Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام التصوير الحي لتصور آثار الضرر التأكيدي على توطين وديناميات الهياكل دون الخلوية في المبيضين Drosophila.
Abstract
التصوير الحي للمبايض Drosophila الميلانوغاستر كان له دور فعال في فهم مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية الأساسية أثناء التطوير ، بما في ذلك حركة جزيئات ribonucleoprotein ، وتوطين مرنا ، وحركة العضية ، وديناميكيات الهيكل العظمي. هناك عدة طرق للتصوير الحي تم تطويرها. يرجع ذلك إلى حقيقة أن كل طريقة ينطوي على تشريح ovarioles الفردية وضعت في وسائل الإعلام أو زيت الهالوكربون, الضرر الخلوية بسبب نقص الأكسجة و / أو التلاعب المادي سيحدث حتما مع مرور الوقت. تأثير واحد المصب من نقص الأكسجة هو زيادة الضرر التأكسي في الخلايا. الغرض من هذا البروتوكول هو استخدام التصوير الحي لتصور آثار الضرر التأكيدي على توطين وديناميات الهياكل دون الخلوية في مبايض Drosophila بعد تحريض التلف الخلوي الخاضع للرقابة. هنا، نستخدم بيروكسيد الهيدروجين للحث على تلف الأكسدة الخلوية وإعطاء أمثلة على آثار هذا الضرر على اثنين من الهياكل دون الخلوية، الميتوكوندريا وجزيئات النعيم كلو. ومع ذلك، هذا الأسلوب قابل للتطبيق على أي بنية الخلية الفرعية. القيود هي أن بيروكسيد الهيدروجين لا يمكن إلا أن تضاف إلى وسائل الإعلام مائي ولن تعمل للتصوير الذي يستخدم زيت الهالوكربون. وتتمثل المزايا التي بيروكسيد الهيدروجين هو متاح بسهولة وغير مكلفة، ويعمل بسرعة، ويمكن تعديل تركيزاتها، والضرر التأكسي هو تقريب جيد من الضرر الناجم عن نقص الأكسجة وكذلك تلف الأنسجة العامة بسبب التلاعب.
Introduction
قد تنشأ العديد من الضغوطات الخلوية المختلفة خلال الثقافة التجريبية والتلاعب في الأنسجة السابقة فيفو، بما في ذلك صدمة الحرارة، والإجهاد التأ المؤسد، والإجهاد التناضح، والإجهاد الغذائي، وظروف السمية. التصوير الحي هو أداة قوية تستخدم لتصور التغيرات في الوقت الحقيقي في الأنسجة الحية السابق بعد العلاج التجريبي والتلاعب. تشريح الأنسجة الدقيقة والتلاعب تأخذ الممارسة، ومقدار الوقت من تشريح للتصوير يمكن أن تختلف تبعا للتجربة. ويستند الأساس المنطقي لتطوير هذه الطريقة على القلق من أن إعداد الأنسجة للتصوير الحي يمكن أن يسبب الإجهاد الخلوي أثناء تشريح وإعداد التصوير. ويمكن أن يكون هذا مشكلة خاصة بالنسبة للعمليات الحساسة للتغيرات في التمثيل الغذائي الخلوي ومستويات الأكسجين المتاحة، مثل وظيفة الميتوكوندريا. في حين أن وجود عينة من نوع البرية موازية هو عنصر تحكم مهم، لا يزال هناك احتمال أن بعض أو كل التغيرات الملاحظة في الهياكل دون الخلوية يمكن أن يكون بسبب تلف أو ضغط الخلية من تشريح ولا تعكس علم وظائف الأعضاء الطبيعي أو العلاج أو الطفرة التي يجري دراستها.
