Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Resumo

Este protocolo descreve o uso de um peróxido de hidrogênio geneticamente codificado (H₂O₂)-biosensor em neurônios e larvas de zebrafish cultivados para avaliar os papéis de sinalização fisiológica de H₂O₂ durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Pode ser aplicado a diferentes tipos de células e modificado com tratamentos experimentais para estudar espécies reativas de oxigênio (ROS) no desenvolvimento geral.

Resumo

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas de sinalização bem estabelecidas, que são importantes no desenvolvimento normal, homeostase e fisiologia. Entre os diferentes ROS, o peróxido de hidrogênio (H₂O₂) é melhor caracterizado em relação aos papéis na sinalização celular. H₂O₂ foi implicado durante o desenvolvimento em várias espécies. Por exemplo, um aumento transitório em H₂O₂ foi detectado em embriões de zebrafish durante os primeiros dias após a fertilização. Além disso, o esgotamento de uma importante fonte celular H₂O_2, NADPH oxidase (NOX), prejudica o desenvolvimento do sistema nervoso, como a diferenciação, o crescimento axonal e a orientação das células de gânglios retinianos (RGCs) tanto in vivo quanto in vitro. Aqui, descrevemos um método para imagem intracelular H₂O_{2 níveis} em neurônios de zebrafish cultivados e larvas inteiras durante o desenvolvimento usando o biosensor específico H₂O₂geneticamente codificado, roGFP2-Orp1. Esta sonda pode ser transitória ou stably expressa em larvas de zebrafish. Além disso, a leitura ratiométrica diminui a probabilidade de detectar artefatos devido à expressão genética diferencial ou efeitos de volume. Primeiro, demonstramos como isolar e cultivar RGCs derivados de embriões de zebrafish que expressam transitoriamente roGFP2-Orp1. Então, usamos larvas inteiras para monitorar os níveis de H₂O₂ no nível do tecido. O sensor foi validado pela adição de H₂O₂. Além disso, essa metodologia poderia ser usada para medir os níveis de H₂O₂ em tipos e tecidos celulares específicos, gerando animais transgênicos com expressão biosensora específica do tecido. Como os zebrafish facilitam manipulações genéticas e de desenvolvimento, a abordagem aqui demonstrada poderia servir como um pipeline para testar o papel de H₂O₂ durante o desenvolvimento neuronal e geral embrionário em vertebrados.

Introdução

A sinalização reativa da espécie oxigênio (ROS) regula o desenvolvimento e o funcionamento do sistema nervoso¹. Uma importante fonte ros celular são as oxidases NADPH (NOX), que são proteínas transmembranas que geram superóxido e peróxido de hidrogênio (H₂O₂)². Enzimas NOX são encontradas em todo o sistema nervoso central (CNS), e ros derivado do NOX contribuem para o desenvolvimento neuronal^3,4,5,6. A manutenção e diferenciação das células-tronco neurais, o estabelecimento da polaridade neuronal, do crescimento do neurite e da plasticidade sináptica têm sido mostrados como necessários níveis adequados de ROS^7,8,9,10,11. Por outro lado, a produção descontrolada de ROS por NOXes contribui para distúrbios neurodegenerativos, incluindo doença de Alzheimer, esclerose múltipla e lesão cerebral traumática^12,13,14. Por isso, a produção de ROS fisiologicamente relevante é fundamental para a manutenção de condições saudáveis.

O desenvolvimento de biosensores geneticamente codificados facilitou muito a detecção de ROS celular. Uma vantagem importante dos biosensores geneticamente codificados é o aumento da resolução temporal e espacial do sinal ROS, pois esses sensores podem ser especificamente direcionados a locais distintos. O GFP sensível ao redox (roGFP) é um tipo desses biosensores ROS. A variante roGFP2-Orp1 detecta especificamente H₂O₂ através de seu domínio Orp1, que é uma proteína geneatoxitina de glutationa peroxiredoxina a partir da levedura^15,16. A oxidação da proteína Orp1 é transferida para roGFP2 para alterar sua conformação (Figura 1A). A sonda exibe dois picos de excitação perto de 405 nm e 480 nm, e um único pico de emissão de 515 nm. Após a oxidação, a intensidade da fluorescência em torno dos picos de excitação muda: enquanto a excitação de 405 nm aumenta, a excitação de 480 nm diminui. Assim, roGFP2-Orp1 é um biosensor ratiométrico, e os_níveisde H₂O 2 são detectados pela razão de intensidades de fluorescência animadas em dois comprimentos de onda diferentes(Figura 1B). No geral, roGFP2-Orp1 é uma ferramenta versátil para imagens ROS que pode ser utilizada de forma eficiente in vivo.

