Artigo de método

Dois ensaios de infecção para estudar fenótipos de virulência não letais em C. albicans usando C. elegans

DOI:

10.3791/62170

⸱

17 de maio de 2021

 ,  , 
1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patógenos oportunistas fúngicos podem causar infecções com risco de vida, bem como infecções menores, mas fenótipos não letais são frequentemente ignorados ao estudar a virulência. Portanto, desenvolvemos um modelo de nematóide que monitora os aspectos de sobrevivência e reprodução do hospedeiro para investigar a virulência fúngica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora os patógenos possam ser mortais para os seres humanos, muitos deles causam uma variedade de tipos de infecção com fenótipos não letais. Candida albicans, um patógeno fúngico oportunista de humanos, é a quarta causa mais comum de infecções nosocomiais, resultando em ~ 40% de mortalidade. No entanto, outras infecções por C. albicans são menos graves e raramente letais e incluem candidíase vulvovaginal, afetando ~ 75% das mulheres, bem como candidíase orofaríngea, afetando predominantemente bebês, pacientes com AIDS e pacientes com câncer. Embora os modelos murinos sejam usados com mais frequência para estudar a patogênese de C. albicans , esses modelos avaliam predominantemente a sobrevivência do hospedeiro e são caros, demorados e limitados na replicação. Portanto, vários sistemas de mini-modelo, incluindo Drosophila melanogaster, Danio rerio, Galleria mellonella e Caenorhabditis elegans, foram desenvolvidos para estudar C. albicans. Esses minimodelos são adequados para a triagem de bibliotecas mutantes ou diversos antecedentes genéticos de C. albicans. Aqui descrevemos duas abordagens para estudar a infecção por C. albicans usando C. elegans. O primeiro é um ensaio de fecundidade que mede a reprodução do hospedeiro e monitora a sobrevivência de hospedeiros individuais. O segundo é um ensaio de expansão de linhagem que mede como a infecção por C. albicans afeta o crescimento da população hospedeira ao longo de várias gerações. Juntos, esses ensaios fornecem uma maneira simples e econômica de avaliar rapidamente a virulência de C. albicans .

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans é um patógeno fúngico oportunista de humanos que reside em diferentes nichos, incluindo a cavidade oral, tratos gastrointestinal e urogenital1. Embora tipicamente comensal, C. albicans causa infecções da mucosa e da corrente sanguínea, a última das quais pode ser mortal. A gravidade da infecção por C. albicans depende da função imunológica do hospedeiro, sendo os indivíduos imunocomprometidos mais suscetíveis à infecção do que os indivíduos saudáveis1. Além dos fatores relacionados ao hospedeiro, C. albicans tem várias características de virulência que incluem hifas, formação de biofilme e produção de aspartil proteinases secretoras (SAPs), que funcionam para promover a adesão e invasão de C. albicans nas células epiteliais do hospedeiro2, e candidalisina, uma toxina peptídica citolítica 3,4. Juntos, isso sugere que a virulência de C. albicans é um fenótipo complexo resultante de uma interação entre o patógeno e seu ambiente hospedeiro. Portanto, a investigação da virulência é melhor estudada usando organismos modelo que servem como ambientes hospedeiros, em contraste com as abordagens in vitro.

