Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para adaptar o método CLARITY dos tecidos cerebrais para retinas de montagem inteira para melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens de alta resolução de neurônios retinais e suas estruturas subcelulares.

Resumo

O método de delipidação de hidrogel de tecido (CLARITY), originalmente desenvolvido pelo laboratório Deisseroth, foi modificado e amplamente utilizado para imunossuagem e imagem de amostras cerebrais espessas. No entanto, esta tecnologia avançada ainda não foi usada para retinas de montagem inteira. Embora a retina seja parcialmente transparente, sua espessura de aproximadamente 200 μm (em camundongos) ainda limita a penetração de anticorpos no tecido profundo, bem como reduz a penetração de luz para imagens de alta resolução. Aqui, adaptamos o método CLARITY para retinas de camundongos de montagem inteira polimerizando-as com um monômero de acrilamida para formar um hidrogel nanoporoso e, em seguida, limpá-los em sulfato de dodecilo de sódio para minimizar a perda de proteína e evitar danos teciduais. As retinas processadas pela CLARIDADE foram imunossuídas com anticorpos para neurônios da retina, células gliais e proteínas sinápticas, montadas em uma solução de correspondência de índices refrativos e imagens. Nossos dados demonstram que a CLARITY pode melhorar a qualidade da coloração imunohistoquímica padrão e imagens para neurônios da retina e células gliais em preparação de todo o suporte. Por exemplo, a resolução 3D de estruturas axônicas finas e dendríticas de células amacrinas dopaminérgicas foram muito melhoradas pela CLARITY. Em comparação com retinas de montagem integral não processadas, a CLARITY pode revelar imunossuagem para proteínas sinápticas, como a proteína de densidade pós-sináptica 95. Nossos resultados mostram que a CLARITY torna a retina mais opticamente transparente após a remoção de lipídios e preserva estruturas finas de neurônios da retina e suas proteínas, que podem ser rotineiramente usadas para obter imagens de alta resolução de neurônios da retina e suas estruturas subcelulares em preparação de todo o suporte.

Introdução

A retina vertebrada é talvez a parte mais acessível do sistema nervoso central (SNC), e serve como um excelente modelo para estudar o desenvolvimento, estrutura e função do cérebro. Cinco classes de neurônios na retina são distribuídos em três camadas nucleares separadas por duas camadas plexiformes. A camada nuclear externa (ONL) consiste em fotorreceptores clássicos (hastes e cones) que convertem luz em sinais elétricos. Os sinais elétricos são processados por neurônios na camada nuclear interna (INL), incluindo células bipolares, horizontais e amacrinas, e depois transmitidos para células gânglios da retina (RGCs) na camada celular de gânglio (GCL). Os RGCs são os ....

Protocolo

O cuidado com o rato e todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde para animais de laboratório e foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Oakland (protocolo nº 18071).

NOTA: Os nomes das soluções e suas composições estão listados na Tabela 1.

1. Preparação tecidual

1. Eutanize o rato com uma overdose de CO_2,seguido de luxação cervical.
2. Enuclear os olhos com fórceps curvos e transferi-los para uma pequena placa de petri com 0,1 M PBS(Tabela....

Resultados

Retinas modificadas processadas por CLARITY são tecido opticamente transparente.
Para formular um método de limpeza tecidual compatível com aplicações imunohistoquímicas na retina, ao mesmo tempo em que fornecemos delipidação adequada e retendo a integridade estrutural das proteínas celulares, adaptamos o método de limpeza tecidual CLARITY para retinas de camundongos de montagem total. Conseguimos simplificar o protocolo e modificá-lo para retinas de montagem inteira (ver Protocolo). Após a conclusão .......

Discussão

Modificação do protocolo CLARITY para retinas de montagem inteira.
Simplificamos o protocolo CLARITY para alcançar a polimerização adequada sem a necessidade de uma câmara de evacuação ou dessecação a vácuo, como é usado na maioria dos estudos anteriores^7,9,11. O processo de polimerização é inibido pelo oxigênio, exigindo que a amostra seja isolada do ar durante a etapa de polimerização do protocolo. No entan.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
16% Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	15710	Fixador
Acrilamida	Fisher Biotech	BP170	Monômero de hidrogel
Axio Imager.Z2	Zeiss		Microscópio de fluorescência
BSA	Fisher Scientific	BP1600 Eclipse Scientific BP1600
Instrumentos de Eclipse Ti	Nikon Instruments		Varredura confocal microscópio
KCl	VWR	BDH0258	Componente tampão
KH2PO4	Sigma	P5655	Componente tampão
Na2HPO4	Sigma Aldrich	S9763	Componente tampão
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Componente tampão
NaH2PO4	Sigma Aldrich	S0751	Componente tampão
NaN3	Sigma Aldrich	S2002	Conservante bacteriostático
NDS	Aurion	900.122	Agente bloqueador
NIS Elements AR	Nikon		Software de análise de imagem
SDS	BioRad	1610301	Agente de delipidação
Sorbitol	Sigma Aldrich	51876	Componente tampão
Triton-X-100	Sigma	T8787	Surfactante
Tween-20	Fisher Scientific	BP337	Surfactante
VA-044	Wako Chemicals	011-19365	Iniciador térmico