Figura 1: Espectros de representação e excitação esquemática de roGFP2-Orp1. (A) A transferência oxidante ocorre entre Orp1 e roGFP2 em resposta a H₂O₂, levando a alterações conformais no roGFP2. (B) O espectro de excitação do roGFP2-Orp1 exibe dois picos de excitação de 405 nm e 480 nm e pico de emissão única de 515 nm. Após a oxidação por H₂O_2,a excitação de 405 nm aumenta enquanto a excitação de 480 nm diminui. Isso resulta em uma leitura ratiométrica para a presença de H₂O_2. O número foi modificado de Bilan e Belousov (2017)¹⁶ e Morgan et al. (2011)²⁵. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O sistema modelo Danio rerio (zebrafish) tem várias vantagens para aplicar biosensores geneticamente codificados. A transparência óptica dos embriões e larvas permite imagens in vivo não invasivas. Novas ferramentas de imagem estão sendo desenvolvidas para alcançar maior resolução e penetração mais profunda¹⁷. Além disso, existem ferramentas estabelecidas para manipulação genética (expressão ectópica mRNA, transgênese Tol2, etc.) e edição de genomas (TALENs, CRISPR/Cas9, etc.), que promove a geração de animais transgênicos¹⁸. À medida que os embriões de zebrafish se desenvolvem fora da mãe, este sistema permite ainda mais acesso e manipulação dos embriões. Por exemplo, injeções de estágio de uma célula e tratamentos medicamentosos podem ser facilmente feitos.

Aqui, usamos zebrafish para expressar transitoriamente o biosensor H₂O₂-específico roGFP2-Orp1 injetando mRNA in vitro transcrito. Esses embriões podem ser usados tanto para imagens in vitro de neurônios cultivados quanto para imagens in vivo (Figura 2). Descrevemos um protocolo para dissecar e emplacar células de gânglios de retina (RGCs) de embriões de zebrafish seguidos pela avaliação dos níveis de H₂O₂em neurônios cultivados. Em seguida, apresentamos um método para imagens in vivo de embriões e larvas que expressam roGFP2-Orp1 usando microscopia confocal. Esta abordagem não só permite determinar os níveis fisiológicos H₂O_2,mas também possíveis mudanças ocorridas em diferentes estágios ou condições de desenvolvimento. No geral, este sistema fornece um método confiável para detectar H₂O₂ em células vivas e animais para estudar o papel de H₂O₂ no desenvolvimento, saúde e doenças.

Figura 2. Esboço da abordagem experimental. Brevemente, após a coleta de embriões, roGFP2-Orp1 mRNA é injetado na gema de embriões de zebrafish estágio de uma célula. Embriões em desenvolvimento podem ser usados paraimagens in vitro ein vivo . ( A )Osembriões GFP positivos são usados para dissecar retinas para coleta de RGC a 34 hpf. Os RGCs dissociados são emplacados em tampas revestidas de PDL/laminina na mídia ZFCM (+). A imagem do cone de crescimento pode ser conduzida à medida que os RGCs estendem seus axônios após 6-24 h de revestimento. As células podem ser submetidas a diferentes tratamentos para medir as possíveis mudanças nos níveis de H₂O_2. Aqui, medimos h₂O_{2 -níveis}nos cones de crescimento de RGCs (vermelho). (B) Os embriões positivos GFP são utilizados para imagens in vivo. Na idade desejada, os embriões podem ser anestesiados e montados em pratos de fundo de vidro de 35 mm para imagens confocal. Aqui, os embriões são montados ventrally para imagem da retina. Esquema mostra desenvolvimento de retina em zebrafish. Os RGCs formam camada de células de glion (GCL), que é a camada mais interna da retina. Os axônios RGC desenvolvem-se em nervo óptico para cruzar a linha média, formando quiasmo óptico. Em seguida, os axônios RGC crescem dorsais para fazer sinapses no tectum óptico no cérebro médio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram eticamente revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais purdue (PACUC), seguindo as diretrizes do NIH com o protocolo 2006002050 aprovado em 24/07/2020.