Vários modelos de hospedeiros, incluindo organismos vertebrados e invertebrados, foram desenvolvidos para estudar a infecção por C. albicans. O modelo murino, considerado o padrão-ouro, é frequentemente usado por seu sistema imunológico adaptativo e inato e capacidade de monitorar a progressão da doença tanto sistemicamente quanto em órgãos específicos5. No entanto, existem limitações significativas para este modelo de hospedeiro, incluindo custos de manutenção, pequeno número de descendentes e diminuição do poder e reprodutibilidade associados a pequenos tamanhos de amostra5. Portanto, outros organismos modelo mais simples, como peixe-zebra (Danio rerio), mosca da fruta (Drosophila melanogaster), mariposa-da-cera (Galleria mellonella) e nematóide (Caenorhabditis elegans) foram desenvolvidos. Esses organismos modelo não mamíferos são menores, requerem menos manutenção laboratorial e tamanhos de amostra maiores permitem maior poder e reprodutibilidade em comparação com modelos murinos. Cada um desses modelos tem vantagens e desvantagens específicas que precisam ser consideradas ao escolher um modelo de infecção. G. mellonella oferece o ambiente fisiologicamente mais semelhante ao dos humanos, pois pode ser cultivado a 37 ° C e possui várias células fagocíticas7. Além disso, esse modelo permite a injeção direta de um inóculo específico7. No entanto, não existe um genoma totalmente sequenciado e nenhum método estabelecido de criação de cepas mutantes. Semelhante ao G. mellonella, o modelo de D. rerio permite a injeção direta de um inóculo específico 5,7. Ele também possui sistema imunológico adaptativo e inato5, que é exclusivo desse modelo não mamífero, mas requer tanques de reprodução aquáticos para manter. D. melanogaster e C. elegans têm vantagens e desvantagens semelhantes, que incluem genomas totalmente sequenciados que são fáceis de manipular e gerar cepas mutantes7, mas não possuem imunidade adaptativa ou citocinas7. De todos esses modelos não mamíferos, C. elegans tem o ciclo de vida mais rápido, autofertiliza-se para gerar um grande número de descendentes geneticamente idênticos e é o mais receptivo a telas em larga escala 6,7,8. C. elegans tem sido extremamente poderoso para triagem de alto rendimento de drogas antifúngicas 9,10, caracterizando fatores de virulência7 e identificando redes de defesa do hospedeiro específicas de C. albicans 11. O sistema imunológico inato em C. elegans tem múltiplos componentes que são altamente conservados com os seres humanos12. As defesas inatas do hospedeiro incluem a produção de peptídeos antimicrobianos13 (AMPs) e espécies reativas de oxigênio 14,15,16.

A gravidade da infecção por C. albicans é predominantemente medida pela sobrevivência do hospedeiro, mas não pode capturar fenótipos de virulência não letais. Um aspecto frequentemente negligenciado da aptidão do hospedeiro é a reprodução, mas vários estudos sugerem que C. albicans afeta a reprodução reduzindo a viabilidade do esperma17,18, sugerindo que este pode ser um aspecto importante da aptidão do hospedeiro para estudar. Portanto, o impacto da infecção por C. albicans na fecundidade do hospedeiro é uma maneira útil de estudar fenótipos de virulência não letais. Desenvolvemos dois ensaios de infecção usando C. elegans para investigar os fenótipos de sobrevivência e reprodução em hospedeiros saudáveis19,20. Aqui descrevemos os ensaios de fecundidade e expansão de linhagem. A fecundidade mede tanto a progênie produzida quanto a sobrevivência de hospedeiros únicos, e a expansão da linhagem avalia as consequências da infecção ao longo de três gerações de hospedeiros. Demonstramos como esses ensaios podem ser utilizados para rastrear mutantes de deleção de C. albicans para capturar diferenças dramáticas e sutis nos fenótipos de virulência letais e não letais.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Etapas preparatórias para os experimentos