لمعالجة هذه المشكلة المحتملة، ونحن نستخدم بيروكسيد الهيدروجين بالإضافة أثناء التصوير الحي من أجل الحث على الضرر الأكسدةالخلوية 1. والغرض من هذه الطريقة هو الحث على تلف الأنسجة من أجل رصد تأثير على الهياكل دون الخلوية. هذا البروتوكول مفيد لغرضين: 1) تحديد ما إذا كانت التغييرات في توطين دون الخلوية من هيكل الفائدة بسبب الإجهاد الناجم عن تشريح عديم الخبرة و 2) مرة واحدة الباحث واثق مع تقنيات التشريح الموصوفة لرصد تأثير الإجهاد الخاضع للرقابة على هيكل الفائدة. هنا نعرض مثالين عن كيفية زيادة الضرر التأسدي يسبب تغييرات في اثنين من الهياكل دون الخلوية، الميتوكوندريا وجزيئات النعيم كلو. للقيام بذلك، نستخدم المبيض Drosophila وهو نموذج شائع لدراسات التصوير الحي. أول مثال يفحص التعريب الميتوكوندريا. في تجربتنا، توطين الميتوكوندريا العادي في الخلايا الجرثومية الأنثوية حساس للغاية للانزعاج ويمكن أن يكون بمثابة نذير للإجهاد الخلوي. الميتوكوندريا في الخلايا الجرثومية الإناث Drosophila عادة ما تكون موزعة بالتساوي في جميع أنحاء السيتوبلازم2. إضافة بيروكسيد الهيدروجين يسبب organelles إلى سوء الموقع بسرعة وتكتل بطريقة مماثلة لمختلف الطفرات3,4,5. المثال الثاني هي جسيمات النعيم التي شكلتها جاهل (Clu). Clu هو بروتين ريبونوكليوبروتين منتشر في جميع أنحاء السيتوبلازم; ومع ذلك، فإنه يشكل أيضا الجسيمات المرتبطة الميتوكوندريا في ظل الظروف الخلوية المثلى5. لأن وجود جسيمات Clu يعتمد على الظروف الخلوية الصحية ، فقد اصطلحنا على تسميتها "النعيم" الجسيمات3،5،6. إضافة بيروكسيد الهيدروجين يسبب هذه الجسيمات لتفريق بسرعة وتصبح متجانسة في السيتوبلازم5. في سياق دراساتنا ، لاحظنا تغييرات في توطين كل من هذه الهياكل دون الخلوية ، ولكن فقط بعد إجراء دراسات التصوير الحية يمكننا أن نقدر تمامًا تأثير الإجهاد الخلوي والضرر التأكيدي على التوطين وديناميات الميتوكوندريا والجسيمات.
10- إن فائدة هذا البروتوكول بوصفه إضافة إلى الأساليب التي سبق إنشاؤها أو بديلة تتوقف على عدة عوامل. أولاً، يجب أن يكون بروتوكول التصوير قابلاً لإضافة الأدوية. إذا تم تركيب العينة تحت غطاء وفي زيت الهالوكربون، فإن هذه الطريقة لن تكون ممكنة7. H2O2 بالإضافة إلى أسباب ارتفاع سريع في الضرر التأ المؤكد، وبالتالي، قد لا يكون هذا الجدول الزمني المناسب. ويمكن اعتبار الضرر التأكسي وكيلا عن نقص الأكسجة؛ ومع ذلك، قد يكون قاسية جداً أو معممة جداً لتعمل كعنصر تحكم مناسب لتلف بعض المكونات دون الخلية. وأخيراً، بالنسبة لتجارب التصوير التي تستمر ساعات مثل تلك التي تتبع عملية تطويرية، قد تكون إضافة H2O2 قوية جدًا (على سبيل المثال8). اختبار منحنى تركيز قد التغلب على هذا القيد.
Protocol
1- إعداد وسائل الإعلام التشريحية والتصويرية
ملاحظة: وسائل الإعلام الأكثر ملاءمة لهذه التجربة التصوير الحي يحتوي على وسائط Drosophila شنايدر التي تحتوي على 15٪ من الحرارة تنشيط مصل الأبقار الجنين، 0.6x القلم-ستريب، و 200 ميكروغرام / مل الأبقار الأنسولين، ويشار إليه فيما بعد باسم وسائل الإعلام اكتمال شنايدر.