1. Preparação de soluções

1. Mídia E2 (1x)
   1. Prepare soluções 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando todos os componentes mostrados na Tabela 1. Soluções Autoclave E2A, E2B e E2C. Armazenar a 4 °C.
   2. Para 1x E2 mídia: Combine 5 mL de 100x E2A, 1 mL de 500x E2B e 1 mL de 500x E2C. Leve o volume para 500 mL com água estéril. Ajuste o pH para 7.0-7.5.
   3. Prepare 50 mL aliquots de 1x E2 loja de mídia a -20 °C para armazenamento a longo prazo. No entanto, precipitações podem ocorrer após o descongelamento. Certifique-se de que a precipitação está totalmente dissolvida antes de usar a solução de estoque.

solução	componente	quantidade	concentração
100X E2A (500mL)
	NaCl	43,8 g	1500 mM
	Kcl	1,88 g	50 mM
	MgSO4	6 g	100 mM
	KH2PO4	1,03 g	15 mM
	Na2HPO4	0,34 g	5 mM
500X E2B (100 mL)
	CaCl2	5,5 g	500 mM
500X E2C (100 mL)
	NaHCO3	3 g	350 mM
1X E2 (500 mL)
	100X E2A	5 mL	1X
	500X E2B	1 mL	1X
	500X E2C	1 mL	1X

Tabela 1: Componentes da mídia 1x E2 para a cultura celular de zebrafish.

2. E3 Media (1x)
   1. Dissolva os componentes em 1 L de água estéril, como mostrado na Tabela 2 para fazer 100x de estoque. Diluir o estoque em água estéril para fazer 1x mídia E3.
   2. Adicione 0,2% de azul metileno. Para 20 mL de 1x mídia E3, adicione 40 μL de azul metileno.
   3. Faça outro lote sem azul de metileno para imagens fluorescentes.

componente	Quantidade (g)	Concentração em estoque de 100X (mM)
NaCl	29.22	500
Kcl	1.26	17
CaCl2 2H2O	4.85	33
Mgso4 7H2O	8.13	33

Tabela 2: Componentes da mídia 100x E3 para a manutenção de embriões de zebrafish.

3. Solução de estoque salino de 80x
   1. Combine todos os componentes mostrados na Tabela 3. Adicione água para fazer a solução de 100 mL. Misture até que todos os componentes sejam dissolvidos. Armazene a solução a 4 °C.

componente	Quantidade (g)	Concentração em estoque (mM)
glicose	1.44	80
Piruvato de Sódio	0.44	40
CaCl2 2H2O	0.148	10
HEPES	6.1	256

Tabela 3: Componentes da solução salina 80x para a mídia de cultura de células de zebrafish.

4. Meio de cultura celular de zebrafish (ZFCM+)
   1. Combine todos os componentes mostrados na Tabela 4 para fazer mídia de 250 mL. Ajuste o pH para 7,5. Filtrar a mídia usando filtro de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.

componente	Quantidade (mL)	Volume %
Meio L-15 (com vermelho fenol)	212.75	85.1
Soro bovino fetal (FBS)	5	2
Penicilina/Estreptomicina	1	0.4
Solução salina 80X	3.125	1.25
Água	28.125	11.25

Tabela 4: Componentes do meio de cultura celular zebrafish com soro e antibióticos.