  1. Preparação de culturas de C. albicans e Escherichia coli
    NOTA: As cepas utilizadas neste estudo estão listadas na Tabela 1.
    1. Manter as cepas de C. albicans e E. coli como estoques de glicerol a -80 °C.
    2. Usando um palito de dente estéril, estique C . albicans desejado em dextrose peptona de levedura sólida (YPD) (1% de extrato de levedura, 2% de bactopeptona, 2% de glicose, 1,5% de ágar, 0,004% de adenina, 0,008% de uridina) e cresça durante a noite a 30 ° C.
      NOTA: Se a cepa de C. albicans for auxotrófica, complemente o meio com os aminoácidos necessários.
    3. Usando uma alça estéril ou palito de dente, inocule uma única colônia de C. albicans em 2 mL de YPD líquido. Incubar a 30 °C com agitação durante 24 h.
    4. Usando um palito de dente estéril, coloque E. coli (OP50) em placas de ágar Luria Broth (LB; 10 g / L de triptona, 5 g / L de extrato de levedura, 10 g / L de NaCl, 15 g / L de ágar). Incubar durante a noite a 30 °C.
    5. Inocular uma única colónia OP50 em 50 ml de LB. Incubar a 30 °C agitando durante a noite.
  2. Preparação de meios de crescimento de nematóides
    1. Em um frasco de 2 L, adicione 29 g de pó de meio de crescimento de nematóides (NGM; 17,5 g / L de ágar, 3,0 g / L de cloreto de sódio, 2,5 g / L de peptona, 0,005 g / L de colesterol) a 1L de água e misture com uma barra de agitação.
    2. Para inibir o crescimento excessivo de E. coli e permitir a proliferação de C. albicans, suplemente o NGM com 0,2 g/L de sulfato de estreptomicina após autoclavagem.
      NOTA: Se estiver usando NGM para manutenção de nematóides, a estreptomicina não é necessária.
  3. Manutenção de populações de nematóides
    1. Espalhe 300 μL de cultura de E. coli durante a noite em placas de ágar NGM preparadas usando um espalhador de metal. Essa técnica será chamada de semeadura.
    2. Deixe as placas secarem à temperatura ambiente (RT). Cultive as placas durante a noite a 30 °C.
    3. Mantenha a população de nematóides fragmentando-os a cada 3-4 dias em uma placa NGM recém-semeada com E. coli. Conservar a 20 °C. Chunking é uma técnica usada para transferir rapidamente uma população aleatória de nematóides para uma placa recém-semeada, o que permite a proliferação de populações. Para fazer isso, use uma espátula estéril para cortar um pequeno quadrado (1 x 1 polegada) da placa de ágar NGM. Transfira cuidadosamente o quadrado para uma nova placa NGM semeada com o lado com os nematóides voltados para baixo no novo ágar8.
      NOTA: C. elegans mantido a 20 ° C produzirá descendentes ~ 48 h depois, o que é útil considerar ao sincronizar uma população de nematóides. C. elegans mantidos a 25 °C se desenvolverão e se reproduzirão mais rapidamente e as populações mantidas a 15 °C terão crescimento mais lento.
  4. Sincronização da população de nematóides
    1. Comece com uma população de nematóides existente mantida em NGM / OP50.
    2. Pipetar ~3 ml de tampão M9 para a placa NGM que contém nemátodos. Lave os ovos dos nematóides do prato e use suavemente a ponta da pipeta para raspar os ovos do ágar (eles tendem a grudar). Usando uma pipeta P1000, transfira o líquido contendo ovos e vermes para um tubo cônico de 15 mL. Para avaliar o número de ovos ainda na placa, use um microscópio de dissecação para observar o ágar.
    3. Centrifugue cônico por 2 min a 279 x g e RT.
    4. Remova o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o pellet do nematóide.
    5. Adicione 3 mL de solução de alvejante a 25% ("CUIDADO" ao manusear).
    6. Inverta o tubo por 2 minutos. Verifique se os nematóides estão mortos usando o microscópio de dissecação - eles ficarão retos e imóveis.
      NOTA: Isso só matará os nematóides existentes. A integridade dos ovos não será afetada.
    7. Centrifugue por 2 min a 279 x g e RT.
    8. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 3 mL M9.
    9. Centrifugue por 2 min a 279 x g e RT.
    10. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 300 μL de M9.
    11. Usando um microscópio de dissecação, verifique a concentração de ovos pipetando 5 μL de ovos em uma pequena placa de Petri. A concentração ideal deve ser entre 20-100 ovos. Se a cultura estiver muito diluída, concentrar a solução por centrifugação e remoção do excesso de líquido. Se a cultura estiver muito concentrada, adicione mais M9 até atingir a concentração desejada.
  5. Prepare culturas de C. albicans e E. coli para infecção por nematóides (semeadura).
    1. Prepare uma solução em branco. Em uma cubeta, combine 900 μL de ddH2O e 100 μL de YPD líquido.
    2. Insira a cubeta no espectrofotômetro. Defina o comprimento de onda para 600 nanômetros usando a seta para cima. Clique no botão "0 ABS 100% T" para definir a solução em branco.
    3. Em uma nova cubeta, combine 900 μL de ddH2O e 100 μL de cultura de levedura durante a noite. Retirar a solução em branco do espectrofotómetro e adicionar a cubeta que contém a solução de levedura. Registre a densidade óptica mostrada na tela (não pressione nenhum botão). Multiplique a leitura por 10 (a solução de levedura medida foi uma diluição de 1 em 10).
    4. Normalize a cultura para 3,0 OD600 / mL com ddH2O em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. 1 OD600 é aproximadamente 3 x 10-7 UFC/mL21.
      NOTA: Se a leitura do OD600 for 6.7, 3 OD / 6.7 OD = 0.447 mL, adicione 447 μL de cultura de C. albicans ao tubo da microcentrífuga. Centrifugue na velocidade máxima (16, 873 x g) por 30 s. Remover o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de ddH2O.
    5. Transfira a cultura de E. coli durante a noite para um tubo cônico de 50 mL.
    6. Centrifugar a cultura a 279 x g durante 2 min à RT.
    7. Aspire a maior parte do sobrenadante, deixando ~ 1 mL.
    8. Ressuspenda o pellet no sobrenadante restante e transfira para um tubo de microcentrífuga pré-pesado de 1,5 mL.
    9. Gire o tubo da microcentrífuga na velocidade máxima por 30 s.
    10. Usando uma pipeta p1000, remova o sobrenadante e pese o pellet final.
    11. Diluir E. coli a 200 mg/ml em ddH2O.
    12. Use cálculos de master mix (Tabela 2) e dimensione adequadamente.

