Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Summary

Este artigo introduz passos essenciais de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina. Esses protocolos são comumente usados para estudar processos celulares relacionados ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA.

Abstract

As células são continuamente expostas a vários agentes prejudiciais ao DNA, induzindo diferentes respostas celulares. A aplicação de abordagens bioquímicas e genéticas é essencial para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Nos últimos anos, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local. Além disso, novas técnicas seminais nos permitem estudar esses processos no nível de resolução unicelular usando células fixas e vivas. Embora essas técnicas tenham sido utilizadas para estudar vários processos biológicos, aqui apresentamos os protocolos mais amplamente utilizados no campo da reparação de DNA, Fluorescence Imunostaining (IF) e Chromatin Imunoprecipitation (ChIP), que em combinação com danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease possibilitam visualizar e quantificar a ocupação genômica de fatores de reparação de DNA de forma direcionada e regulamentada, respectivamente. Essas técnicas fornecem ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para sua regulação de ajuste fino durante a reparação do DNA.

Introduction

Nosso genoma está constantemente sendo desafiado por vários agentes prejudiciais ao DNA. Esses ataques podem derivar de fontes ambientais, como luz UV ou irradiação, bem como de fontes endógenas, como subprodutos metabólicos causados por estresse oxidativo ou erros de replicação^1,2. Essas lesões podem afetar a integridade de um ou ambos os fios de DNA, e se os erros gerados se tornarem persistentes, muitas vezes levam a translocações e instabilidade do genoma, o que pode resultar em tumorigênese^3,4. Para manter a integridade do genoma, vários sistemas ....

Protocol

1. Imunodeseção de proteínas específicas

1. Preparação da cultura celular e configuração experimental
   1. Manter células U2OS em monocamadas em cultura DMEM meio suplementado com soro de bezerro fetal de 10%, 2 mM de glutamina e 1% solução antibiótico-antimicomolética.
      NOTA: Para indução de dano de DNA à base de endonuclease, use meio tratado com carvão ou sem esteroides para evitar vazamentos no sistema.
   2. Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de CO₂ a 37 °C até 80% de confluência, renovando o meio a cada 2-3 dias.
   3. Aspire o meio e lave as células com 1x PBS. Desapegar células com solução Tryp....

Results

Estudar processos de reparo induzidos pelo DSB direcionados ao local nas células pode ser alcançado através de transfecção estável ou transitória. No entanto, deve-se notar que a transfecção estável garante uma população celular homogênea, o que dá uma resposta celular unificada e, portanto, mais confiável. No caso da transfecção transitória, apenas uma pequena proporção da população celular ocupa e mantém o plasmídeo, o que introduz a diversidade no experimento. Estabelecer sistemas celulares baseados em endonuclease ER.......

Discussion

Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está se expandindo rapidamente com a ajuda de vários métodos bioquímicos e microscópicos. Preservar informações genéticas é crucial para as células, uma vez que mutações que ocorrem em genes envolvidos em processos de reparação estão entre as principais causas da tumorigênese e, portanto, elucidar os passos-chave das vias de reparação do DNA é essencial.

Técnicas bioquímicas (ou seja, mancha ocidental.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
Agarose	Lonza	50004
Solução Antibiótica-Antimicótica (100&vezes;), Estabilizado	Sigma Aldrich	A5955
Anti-gama H2A. Anticorpo X (fosfo S139)	Abcam	ab26350
Soro bovino Fração V albumina	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ Tampão de Carregamento Ciano/Amarelo	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM com 1.0 g/L de Glicose, sem L-Glutamina	Lonza	12-707F
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 Ovelha Anti-Rato IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 Ovino Anti-Coelho IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
Etanol	Molar Chemicals	02910-101-340
Soro Fetal Bovino (Origem da América do Sul), aprovado pela UE	Gibco	ECS0180L
Solução de formaldeído a 37% livre de ácido	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ Suplemento	Thermo Fisher Scientific	35050038
Glicina	Sigma Aldrich	50046
IPure kit v2	Diagenode	C03010015
Álcool isoamílico	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
Neocarzinostatin de Streptomyces carzinostaticus	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS Pó sem Ca2+, Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
Fenol	Sigma Aldrich	P4557
TUBOS	Sigma Aldrich	P1851
Polissorbato 20 (Tween 20)	Molar Chemicals	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
Prolong™ Mountant Antifade do ouro com DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36935
Conjunto de Cocktail Inibidor de Protease I	Roche	11873580001
Proteinase K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs anticorpo	Abcam	ab18192
RNase A	Roche	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris acetato-EDTA tampão	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	Molar Chemicals	09370-006-340
Tripsina do pâncreas suíno	Sigma Aldrich	T4799
Tripsina-EDTA (0,5%), sem vermelho de fenol	Gibco	15400054