5. Meio de cultura celular de zebrafish para imagem (ZFCM-)
   1. Combine todos os componentes mostrados na Tabela 5 para fazer mídia de 250 mL. Ajuste o pH para 7,5. Filtrar mídia usando filtro de 0,22 μm.
   2. Faça alíquotas de uso único (lotes de 50 mL) para evitar contaminação. Mantenha a 4 °C.

componente	Quantidade (mL)	Volume %
Meio L-15 (sem fenol vermelho)	212.75	85.1
Solução salina 80X	3.125	1.25
Água	34.125	13.65

Tabela 5: Componentes do meio de cultura celular de zebrafish sem soro e antibióticos para imagens in vitro.

6. Moldes de injeção
   1. Dissolva 1,5% na mídia E3. Despeje ~ 25 mL de agarose em uma placa de Petri de 100 x 15 mm.
   2. Deite o molde em cima da agarose com um ângulo de 45° em relação à superfície, e deixe flutuar sobre a ágarose com uma câmera lenta. Isso ajudará a evitar bolhas. Deixe a agarose esfriar e solidificar no banco de cima.
   3. Uma vez completamente solidificado, remova o molde lentamente para evitar a quebra da agarose. Adicione mídia E3 fresca, adicione filme de parafina ao redor do prato para evitar derramamentos e armazene a 4 °C (Figura 3).

Figura 3: Imagens de molde de injeção. (A) O molde plástico que é usado para fazer placas de injeção. O molde tem seis rampas, uma de 90° e outra de 45° para manter embriões no lugar. (B) A placa de injeção após a agarose solidificou e o molde é removido. Barras de escala = 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação e injeção de roGFP2-Orp1 mRNA

NOTA: a construção roGFP2-Orp1 foi obtida do Dr. Tobias Dick, DKFZ, Alemanha. Foi sub-clonado no vetor pCS2+ no Laboratório do Dr. Qing Deng, Universidade purdue. Para evitar a degradação por parte da RNase, várias precauções devem ser tomadas. Os reagentes e tubos livres de RNase devem ser usados o tempo todo, luvas devem ser usadas para todas as etapas e, alternativamente, materiais e superfícies podem ser limpos com um agente de limpeza para remoção de RNase.

1. Linearize o vetor de 3-10 μg de pCS2+/roGFP2-Orp1 com NotI.
2. Purifique o plasmídeo linearizado com um kit de limpeza PCR.
3. In vitro transcreva o roGFP2-Orp1 mRNA com um kit de transcrição in vitro de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
   1. Montagem de reação de transcrição tampada
      1. Coloque polimerase RNA e DNA linearizado/purificado no gelo. Tampão de reação Vortex 10x e 2x NTP/CAP até que estejam completamente em solução. Armazene NTP/CAP no gelo, mas mantenha o buffer à temperatura ambiente (RT) durante a montagem da reação. Gire todos os reagentes antes de abrir tubos para evitar contaminação.
      2. Configure a reação de síntese de RNA na ordem indicada abaixo no RT em um tubo de centrífuga de 0,5 mL sem RNase. O volume final da reação é de 20 μL. A configuração de reação é mostrada na Tabela 6.
      3. Adicione 10 μL de mistura de ribonucleotídeo, 2x NTP/CAP e água livre de nuclease, se necessário ao tubo. Adicione 2 μL 10X de tampão de reação. Adicione 1-1,5 μg de DNA linear (até 6 μL). Se necessário, adicione água sem nuclease para compor 20 μL de volume de reação.
      4. Feche o tubo, vórtice brevemente e microfuge touch-spin. Adicione 2 μL de 10x sp6 mistura de enzimas. Feche com um clique do dedo e toque-giro em um microfuge.
      5. Coloque em 37 °C para 2-2,5 h (pode ir até 18 h).
         NOTA: No experimento apresentado durante a noite, a incubação de 16-18 h a 37 °C foi realizada para melhores resultados.
      6. Adicione 1 μL de DNase para remover o modelo de DNA, clique no dedo, toque e incubar a 37 °C por 15 minutos.