2. Ensaio de fecundidade

NOTA: Os dados representativos são mostrados na Tabela Suplementar 1 e um esquema é mostrado na Figura 1A.

  1. Obter ou preparar o seguinte: placas de Petri de 35 mm x 10 mm, NGM suplementado com sulfato de estreptomicina 0,2 g/L, cultura de E. coli OP50, LB, cultura de C. albicans , YPD, Wire Pick, tampão M9 (3,0 g/L KH2PO4, 6,0 g/L Na2HPO4, 0,5 g/L NaCl, 1,0 g/L NH4Cl), Tubos cônicos de 15 mL.
    Dois dias antes do experimento
  2. Inocular cepas de C. albicans em 2 mL de YPD e E. coli (OP50) em 50 mL de LB e crescer durante a noite a 30 ° C.
  3. Prepare placas de Petri de 35 mm x 10 mm com NGM suplementado com sulfato de estreptomicina 0,2 g / L. O número de placas preparadas deve durar todo o experimento. O número recomendado de réplicas é de 10 por tratamento. Para 10 repetições, serão utilizadas 70 placas. 1 L de NGM fará ~ 250 placas.
    Um dia antes do experimento
  4. Semeie placas de ágar NGM de 35 mm x 10 mm suplementadas com estreptomicina para o Dia 0, Dia 2 e Dia 3 de acordo com o protocolo de semeadura descrito acima com a concentração de mastermix (Tabela 2). Pipete a quantidade apropriada de mastermix no centro da placa. Espalhar a cultura não é necessário porque um único ponto de crescimento microbiano é suficiente para a alimentação do hospedeiro e nos permite identificar facilmente os hospedeiros fora da semente. Incube as placas durante a noite em RT.
    NOTA: O mastermix do Dia 0 contém 50 μL de "semente" por repetição para cada tratamento experimental. Os dias 2 a 7 incluem 10 μL de "semente" por repetição para cada tratamento experimental. Não há placa do Dia 1 porque os nematóides atingirão o estágio L4 48 h após serem sincronizados em uma placa do Dia 0. Assim que atingirem L4, os nematóides individuais serão transferidos para as placas do Dia 2.
Para 1 réplicaCondição de controle de E. coli (OP50)Condição de tratamento de C. albicans e E. coli (OP50)
OP50H2OTotalOP50C. albicansH2OTotal
Dia 06,25 ul43.75 ul50 ul6,25 ul1,25 ul42,5 ul50 ul
Dias 2-71,25 ul8,75 ul10 ul1,25 ul.25 ul8,5 ul10 ul

Tabela 2: Volumes Mastermix de culturas de E. coli e C. albicans necessários para infectar nematóides para o ensaio de fecundidade.