- القيام بالتحضير الإعلامي في ظروف معقمة لضمان عدم تلوثها. تم تطوير وسائل الإعلام لدعم Drosophila ovarioles لفترات طويلة من الوقت9.
- إضافة 15٪ تنشيط مصل الأبقار الجنينية، 0.6x القلم-ستريب، و 200 ميكروغرام / مل الأنسولين البقري إلى وسائل الإعلام شنايدر.
- اخلط المحتويات جيداً واحفظها عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: الأنسولين لا يذوب تماما في وسائل الإعلام شنايدر كاملة، وسوف تلاحظ استقرار عجل في الجزء السفلي من الأنبوب. - جعل aliquots من وسائل الإعلام ، ويجري التأكد من ترك العجل لأنها سوف تتداخل مع التصوير.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا الحل في غضون شهر واحد إذا تم تخزينه في aliquots عند 4 درجة مئوية.
2. مجموعة من دروسوفيليا للتشريح
ملاحظة: يمكن أيضاً الاطلاع على إجراءات جمع وتشريح Drosophila المفصلة في Weil etal. 10 و Parker etal.
- للحصول على التصوير الأمثل للخلايا الجرثومية الأنثوية ، قم أولاً بإعداد قارورة تحتوي على طعام قياسي لطي دقيق الذرة وداب من معجون الخميرة الرطبة هو اتساق زبدة الفول السوداني. وهذا يضمن أن الذباب الأنثوي يتغذى بشكل جيد وسينتج جميع مراحل نمو الجريب للتصوير.
- للحصول على ذباب صحي على النحو الأمثل، وجمع 0-1 اليوم الإناث القديمة ونقل مع الذكور في قارورة الطعام ذبابة تحتوي على معجون الخميرة الرطب.
ملاحظة: تأكد من أن الذباب النائم لا تتصل معجون الخميرة لأنها يمكن أن تلتصق به. - تغذية الذباب 3-7 أيام، وتغيير القارورة ولصق الخميرة يوميا.
ملاحظة: تأكد من لصق الخميرة اتصالات الطعام ذبابة حتى لا تجف.
3. دراوسوفيليا التسلخ المبيض
ملاحظة: من المهم إعداد حلول الوسائط الطازجة لأن بيروكسيد الهيدروجين عرضة للأكسدة و TMRE يتحلل بمرور الوقت.
- الحق قبل تشريح, في وسائل الإعلام شنايدر كاملة, إعداد aliquot جديدة من 2 μM H2O2 الحل, aliquot جديدة من 46 nM tetrameylrhodamine, إستر إيثيل (TMRE), و aliquot جديدة من 46 nM TMRE الحل الذي يحتوي على 2 μM H2O2.
- لتشريح المبيض، استخدم اثنين من أزواج من ملقط غرامة وزوج من الإبر التنغستن شحذ كهربائيا12. لتشريح المبيضين، ملء 2-3 آبار من طبق تشريح القاع الزجاج (زجاج ووتش) مع اكتمال شنايدر التي تم تسخينها إلى درجة حرارة الغرفة.
- تخدير قارورة الذباب المُسمن بثاني أكسيد الكربون وفصل العدد المطلوب من الذباب الأنثوي الذي سيتم تشريحه. ضع ذبابة واحدة في وسائل الإعلام باستخدام ملقط.
- تحت مجهر تشريح، فهم بلطف ذبابة من الصدر باستخدام زوج واحد من ملقط غرامة. مع الزوج الآخر من ملقط، فهم الخلفي، وسحب بلطف لإزالة المبيضين.
ملاحظة: إذا لم يخرج المبيضين بسلاسة باستخدام هذه الطريقة، يمكن أيضا إزالة البطن بأكمله من الذبابة، ويمكن الضغط على المبيضين بلطف من أي من طرفي البطن باستخدام ملقط. - إزالة أي بشرة غريبة أو الأنسجة, ثم نقل المبيضين إلى بئر جديدة تحتوي على وسائل الإعلام الطازجة. يجب أن يكون المبايض لا يزال يتحرك من اجةدعض العضلات المحيطة.