Reagente	Volume (μL)	Quantidade em reação
2X NTP/CAP	10	1X
Tampão de reação 10X	2	1X
DNA de modelo	Até 6	1-1.5 μg
Água sem nuclease	Adicionar para fazer 20 μL
Mistura de enzima SP6 10X	2	1X

Tabela 6: Configuração de reação para roGFP2-Orp1 mRNA na transcrição in vitro.

2. Recuperação do RNA
   1. Adicione 25 μL de cloreto de lítio (LiCl) fornecido no kit de transcrição in vitro. Coloque a -20 °C em um congelador não geada por pelo menos 30 min.
   2. Gire por 25 min em velocidade máxima em uma centrífuga de mesa a 4 °C. Remova e descarte o supernatante cuidadosamente, para não perturbar a pelota. Adicione 25 μL de etanol frio de 75% e gire por 5 min a 4 °C.
   3. Retire cuidadosamente e descarte o supernaspe. Deixe o ar de pelota secar por pelo menos 5 minutos no RT. Não deixe secar. Adicione 12 μL de tampão Tris-EDTA livre de nuclease (pH 7.0) e mantenha a amostra no gelo.
   4. Meça a concentração de RNA com um espectotômetro. 0,5- 1 μg/μL é geralmente obtido.
   5. Prepare 100 ng/μL mRNA em solução vermelha fenol (0,5% vermelho fenol na solução salina tamponada de fosfato de Dulbecco -DPBS) e alíquota para uso único (3-5 μL). Armazene as alíquotas de mRNA a - 80 °C.

4. Microinjeção de mRNA
   1. No dia da injeção, use uma das alíquotas de mRNA e siga o protocolo de injeção de embriões de zebrafish para injetar 1 nL do mRNA nos embriões de estágio unicelular através de sua gema¹⁹. Uma breve descrição é fornecida abaixo.
   2. Criar peixes adultos e coletar embriões como descrito anteriormente²⁰.
   3. Puxe agulhas de microinjeção com puxador de pipeta. Corte a ponta das agulhas com fórceps para criar uma abertura de ponta de 10 μm.
   4. Alinhe embriões em um molde de injeção que foi descrito no Passo 1.6.
   5. Injete 1 nL do mRNA em vermelho fenol com uma pipeta de microinjeção de vidro.
   6. Colete embriões e mantenha-os na mídia E3.
   7. Mantenha os embriões na incubadora de 27 °C em mídia E3 até que o estágio de desenvolvimento desejado seja alcançado. Embriões injetados podem ser usados tanto para imagens in vitro (seção 3 e seção 4) quanto para imagens in vivo (seção 5). Os embriões que expressam roGFP2-Orp1 podem ser pré-selecionados antes de experimentos com um microscópio de dissecção regular equipado com luz fluorescente e um conjunto de filtro azul/verde.

3. Cultura primária de células de gânglios de retina derivadas de embriões de zebrafish

NOTA: Este protocolo é adaptado a partir de um método publicado anteriormente ²¹. Realize as etapas 3.1 e 3.2 em um capô de fluxo laminar.