Dia do Experimento (Dia 0)

  1. Sincronize os nematóides e coloque ~ 50 ovos em cada réplica do Dia 0 das placas de controle (somente OP50) e placas de tratamento (C. albicans + OP50). Incubar a 20 °C durante 48 h.
    Dia 2
  2. Transfira um único nematóide L4 escolhendo8 da placa do Dia 0 para cada uma das placas replicadas do Dia 2. Os hospedeiros L4 podem ser identificados por uma pequena bolsa no meio do lado dorsal do corpo22. Transfira os nematóides eclodidos e amadurecidos do mesmo tipo de placa semeada (ou seja, os nematóides L4 das placas de controle D0 devem ser transferidos para as placas de controle do Dia 2).
  3. Inocular culturas de C. albicans necessárias em 2 mL de YPD e E. coli (cepa OP50) em 50 mL de LB.
    Dia 3
  4. Transfira nematóides das placas do Dia 2 para as placas semeadas do Dia 3, mantendo o controle de cada réplica (ou seja, a Réplica A do Dia 2 deve ser movida para a placa Replicar A do Dia 3).
  5. Incubar as placas do Dia 2 (contendo apenas ovos) e do Dia 3 (contendo o único adulto) a 20 °C durante 24 h.
  6. Semente de 35 mm x 10 mm NGM suplementada com placas de estreptomicina para os dias 4 e 5 usando 10 μL de mastermix por placa (Tabela 2) e incubar placas em RT por 24 h.
    Dia 4
  7. Transfira os nematóides das placas do Dia 3 para as placas semeadas do Dia 4.
  8. Incubar as placas do Dia 3 e do Dia 4 a 20 °C durante 24 h.
  9. Usando um escopo de dissecação, conte a progênie viável para cada placa do Dia 2. Observe todas as réplicas que morreram ou não estão mais na placa (censuradas). Assim que o número de descendentes for registrado, descarte as placas do Dia 2.
    NOTA: Censurado refere-se a nematóides que desaparecem na placa. Isso pode ocorrer quando os nematóides rastejam para fora da placa. Embora menos comum durante a janela de 24 horas, as carcaças de nematóides mortos se desintegram no ágar, resultando também em censura. Os dados censurados não são incluídos na progênie final e na análise dos dados de sobrevivência.
  10. Inocular novas culturas de cepas de C. albicans em 2 mL de YPD e E. coli (OP50) em 50 mL de LB.
    Dia 5
  11. Transfira os nematóides das placas do Dia 4 para as placas semeadas do Dia 5.
  12. Incubar as placas do Dia 4 e do Dia 5 a 20 °C durante 24 h.
  13. Conte a progênie viável para cada placa do Dia 3. Observe todas as réplicas que morreram ou não estão mais na placa (censuradas). Assim que o número de descendentes for registrado, descarte as placas do Dia 3.
  14. Semeadura de 35 mm x 10 mm NGM suplementada com placas de estreptomicina para os dias 6 e 7 usando 10 μL de mastermix por placa (Tabela 2) e incubar placas em temperatura ambiente por 24 h.
    Dia 6
  15. Transfira os nematóides das placas do Dia 5 para as placas semeadas do Dia 6.
  16. Incubar as placas do Dia 5 e do Dia 6 a 20 °C durante 24 h.
  17. Conte a progênie viável para cada placa do Dia 4. Observe todas as réplicas que morreram ou não estão mais na placa (censuradas). Assim que o número de descendentes for registrado, descarte as placas do Dia 4.
    Dia 7
  18. Transfira os nematóides das placas do Dia 6 para as placas semeadas do Dia 7.
  19. Incubar as placas do Dia 6 e do Dia 7 a 20 °C durante 24 h.
  20. Conte a progênie viável para cada placa do Dia 5. Observe todas as réplicas que morreram ou não estão mais na placa (censuradas). Assim que o número de descendentes for registrado, descarte as placas do Dia 5.
    Dia 8
  21. Conte a progênie viável para cada placa do Dia 6. Observe todas as réplicas que morreram ou não estão mais na placa (censuradas). Assim que o número de descendentes for registrado, descarte as placas do Dia 6.
    Dia 9
  22. Conte a progênie viável para cada prato do Dia 7. Não conte o maior nematóide (pai). Observe todas as réplicas que morreram ou não estão mais na placa (censuradas). Assim que o número de descendentes for registrado, descarte as placas do dia 7.
    NOTA: Este ensaio também pode ser usado para avaliar a sobrevida. Registre quando cada nematóide morreu. Ao final do experimento, a porcentagem de nematóides que sobreviveram ao longo do experimento de sete dias pode ser comparada para cada tratamento. Os nematóides às vezes rastejam para longe da fonte de alimento / patógeno e tentam escalar os slides da placa de Petri. Verifique todas as áreas da placa antes de prosseguir. Os nematóides mortos geralmente deixam para trás uma carcaça. Censure qualquer nematóide que não possa ser localizado e não conte esse nematóide como morto. Não inclua dados censurados na análise final da progênie e sobrevivência.
  23. Analise os dados para o tamanho da ninhada e reprodução tardia usando ANOVA unidirecional ou Kruskal-Wallis, dependendo da normalidade dos conjuntos de dados, bem como testes múltiplos post-hoc de Tukey/Dunn para identificar diferenças significativas entre os grupos de tratamento usando o software GraphPad Prism. Detecte diferenças entre as curvas de sobrevida usando o teste de log-rank de Wilcoxon.