4. إعداد ovarioles للتصوير
- باستخدام الإبر التنغستن شحذ، ندف بلطف ovarioles وبصرف النظر، مع الحرص على إزالة غماد العضلات المحيطة بها(الشكل 1).
- بلطف ندف بعيدا أي غماد العضلات والألياف العصبية تعلق على ovarioles معزولة (الشكل 2).
ملاحظة: إذا لم تتم إزالة اغتم العضلات، سوف ovariole نشل والتحرك، مما تسبب في مشاكل مع الحصول على صورة(فيديو 1). - إذا كانت الهياكل دون الخلية من الفائدة هي ذاتية التسمية، انتقل إلى الخطوة 4.4. إذا كانت الهياكل ذات الاهتمام سيتم تصنيفها بصبغة فلورية، انتقل إلى القسم 5.
- مرة واحدة وقد تم تشريح ovarioles نظيفة، وذلك باستخدام micropipette، ونقلها في قطرة 100 ميكرول من وسائل الإعلام التصوير كاملة شنايدر في الاكتئاب الزجاج من طبق القاع الزجاج. سوف تغرق ovarioles الفردية إلى الجزء السفلي من قطرات.
- انتقل إلى القسم 6 للتصوير.
ملاحظة: بالنسبة لجزيئات الميتوكوندريا و Clu لئيم التصوير، لا ينبغي أن تنقضي أكثر من خمس إلى عشر دقائق من بداية التشريح إلى التصوير.
5. تلطيخ الميتوكوندريا مع TMRE
ملاحظة: يمكن العثور على إجراءات تفصيلية إضافية بشأن التلطيخ الحي لميتوكوندريا مع الأصباغ الفلورية في باركر وآخرون 2017.
- بعد الخطوة 4.3، نقل ovarioles معزولة في قطرة 100 ميكرولتر من 46 nM TMRE وسائل الإعلام في اكتئاب الزجاج من طبق القاع الزجاج. سوف تغرق ovarioles الفردية إلى الجزء السفلي من قطرات.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ضع الغطاء على الطبق الزجاجي السفلي ووضع الطبق في صندوق مغطى طوال مدة التجربة للحماية من الضوء.
ملاحظة: بعد الحضانة، يمكن تصوير العينات مباشرة مع أي يغسل. - كرر الخطوات 5.1-5.2 لإعداد طبقين على الأقل من ovarioles المسمى TMRE، واحد لتكون بمثابة مجموعة تجريبية واحد لتكون بمثابة عنصر تحكم.
6. الحصول على صورة حية
- بمجرد تركيب ovarioles ، ضع أحد أطباق القاع الزجاجية على المجهر و قم بتكوين معلمات التصوير حسب الضرورة. الإثارة الأمثل / أطوال موجية الانبعاثات لMMRE المستخدمة هنا هي 549 نانومتر /574 نانومتر.
- بعد تحديد موقع مجال الرؤية المطلوب ، احصل على صور ثابتة أو مقاطع فيديو قصيرة لواحد أو أكثر من ovarioles حسب الرغبة كسجل لظروف ما قبل العلاج.
7. إضافة بيروكسيد الهيدروجين أثناء التصوير
- وقفة التصوير الحي، وإزالة الغطاء من طبق القاع الزجاج، وإضافة بعناية 100 ميكرولتر من 2 μM H2O2 حل للطبق باستخدام ميكروبليت إذا تصوير الهياكل المسماة بشكل داخلي. إذا التصوير الميتوكوندريا، إضافة بعناية 100 ميكرولتر من 46 NM TMRE مع 2 μM H2O2 حل للطبق باستخدام ميكروبيت(فيديو 2).
- تجنب كسر سطح قطرة الوسائط الموجودة أو إضافة المحلّل بسرعة كبيرة حتى لا يزيّد الـovarioles على الجزء السفلي من الطبق(فيديو 2).
- استبدل غطاء الطبق (غطاء الطبق)، ونقل وإعادة تركيز مجال الرؤية المطلوب إذا لزم الأمر، واستئناف التصوير(فيديو 3، فيديو 4، الشكل 3، الشكل 4).