1. Preparação de tampas
   1. Prepare 4-6 placas de cultura em cada experimento. Utilize tampas limpas com ácido (22 x 22 mm quadrados; 0,16-0,19 mm de espessura) que são armazenadas em 100% de etanol.
   2. Remova uma mancha de cobertura do recipiente de armazenamento usando fórceps e o flame-o para remover o etanol residual.
   3. O ar seca completamente a tampa, colocando-a em um ângulo dentro de um prato de cultura de 35 mm.
   4. Prepare a solução de trabalho Poly-D-Lysine (PDL) (1x) diluindo 10x de estoque (5 mg/mL) em água estéril.
   5. Aplique 100 μL de 0,5 mg/mL PDL no centro de cada deslizamento de cobertura e evite a disseminação da solução para as bordas.
   6. Incubar o PDL em tampas por 20-30 min em temperatura ambiente (RT). Certifique-se de que o PDL não seque.
   7. Lave o PDL com 0,5 mL de água estéril três vezes. Deixe as placas secarem completamente.
   8. Prepare a solução de trabalho de laminina (1x) diluindo 50x de estoque (1 mg/mL) em 1x PBS.
   9. Aplique 100 μL de 20 μg/mL laminin em PBS ao centro de cada deslizamento de cobertura e evite a disseminação da solução para as bordas.
   10. Incubar as placas a 37 °C em uma incubadora umidificada por 2-6 h. Evite a secagem da solução de laminina.
2. Dissecção de embriões e RGCs de revestimento
   1. Prepare e rotule quatro pratos de cultura de tecido de 35 mm e preencha com 4 mL de: 70% de etanol, "E2 media 1", "E2 media 2", "E2 media 3" no dia da dissecção. Mantenha os pratos na geladeira até dissecar.
   2. Quando os embriões de zebrafish são 34 horas após a fertilização (hpf), pegue os pratos de cultura revestidos com laminina da incubadora e lave as tampas três vezes com 0,5 mL de 1x PBS.
   3. Após a lavagem final, adicione 4 mL de mídia ZFCM(+) a cada prato de cultura e evite secar a placa.
   4. Recupere os pratos de cultura preparados do Passo 3.2.1. Deixe-os equilibrar-se com RT.
   5. Encha 4-6 tubos PCR com 15 μL de mídia ZFCM(+). Um tubo é necessário para preparar RGCs de 4 olhos para serem banhados em uma mancha de cobertura.
   6. Recupere embriões de zebrafish da incubadora e mergulhe em embriões em prato de cultura tecidual de 35 mm contendo 70% de etanol para 5-10 s para esterilizar.
   7. Usando uma pipeta de transferência, transfira embriões para o prato E2 Media 1 contendo mídia E2 estéril para lavar o excesso de etanol.
   8. Transfira embriões para o prato E2 Media 2 e remova seus acordes com fórceps afiados.
   9. Transfira embriões para o prato final E2 Media 3 para realizar dissecções.
   10. Usando um par de fórceps finos, disseca as retinas como descrito anteriormente ²².
   11. Posicione e segure os embriões anteriores à gema com um dos fórceps e remova a cauda posterior ao saco de gema com as outras fórceps.
   12. Pegue o pescoço com fórceps e tire a cabeça para expor cérebro e olhos à mídia E2. Evite cortar o saco de gema.
   13. Com a ponta de fórceps finos, revira suavemente os olhos da cabeça, enquanto segura o tecido craniano para baixo com o segundo fórceps. Mantenha os olhos isolados dos detritos de tecido adjacente.
   14. Transfira quatro olhos para um dos tubos previamente preparados contendo ZFCM(+).
   15. Titule suavemente para cima e para baixo com a pipeta P20 e uma ponta amarela cerca de 45 vezes para dissociar células. Evite bolhas de ar.
   16. Transfira o ZFCM(+) com células dissociadas para o centro da tampa. Repita as etapas 10-12 para deslizamentos adicionais.
   17. Mantenha as culturas no banco a 22 °C em um rack de espuma de poliestireno para absorver vibrações.
   18. Realize imagens 6-24 h após o revestimento.
       NOTA: Use pipeta de transferência para translocar embriões para diferentes pratos culturais. Altere a pipeta para cada solução para evitar o transporte de etanol (Etapas 6-8).

4. Imagem ROS in vitro de neurônios RGC cultivados

1. No dia da imagem (tipicamente 6-24 h após o revestimento celular), verifique as células sob microscópio para validar o crescimento de axônios RGC.
2. Para imagens de células vivas, transfira clipes de prato de cultura para uma câmara de imagem celular viva. Neste caso, uma câmara aberta personalizada, que foi descrita anteriormente, foi usada²³.
3. Configure microscópio para imagem. Use um microscópio invertido equipado com um objetivo de contraste de interferência diferencial (DIC), filtro vermelho de passagem longa OG590 e uma câmera EM-CCD.
4. Antes de imagem, substitua o meio ZFCM(+) por ZFCM(-).
5. Uma vez que as células são posicionadas com objetivo de 10x, adquira imagens a 60x de ampliação usando um alto objetivo de imersão de óleo na. Use uma ampliação adicional de 1,5x.
6. Primeiro, adquira imagens DIC. Em seguida, a imagem roGFP2-Orp1 usando um conjunto de filtro apropriado. Excite roGFP2-Orp1 com filtros de excitação 405/20 e 480/30 nm sequencialmente e adquira imagens com filtro de emissão de 535/30 nm após a luz de emissão passar pelo espelhodicrómico 505DCXR.
7. Depois de tirar o primeiro conjunto de imagens, troque mídia com mídia contendo diferentes soluções de tratamento. A mídia deve ser alterada a cada 30 minutos de imagem para evitar alterações de pH e osmolaridade.