3. Ensaio de Expansão de Linhagem

NOTA: Os dados representativos são mostrados na Tabela Suplementar 2 e um esquema é mostrado na Figura 2A.

  1. Obtenha ou prepare o seguinte: placas de Petri de 100 mm x 15 mm contendo ágar NGM suplementado com sulfato de estreptomicina de 0,2 g / L, culturas de E. coli OP50, culturas LB, C. albicans , YPD, tampão M9, Wire Pick, tubos cônicos de 15 mL.
    Dia -2
  2. Inocular cepas de C. albicans em 2 mL de YPD e E. coli (OP50) em 50 mL de LB e crescer durante a noite a 30 ° C.
    Dia -1
  3. Sementes de placas de ágar NGM de 100 mm x 15 mm suplementadas com estreptomicina com 300 μL de mastermix por placa (Tabela 3). Espalhe o mastermix na placa usando um espalhador de metal estéril. Incubar as placas durante a noite a 30 °C. Recomenda-se seis repetições por tratamento. Assim, prepare sete placas (uma placa para nematóides sincronizados, seis placas para cada nematóide adulto) por tratamento.
Condição de controle de E. coli (OP50)C. albicans e E. coli (OP50). Condição de tratamento
Para 1 réplicaOP50H2OTotalOP50C. albicansH2OTotal
1,25 ul8,75 ul10 ul37,5 ul7,5 ul255 ul300 ul

Tabela 3: Volumes mastermix de culturas de E. coli e C. albicans necessários para infectar nematóides para o ensaio de expansão da linhagem.