- الحرص على استئناف التصوير في أسرع وقت ممكن بعد H2O2 بالإضافة إلى العلاج التجريبي هو الوقت الحساسة(فيديو 5).
- احصل على صور ثابتة أو مقاطع فيديو قصيرة لواحد أو أكثر من ovarioles حسب الرغبة. وسيكون ذلك بمثابة سجل للظروف اللاحقة للعلاج.
- للتحكم، ضع الطبق الزجاجي السفلي الثاني على المجهر وكرر القسم 6.
- كرر الخطوة 7.1، وهذه المرة إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام TMRE فقط إلى الطبق. إذا كان التصوير الهياكل التي تحمل التسمية الذاتية، أضف 100 ميكرولتر من الحل الكامل للوسائط الخاص بـ Schneider.
- كرر الخطوات 7.2 و 7.3 للحصول على بيانات لمجموعة التحكم.
ملاحظة: بالنسبة لجسيمات الميتوكوندريا و Clu لـ Clu، يجب أن لا تنقضي أكثر من ثلاث إلى خمس دقائق من إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى التصوير.
Representative Results
يمكن استخدام البروتوكولات الموصوفة لدراسة آثار بيروكسيد الهيدروجين أثناء التصوير الحي لمبيضي الدوزوفيا. كما هو مبين في الشكل 3، الشكل 4، 3 والفيديو 4 ، وهذا الإجراء يوفر وسيلة فعالة لتصور التغيرات في الأنسجة وديناميات بعد العلاج التجريبي في الوقت الحقيقي. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول هو محدد لإضافة H2O2 إلى ovarioles أثناء التصوير. ومع ذلك، يمكن تكييفها لإضافة خارجية من الأدوية الأخرى أو الكواشف ذات الأهمية. وبالإضافة إلى ذلك، قد تكون المسام تحمل علامات الفلورسنت ذات الأهمية (مثل رباعي الميثيل هوددامامين (TMRE) وLysoTracker) قبل التصوير(فيديو 3). الخطوات الأكثر أهمية للحصول على نتائج التصوير واضحة هي 1) تشريح السليم والعزلة من ovarioles واحد مع إزالة جميع العناصر المتعاقدة(الشكل 1 والشكل 2)و 2) السرعة التي يتم إعادة تشغيل التصوير بعد إضافة بيروكسيد الهيدروجين. الفيديو 4 هو مثال على بصيلات تشريح بشكل صحيح التي لا تزال ثابتة طوال مدة التصوير بالمقارنة مع الفيديو 1، والذي يوضح بصيلات تشريح سيئة الخروج من مجال الرؤية أثناء التصوير. الفيديو 5 هو مثال على ذلك H2O2 آثار على MMRE المسمى الميتوكوندريا قد تقدمت بالفعل قبل بدء التصوير نتيجة الكثير من الوقت المنقضي. بالمقارنة مع الفيديو 3 الذي تم إعادة تشغيل التصوير مباشرة بعد إضافة بيروكسيد الهيدروجين (الوقت 0) وسليمة، الميتوكوندريا مشتتة لا تزال مرئية، الميتوكوندريا في الفيديو 5 بدأت بالفعل في تكتل واضح وتفقد إمكاناتها غشاء عند إعادة تشغيل التصوير. ويعزى هذا العدد في الغالب إلى تعطيل وظائف العينة خلال H2O2 بالإضافة ويمكن تخفيفها باتباع تقنية للحفاظ على وسائل الإعلام التصوير ووضع العينة سليمة(فيديو 2). وتجدر الإشارة إلى أن تجارب التحكم التي أجريت دون إضافة H2O2 إلى وسائل الإعلام، و[الميتوكوندريا] في بصيلات لا تزال منتشرة بشكل صحيح، وصبغة TMRE لا تزال معزولة في الميتوكوندريا.