5. Imagem in vivo ROS de embriões em desenvolvimento

1. Para imagens in vivo, mantenha embriões em mídia E3 contendo 0,003% Phenylthiourea (PTU) sem azul de metileno de 22-24 cvf. Troque mídia e remova embriões mortos diariamente.
2. Na idade desejada, anestesiam embriões em 0,016% tricaine. Monte embriões anestesiados em 1% de baixa derretimento surgiu em pratos de cultura de fundo de vidro de 35 mm. Os embriões podem ser orientados dorsalmente, ventricamente ou lateralmente, dependendo da região de interesse para a imagem.
3. Depois que agarose solidificar, encha os pratos com mídia E3 sem azul de metileno/0,016% tricaine.
4. Configure o microscópio para imagens. Use um microscópio confocal de varredura a laser invertido. Alternativamente, use um microscópio confocal vertical equipado com uma lente de imersão de água para imagem de embriões montados em cima de uma gota de agarose.
5. Excite roGFP2-Orp1 com filtros de excitação de 405 nm e 488 nm sequencialmente e adquira imagens correspondentes com filtros de emissão na faixa de 515-535 nm.
6. Adquira pilhas z com espessura de seção de 5 μm através da parte desejada dos embriões. Embriões podem ser mantidos para imagens em estágios posteriores de desenvolvimento.
7. Após a imagem, remova os embriões da ágarose com fórceps finos e mantenha-se na incubadora até a idade desejada em mídia livre de metileno com PTU.

6. Análise e processamento de imagens

1. Medição dos níveis de H₂O₂ com base nos valores de razão 405/480
   1. Use um software adequado para análise de imagens. O software ImageJ foi utilizado aqui para análise e processamento de imagens.
   2. Abra imagens dic, 405/535 e 480/535 no software ImageJ, arrastando os arquivos ou clicando em arquivo | Aberto. Se ainda não estiver pronto, converta as imagens em 32 bits clicando em imagem | Tipo | 32 bits.
   3. Defina região de interesse (ROI) com ferramenta manual livre da barra de controle (corpo celular, cone de crescimento, retina, etc.). Abra o gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI. Clique em Adicionar na guia ROI Manager para adicionar o ROI definido.
   4. Desenhe uma região próxima ao ROI e adicione como roi de fundo. Meça valores de fundo médios selecionando o ROI e clicando em Medir na guia gerenciador de ROI.
   5. Observe os valores médios de intensidade da medição. Subtraia o valor do fundo médio das imagens fluorescentes clicando em Process | | de matemática Subtrair. Execute esta etapa para imagens 405/535 e 480/535.
   6. Adicione valor de "1" a 480/535 imagem fluorescente para eliminar valores "0" clicando em Process | | de matemática Adicione função antes do cálculo da razão.
   7. Clique em process | | da calculadora de imagens Divida a função no ImageJ para dividir a imagem 405/535 por 480/535 imagem pixel por pixel. Selecione a imagem 405/535 a ser dividida por imagem 480/535. Selecione uma imagem de saída de 32 bits.
   8. Aplique ROI para imagem de proporção clicando primeiro na imagem de proporção e, em seguida, no ROI na guia gerenciador de ROI.
   9. Medir valores médios de razão de 405/535 para 480/535 imagem clicando em Medir na guia gerenciador de ROI.
   10. Faça as etapas 6.1.2-6.1.9 para o maior número possível de amostras para realizar a análise estatística adequada.
2. Imagem de proporção de exibição
   NOTA: Este procedimento é subtrair o fundo fora da amostra e aplicar uma tabela de observação de cores à imagem.
   1. Uma vez que a imagem de proporção tenha sido criada no ImageJ na etapa 6.1.7., crie uma imagem preta de 32 bits clicando em Arquivo | Nova | Imagem.
   2. Aplique o ROI que você gostaria de exibir_{os níveis}H 2 O₂ para a nova imagem clicando primeiro na nova imagem e, em seguida, no ROI da guia gerenciador de ROI.
   3. Crie uma máscara clicando em Editar | | de seleção Criar máscara.
   4. Divida a imagem da máscara por 255 para ajustar o valor do ROI para "1" e os valores de fundo serão "0". Clique em process | | de matemática Divida e digite 255.
   5. Multiplique a máscara com a imagem de proporção clicando em Process | | da calculadora de imagens Multiplique a função. Isso resultará em uma imagem de proporção em escala cinza mostrando apenas o ROI.
   6. Altere a tabela de procura para "Fogo" clicando em Imagem | Procure tabelas | Fogo.
      NOTA: Um fator de multiplicação pode ser aplicado a todas as imagens para melhor visualização da razão clicando em Processo | | de imagem Multiplique.
   7. Converta a imagem de proporção para 8 bits clicando em | de imagem Tipo | 8 bits.
   8. Adicione a barra de calibração clicando em Analisar | Ferramentas | Barra de Calibração.

