt (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Formamida desoinizadaMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Solução de sulfato de dextrano (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Ácido etileno-diamina-tetracético (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 coloração nuclearThermo Fisher ScientificH1399n/a
Ácido clorídrico (HCl)Merck ( Sigma-Aldrich)320331n/a
Estímulos olfativosn/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara et al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldeídoMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Anticorpo anti-digoxigenina conjugado com peroxidase (fragmentos de Fab)Merck (Roche)11207733910;   RRID: AB_514500referido como anticorpo anti-DIG conjugado com peroxidase
Anticorpo secundário anti-coelho conjugado com peroxidase (reagente anti-coelho de cabra conjugado com poliHRP de  Kit Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Estreptavidina conjugada com peroxidase (do kit de biotina TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold antifade mountantThermo Fisher ScientificP36934referido como meio de montagem anti-desbotamento
ultrapura sem RNaseThermo Fisher Scientific10977015n/a
Cloreto de sódio (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Dodecil sulfato de sódio (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Hidróxido de sódio (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a
SacaroseMerck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TrietanolaminaMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Cloridrato de Trizma (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a
Tween-20Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Conjugado Tyramide-Alexa 488 (do kit Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Conjugado Tiramida-Alexa 555 (do kit Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Conjugado Tiramida-Biotina (do kit TSA Biotina)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Levedura tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Kit Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoostThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
Kit de Rotulagem de RNA DIG (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
Tela de RNA de Alta SensibilidadeTape Reagentes de análise (tampão, escada e fita)Agilent5067-5580, 5067-5581, e 5067-5579referido como sistema de eletroforese automatizado
Mouse: cepa endogâmica C57BL/6JJackson LaboratoriesStock No:  000664;   RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro ColunasCytiva Biosciences28903408referido como kit de purificação baseado em filtragem de gel
Kit de extração de gel QIAquickQiagen28506referido como kit de purificação de gel baseado em mini coluna
Kit de limpeza RNeasy MinEluteQiagen74204referido como kit de purificação de RNA baseado em mini coluna
TSA Kit de biotinaAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotídeos
5' – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/aOlfr692
5' – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3'Integrated DNA Technologiesn/a
5'- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5' – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5' – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5' – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/aOlfr78
5' – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/aOlfr691
5' – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/aOlfr638
5' – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3'Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5' – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5' – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5' – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'Integrated		DNA Technologiesn/a
5' – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5' – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG • 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5' – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5' – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5' – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – TGGGTGTCTTCTTTCTCTCCTCAA
GA – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5' – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5' – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5' – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5' – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3'Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5' – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5' – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3'		Tecnologias Integradas de DNAn/a
5' – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5' – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
DNA recombinante
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360recomendado PCR clonagem vector
Other materials
1mL seringasFisher Scientific14-829-10Fn/a
Tubos cônicos (15 mL e 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Frascos CoplinFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CryostatLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Ferramentas de dissecação e pinçasRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a Banho
secon/an/a n/a
Eletroforese equipamentoFisher Scientific09-528-110Bn/a
Pincéis de ponta finaWinsor & Newton10269097n/a
Microscópio de fluorescência ou confocalLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
Placa aquecidaFisher ScientificHP88850200n/a
Câmara umidificada (se usada em temperaturas mais altas, precisará ser selada dentro de um recipiente de plástico Tupperware)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Laboratório sem fiapos KimwipesKimberly-Clark34120referido como papel de seda de laboratório sem fiapos
MicrocentrífugaEppendorf5401000013n/a
Gaiolas de ratoInnoViveM-BTM, MVX1n/a
PCR TermocicladorThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipeta p1000, p200 e p20 pontas descartáveisFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Molde de incorporação de histologia plásticaThermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FluorômetroThermo Fisher ScientificQ33238referido como método fluorométrico altamente sensível
Lâminas de barbear ou bisturisFisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation ou BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System ou 2100 Instrumento Bioanalisadorn/a
Cilindros e copos graduados de vidro ou plástico sem RNaseFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
EstereomicroscópioLeica MicrosystemsM80n/a
Lâminas de microscópio SuperFrost PlusThermo Fisher Scientific12-550-15referidas como lâminas de microscópio carregadas positivamente
ParafilmeBemis CompanyPM999referido como filme termoplástico de laboratório
Banho-mariaThermo Fisher ScientificTSCIR19n / a
Água

Referências

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Reimpressões e permissões

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Ativação NeuronalSistema Olfativo de CamundongoS6 FosforiladaDetecção de Estímulos QuímicosReceptores Acoplados a Proteína GComportamentos OlfativosReceptores Vomeronasais

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