الشكل 1: عزل المبيضات المفردة عن مبايض دروسوفيليا. (A) رسوم متحركة تشير إلى زوج من المبيضين ، أوفاريول واحد (سهم) مع الجرثومة عند طرف (رأس السهم) واثنين من الأغماد العضلية التي تحيط بالأفاريل (البني ، الظهارية) والمبيض (البني ، الصفاق). (B) تشريح الدوزوفيا المبيض. (C) الفصل اللاحق للمبيض المُثير إلى ovarioles الفردية (السهم). شريط المقياس = 100 أم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إزالة الألياف العصبية وعناصر التقلص من ovarioles واحد. (A) ovariole واحد مع بقايا الأنسجة العصبية وعضد العضلات لا تزال تعلق (السهم). (ب) إزالة لطيف من جميع الأنسجة المتبقية تعلق على ovariole في (السهم). شريط مقياس = 100 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: H2O2 يسبب سوء تخصيص الميتوكوندريا. (A-A") يعيش صورة التشميس من cluCA06604 (Clu ::GFP الذباب) جريب. إضافة H2O2 يسبب الميتوكوندريا إلى تكتل على مدى مدة التصوير. TMRE تسمية الميتوكوندريا يشير إلى أن الميتوكوندريا في البداية تفرقت في الوقت 0 (A) ، وأن الميتوكوندريا تبدأ في التكتل بعد H2O2 بالإضافة (A′) في وقت لاحق نقطة ، وتسمية TMRE يصبح متقطعا بسبب الميتوكوندريا فقدان إمكانات الغشاء وبالتالي قدرتها على عزل الصبغة (A"). أبيض = TMRE(A-A"). قضبان المقياس: 10 ميكرومتر في (A) لـ A-A"5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: H2O2 يثر Clu. (أ - أ") يعيش صورة ال ستيلات من جريب cluCA06604 تغذية جيدة. إضافة H2O2 يسبب الجسيمات لتفريق وتصبح متجانسة في السيتوبلازم على مدى مدة التصوير. أبيض = Clu::GFP(A-A"). شريط مقياس: 40 ميكرومتر في (A) ل A-A"5. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1: جريب من cluCA06604 أنثى. كما هو موضح في الشكل 2، فإن الفشل في إزالة عناصر الألياف العصبية من ovarioles واحد يسبب الانجراف ملحوظ وحركة ovarioles أثناء التصوير وعدم القدرة اللاحقة على تحليل بيانات التصوير. أبيض = Clu::GFP. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 2: إضافة مناسبة من H2O2 لعينة طبق. وينبغي إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى طبق العينة باستخدام ميكروبليت الحجم المناسب. الاستغناء H2O2 دون كسر سطح وسائل الإعلام. يتم الحرص على تجنب كسر سطح وسائط التصوير لتقليل الانجراف عينة أثناء إضافة بيروكسيد الهيدروجين. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 3: H2O2 بالإضافة أثناء تصوير TMRE المسمى بصيلات. بصيل من cluCA06604 أنثى ملطخة TMRE. H2O2 يسبب سوء تخصيص الميتوكوندريا في بصيلات الدوزوفيليا. أبيض = صبغة TMRE. صورة إطار واحد لكل 15 ثانية لمدة 20 دقيقة، والفيديو هو 10 إطارات في الثانية5. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 4: H2O2 بالإضافة خلال تصوير Clu::GFP بصيلات. جريب من cluCA06604 أنثى. H2O2 يثر جزيئات Clu كما هو موضح في الشكل 4. أبيض = Clu::GFP. صورة إطار واحد لكل 15 ثانية لمدة 15 دقيقة ، والفيديو هو 10 إطارات في الثانية الواحدة. 5يرجى النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