Crescimento da população de nematóides: Dia 0

  1. Sincronizar os nemátodes e colocar 10-25 ovos numa única placa para cada controlo (apenas OP50) e tratamento (C. albicans + OP50) e incubar a 20 °C durante 48 h.
    Dia 2:
  2. Transfira um único verme L4 de cada placa do Dia 0 de controle e tratamento para placas semeadas do mesmo tratamento. Os hospedeiros L4 podem ser identificados por uma pequena bolsa no meio do lado dorsal do corpo22.
  3. Incubar a 20 °C durante 5 dias (um total de uma semana após a sincronização).
    Dia 7:
  4. Usando uma pipeta p1000, lave toda a população de nematóides de cada placa usando 5 mL de tampão M9 e transfira para um tubo cônico de 15 mL.
  5. Conservar a 4 °C durante 1 h para permitir que os nemátodos assentem para facilitar a contagem.
  6. Diluir cada cônico até o volume final de 10 mL com tampão M9.
  7. Para cada réplica biológica, contar o número de nemátodos numa alíquota de 20 μl. Repita isso para obter 6 réplicas técnicas para cada réplica biológica. Voltar a calcular para determinar o tamanho total da população. Se as amostras estiverem muito diluídas (ou seja, menos de 10 nematóides por amostra), concentre a população em um volume menor de tampão M9.
    NOTA: A centrifugação de nematóides vivos não prejudicará os nematóides.
    Exemplo de cálculo:
    70 Hosts = X (Total de hosts)
    20 μL (alíquota) 10.000 μL (Volume Total)
  8. Analise os dados para expansão de linhagem usando ANOVA unidirecional ou Kruskal-Wallis, dependendo da normalidade dos conjuntos de dados, bem como testes múltiplos post-hoc de Tukey/Dunn para identificar diferenças significativas entre os grupos de tratamento usando o software GraphPad Prism.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos dois ensaios que medem a virulência de C. albicans como um fenótipo não letal usando C. elegans como modelo de infecção. O primeiro ensaio, fecundidade, monitora como a infecção por C. albicans afeta hospedeiros únicos para produção e sobrevivência de progênies. O segundo ensaio, expansão da linhagem, mede como a infecção por C. albicans afeta o crescimento populacional ao longo de várias gerações.

...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos dois ensaios simples que medem a virulência fúngica. Ambos os ensaios utilizam C. elegans como um sistema hospedeiro que inclui monitoramento de fenótipos de hospedeiros letais e não letais. Por exemplo, os ensaios de fecundidade investigam o sucesso reprodutivo de hospedeiros infectados individuais, ao mesmo tempo em que medem a sobrevivência individual. O monitoramento diário fornece não apenas o tamanho total da ninhada, mas também o tempo reprodutivo e a h...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Dorian Feistel, Rema Elmostafa e McKenna Penley por sua assistência no desenvolvimento de nossos ensaios e coleta de dados. Esta pesquisa é apoiada pela NSF DEB-1943415 (MAH).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microtubos eppendorf de 1,5 mL 3810XMillipore SigmaZ606340
placas de Petri de 100 mm x 15 mmSigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon ConicalsFisher Scientific14-432-22
AdeninaMillipore SigmaA8626
Ágar (granulado, grau bacterilógico)Apex BioResearch Produz20-248
Fio de Alumínio (95% Pt, 32 Gauge)Genesee Scientific59-1M32P
Cloreto de AmônioMillipore Sigma254134
Espalhador de Células BacterianasSP Scienceware21TP50
BactoPeptoneFisher BioReagantsBP1420-500
Tubos de cultura descartáveis (20 x 150 mm)FIsherBrand14-961-33
(Iluminador de alta intensidade NI-150)Nikon Instrument Inc.
E. coliCaenorhabditis Genetics CenterOP50
GlucoseMillipore Sigma50-99-7
Placas de Petri Médias (35 X 10 mm)Falcon353001
Metal EspátulaSP Scienceware8TL24
Mídia de Crescimento de Nematóides (NGM)Dot ScientificDSN81800-500
Potássio Fosfato monobásicoSigmaP0662-500G
Cloreto de SódioFisher ScientificBP358-1
Fosfato de SódioFisher ScientificBP332-500
Sulfato de EstreptomicinaThermo-Fisher Scientific11860038
TriptonaMillipore Sigma91079-40-2
UridinaMillipore SigmaU3750
Wildtype C. elegansCaenorhabditis Centro GenéticoN2
Extrato de LeveduraMillipore Sigma8013-01-2
Microscópio de dissecação

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Candida albicansEnsaio de FecundidadeExpans o de LinhagemReprodu o do HospedeiroCrescimento PopulacionalSistemas de Mini Modelo
Vídeo em breve

Artigos relacionados