Resultados

RGCs de zebrafish cultivados estendem axônios dentro de 1d. Uma imagem representativa da razão 405/480 do biosensor H₂O₂é mostrada na Figura 4A. O corpo celular, o axônio e os cones de crescimento são claramente visíveis em neurônios individuais. Esses neurônios podem ser submetidos a diferentes tratamentos ao longo do tempo para monitorar as alterações de H₂O_2. Descobrimos anteriormente que adicionar 100 μM H₂O₂ à mídia de cu...

Discussão

Existem várias etapas críticas que precisam de atenção ao longo deste protocolo. Acreditamos que considerando esses pontos melhorará o fluxo experimental. Para a cultura primária do RGC, a esterilidade do ZFCM(-) é muito importante, uma vez que esta mídia cultural não contém antibióticos e a contaminação pode ocorrer antes ou durante a imagem. Para evitá-lo, aconselhamos preparar e usar ZFCM(-) somente dentro de um gabinete de biossegurança e fazer novas mídias ZFCM(-) regularmente (Passo 1.5). Além disso, as ações de la...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Prato de cultura de 35 mm	Sarstedt	83-3900
Prato de fundo de vidro de 35 mm	MatTek	P35G-1.5-10-C
Agarose	Fisher Scientific	BP160-500
Tubos capilares de vidro de borossilicato	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
Cloreto de cálcio di-hidratado	Fisher Scientific	C79-500
Vidro de cobertura	Corning	2850-22
Placas de Petri descartáveis (100 x 15 mm)	VWR	25384-094
Soro bovino fetal	ThermoFisher Scientific	26140087
glicose	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Molde de injeção	Ferramentas científicas adaptáveis	TU-1
Microscópio Invertido	Nikon	TE2000
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017-015
Microscopia Confocal de Varredura a Laser	Zeiss	710
Leibovitz's L-15 Medium com fenol vermelho	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium sem fenol vermelho	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027 Kit de Transcrição Scientific 21-083-027
Agarose de baixo derretimento	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
Penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122
Fenol Vermelho	Sigma Aldich	P0290
Feniltioureia (PTU)	Sigma Aldich	P7629
PicoPump Pneumático	World Precision Instruments	PV820
Poli-D-Lisina (PDL)	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR Kit de Purificação	QIAGEN	28104
Mouse recombinante slit2	R& D Systems	5444-SL-050
Piruvato de Sódio	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µ m filtro	Millipore	S2GPT05RE
TE Buffer	Ambion	AM9860
Tricaine Methanesulfonate	Sigma Aldich	E10521
Extrator de pipeta vertical	David Kopf Instruments	700C