فيديو 5: تأخر التصوير بعدإضافة H2O2. جريب من cluCA06604 أنثى. إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى بصيلات هو علاج حساس للوقت. تم تأخير إعادة تشغيل التصوير في هذا الفيديو نتيجة لتشريد العينة خلال إضافة H2O2. وقد بدأت الميتوكوندريا بالفعل في التكتل بشكل واضح وتفقد إمكاناتها الغشاء عند إعادة تشغيل التصوير في الوقت 0 (بالمقارنة مع الوقت 0 في الفيديو 3). سيؤدي الفشل في استئناف التصوير بسرعة بعد العلاج إلى نتائج غير دقيقة وغير صالحة للاستعمال حيث سيتم تفويت التأثيرات التجريبية المبكرة قبل التصوير. أبيض = TMRE. صورة إطار واحد لكل 15 ثانية لمدة 20 دقيقة ، والفيديو هو 10 إطارات في الثانية الواحدة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
Discussion
يمكن أن يكون هذا البروتوكول إضافة مفيدة كتحكم في القطع الأثرية بسبب تشريح المبيض وحضانة الأنسجة لأي تجربة تصوير حية. تشبه الخطوات الهامة تلك التي تم العثور عليها لبروتوكولات التصوير الحي الأخرى. تعلم كيفية تشريح المبيضين دروسوفيليا كله يأخذ الممارسة; ومع ذلك، يمكن عادةً تعلم هذه المهارة بسرعة إلى حد ما مع أدوات التشريح المناسبة. أكثر صعوبة لإتقان هو إزالة العضلات تغلف المبيضين وكل ovariole13. يجب القيام بذلك لضمان تقلصات العضلات لا تتداخل مع الحصول على صورة. إذا كان استخدام الإبر التنغستن شحذ للقيام بذلك لا يثبت نجاحها، يمكن استيعاب الجرثومة في غيض من ovariole مع ملقط و ovariole سحبت من مغد العضلات. ومع ذلك، هذه التقنية هي إشكالية إذا كانت المراحل التنموية الأولى هي التي يتعين فحصها لأنها يمكن أن تصبح معطوبة. خطوة رئيسية أخرى هي عدم طرد ovarioles يستريح على الجزء السفلي من الطبق عند إضافة H2O2. وهناك جانب هام إضافي مشترك بين جميع التصوير الحي: يجب على الباحث التأكد من أن هيكل الاهتمام هو الفلورسنت المسمى جيدا قبل العلاج. الأطباق المستخدمة هنا (جدول المواد) تستخدم عادة للتصوير الحي . ومع ذلك، أي طبق أو الشريحة مع غطاء زجاجي على الجزء السفلي أو حتى غطاء زجاجي كبير يجب أن تعمل طالما يمكن تغطية قطرة من وسائل الإعلام لمنع تبخر وسائل الإعلام. بينما نستخدم مجهر معين، أي مجهر مقلوب مع هدف التكبير كافية لرؤية بنية دون الخلية في السؤال وكاميرا المرفقة التي لديها دقة كافية ومعدل التقاط الصور يجب أن تعمل.
في حين أن مختبرنا مهتم في المقام الأول بوظيفة الميتوكوندريا ، يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة في فحص ديناميكيات وتوطين أي بنية تحت الخلايا أو أعضاءية ، مثل النواة أو الهيكل الخلوي أو النتقال endoplasmic. ومع ذلك، هذا الأسلوب له قيود. من أجل إضافة بيروكسيد الهيدروجين، يجب أن يكون النسيج في وسائل الإعلام مائي. طريقة بديلة للتصوير الحي هو استخدام زيت الهالوكربون، الذي كان له دور فعال في وصف العديد من العمليات الهامة في ovarioles دروسوفيلا بما في ذلك أول مثال على الحركة الديناميكية من GFP في كائن حي نموذجي7،14. وبالإضافة إلى ذلك، إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى وسائل الإعلام يسبب الضرر التأ المؤكد واسعة الانتشار التي قد تكون عامة جدا إهانة للأنسجة لتكون مفيدة لعملية الخلوية من الفائدة، وخاصة بالنسبة للتجارب أطول دراسة التنمية. على الرغم من أنه قد لا يكون من الممكن تنفيذ التجارب التي تتطلب تصور الخلية على مدى فترات طويلة من الزمن بسبب هذا الضرر التأكسي السريع والواسع النطاق والمرجح، فقد رأينا أن علاج بيروكسيد الهيدروجين الحاد الذي وصفناه ينطبق على معظم مراحل تولد الخلايا حيث أننا قادرون على رؤية نفس الآثار في معظم المراحل خلال الفترة الزمنية للتصوير. ونظرا لانخفاض تكلفة وسهولة البروتوكول، قد يكون من المفيد السيطرة على الضرر ويمكن استخدامها كعلاج قبل التثبيت ووضع العلامات المضادة كذلك.
في أيدينا، H2O2 العلاج يحاكي التغيرات في سوء تخصيص الميتوكوندريا وتشتت الجسيمات كل النعيم التي نراها في المسوخ الدوزوفيليا المختلفة. كما أنه يحاكي النتائج التي نراها للباحثين الجدد في تقنيات تشريح التعلم المختبر. لذلك، كشفت هذه الطريقة بوضوح أن إعداد العينة والإجهاد الخلوي العام يمكن أن يؤدي إلى تغييرات غير متوقعة وغير مبررة سابقا لسوء تحديد المواقع الميتوكوندريا ووجود جزيئات النعيم. تحريك هذه التقنية إلى الأمام، يمكن تحوير تركيزات بيروكسيد الهيدروجين باستخدام تركيز أعلى أو أقل. إذا كان تأثير الخلوية هو أن ينظر باستخدام تركيز أقل, فمن الممكن أن يكون النمط الظاهري الإجهاد يمكن عكسها عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع شنايدر كاملة. قد تكون الضغوطات المختلفة للخلايا مثل الكربونيل سيانيد m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) أو الزرنينيت أو صدمة حرارية بسيطة مفيدة للإجهاد الخلوي العام للهياكل الأخرى دون الخلوية. منذ التصوير الحي للأنسجة الحية السابق يتطلب التلاعب اليدوي والحضانة في وسائل الإعلام المختلفة، وينبغي أن يكون هذا التحكم إضافة مفيدة لضمان أي ملاحظات هي أقرب إلى علم وظائف الأعضاء العادي ممكن.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر الدكتور جيريمي سميث لدعم التصوير وآن سي شينك على الرسوم التوضيحية والإنتاج والفيديو. وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1R01GM127938 إلى R.T.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active dry yeast | Red Star® | ||
| CO2 gas | 99.9% purity | ||
| CO2 pad | |||
| Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
| Dissecting needles - PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
| Dissecting needles - PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
| Dissecting needles - tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
| Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
| Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
| y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |
References
- Winterbourn, C. C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction. Toxicology Letters. 82-83, 969-974 (1995).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. Clueless, a conserved Drosophila gene required for mitochondrial subcellular localization, interacts genetically with parkin. Disease Models & Mechanisms. 2 (9-10), 490-499 (2009).
- Sen, A., Kalvakuri, S., Bodmer, R., Cox, R. T. Clueless, a protein required for mitochondrial function, interacts with the PINK1-Parkin complex in Drosophila. Disease Models & Mechanisms. 8 (6), 577-589 (2015).
- Sheard, K. M., Thibault-Sennett, S. A., Sen, A., Shewmaker, F., Cox, R. T. Clueless forms dynamic, insulin-responsive bliss particles sensitive to stress. Developmental Biology. 459 (2), 149-160 (2020).
- Sen, A., Cox, R. T. Clueless is a conserved ribonucleoprotein that binds the ribosome at the mitochondrial outer membrane. Biology Open. 5 (2), 195-203 (2016).
- Parton, R. M., Valles, A. M., Dobbie, I. M., Davis, I. Isolation of Drosophila egg chambers for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (4), 5402 (2010).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
- Parker, D. J., Moran, A., Mitra, K. Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries. Journal of Visualized Experiments. (119), e54989 (2017).
- Brady, J. A simple technique for making fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
- Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps. Developmental Biology. 314 (2), 329-340 (2008).
- Wang, S., Hazelrigg, T. Implications for bcd mRNA localization from spatial distribution of exu protein in Drosophila oogenesis. Nature. 369 (6479), 400-403 (1994).
